CN105713867A - 一种短乳杆菌富硒发酵方法及应用 - Google Patents

一种短乳杆菌富硒发酵方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短乳杆菌富硒发酵方法及应用，属于生物技术领域。本发明所提供的方法为将短乳杆菌CGMCC NO.6683活化后接种至含有亚硒酸钠的种子培养基中预处理，将预处理后的种子培养基接种至含有亚硒酸钠的发酵培养基中，发酵培养后获得富硒短乳杆菌。本发明方法富硒率高，适用于富硒发酵。

Description

一种短乳杆菌富硒发酵方法及应用
技术领域
本发明涉及一种短乳杆菌富硒发酵方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，作为体内重要酶的活性中心(如谷胱甘肽过氧化物酶)，维持着人体正常生理功能。在我国富硒产业拥有巨大的市场，据统计我国有3亿人硒的摄入量不足，湖北省预计2020年富硒产业产值将达到千亿规模。
细菌对于硒元素的富集能力比较强，能对无机硒进行转化，形成硒蛋白、硒核酸、硒多糖等有机硒形式。目前研究较多有乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、阴沟肠杆菌、光合细菌等，大部分为益生菌。无机硒可以通过纳豆芽孢杆菌的转化生成有机硒，其中效果显著的是纳豆激酶溶栓，补充纳豆激酶和富硒可以在富硒发酵中同时实现，一举两得。某些光合细菌也具有一定的耐硒和富硒能力，如深红红螺菌、沼泽红假单胞菌。沼泽红假单胞菌的菌体营养非常丰富，蛋白质含量高达65％，同时维生素、辅酶等生物活性物质以及微量元素含量较高，可以用于开发微生态饲料。另有研究证明，对阴沟肠杆菌利用深层发酵技术进行富硒发酵，可以转化成一种硒多糖，且比较有效。
本发明研究了一种从开菲尔基质中筛选出的富硒优势菌株(分子生物学和生理生化反应鉴定该菌株为短乳杆菌LactobacillusbrevisCGMCCNO.6683)的富硒发酵方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种短乳杆菌富硒发酵方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种短乳杆菌富硒发酵方法，该方法是将短乳杆菌CGMCCNO.6683活化后接种至含有亚硒酸钠的种子培养基中预处理，将预处理后的种子培养基接种至含有亚硒酸钠的发酵培养基中，发酵培养后获得富硒短乳杆菌。
优选地，所述种子培养基中亚硒酸钠浓度为0.05mM-0.5mM.
更优选地，所述种子培养基中亚硒酸钠浓度为0.1mM-0.3mM。
最优选地，所述种子培养基中亚硒酸钠浓度为0.2mM。
优选地，所述预处理后的种子接种量为5％-12％。
优选地，所述种子培养基为MRS液体培养基。
更优选地，所述MRS液体培养基，初始pH值为6.0-6.5。
更优选地，所述MRS液体培养基，包含35g/L葡萄糖，15g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏。
优选地，所述发酵培养是置于25-32℃震荡发酵培养。
更优选地，所述方法，步骤如下：
1)将短乳杆菌CGMCCNO.6683进行活化，获得一级种子；
2)将步骤1)获得的一级种子接种至二级种子培养基中，在二级种子培养基中加入终浓度为0.1-0.3mM的亚硒酸钠进行预处理，培养后获得预处理种子液；
3)将步骤2)获得的预处理种子液接种至无菌液体培养基中，恒温发酵培养12h后加入亚硒酸钠使其终浓度为1-5mM，继续发酵培养。
以上所述任一方法在富硒发酵中的应用。
本发明有益效果：
本发明公开了一种短乳杆菌富硒发酵方法，本发明方法在二级种子培养基中加入了亚硒酸钠进行预处理，经试验亚硒酸钠的转化率提高35％～39％，同时在发酵12h时添加亚硒酸钠，对于富集亚硒酸钠非常有利，经试验富硒率最高可达到34.63％，本发明还提供了一适合短乳杆菌CGMCCNO.6683的培养基，该培养基下进行富硒发酵生物量可达3.7×106cfu/mL，富硒率可达40.1％。最适环境条件下，接种量12％，培养基初始pH6.5，培养温度30℃，以150r/min培养48小时，最终测定富硒率为37.85±1.37％。
附图说明
图1为0.2mM亚硒酸钠预处理后Lb.brevis在5mM亚硒酸钠体系中的发酵过程曲线；
(█5mM亚硒酸钠体系中生物量，▼5mM亚硒酸钠体系中亚硒酸钠降解率)。
图2为0.5mM亚硒酸钠预处理后Lb.brevis在5mM亚硒酸钠体系中的发酵过程曲线；
(█5mM亚硒酸钠体系中生物量，▼5mM亚硒酸钠体系中亚硒酸钠降解率)。
图3为1mM亚硒酸钠预处理后Lb.brevis在5mM亚硒酸钠体系中的发酵过程曲线；
(█5mM亚硒酸钠体系中生物量，▼5mM亚硒酸钠体系中亚硒酸钠降解率)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：
1.亚硒酸钠预处理对生物量及富硒率的影响
自MRS试管斜面挑取一环Lb.brevisCGMCCNO.6683菌体，将其接种至MRS活化一代后，接种至二级种子MRS培养基，在二级种子培养基中分别加入终浓度为0.2mM、0.5mM、1mM亚硒酸钠进行预处理，培养24小时后将预处理的种子液接种至含有5mM亚硒酸钠的发酵培养基中发酵48小时，并分别在4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h和48h取样测定富硒率和菌体生物量。
2.亚硒酸钠预处理对于转化率的影响
在革兰氏阴性菌转化亚硒酸钠的研究中，采用亚硒酸钠预处理可以提高革兰氏阴性菌对于亚硒酸钠的转化率。为了考察亚硒酸钠预处理对于Lb.brevisCGMCCNO.6683转化亚硒酸钠的影响，在Lb.brevis二级种子培养基中分别加入0.2mM、0.5mM、1mM亚硒酸钠进行预处理，培养24小时后将预处理液接种至含有5mM亚硒酸钠的发酵培养基中发酵48小时，并分别在4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h和48h取样测定亚硒酸钠转化率和Lb.brevis生物量，结果如图1-3所示。
由图1-3可知，采用0.2mM和0.5mM亚硒酸钠对Lb.brevis进行预处理后，亚硒酸钠的转化率分别提高到35％和39％，采用1mM亚硒酸钠对Lb.brevis进行预处理后，Lb.brevis对于亚硒酸钠的转化率由28％下降到25％。以上实验表明，低浓度亚硒酸钠预处理可以提高Lb.brevis对于亚硒酸钠的转化率。高浓度亚硒酸钠预处理会影响Lb.brevis对于亚硒酸钠的转化率。其原因可能在于，采用1mM亚硒酸钠预处理后，Lb.brevis生物量受到一定影响，发酵体系中接入Lb.brevis生物量降低，进而影响了其对于亚硒酸钠的转化率。
经试验在二级种子培养基中加入了亚硒酸钠进行预处理亚硒酸钠的转化率提高35％～39％，同时在发酵12h时添加亚硒酸钠，对于富集亚硒酸钠非常有利，经试验富硒率最高可达到34.63％.经试验优化的MRS液体培养基，初始pH值为6.0-6.5，包含35g/L葡萄糖，15g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏，该培养基适合短乳杆菌CGMCCNO.6683的培养基，该培养基下进行富硒发酵生物量可达3.7×106cfu/mL，富硒率可达40.1％。经试验最适环境条件下，接种量12％，培养基初始pH6.5，培养温度30℃，以150r/min培养48小时，最终测定富硒率为37.85±1.37％。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种短乳杆菌富硒发酵方法，其特征在于，将短乳杆菌CGMCCNO.6683活化后接种至含有亚硒酸钠的种子培养基中预处理，将预处理后的种子培养基接种至含有亚硒酸钠的发酵培养基中，发酵培养后获得富硒短乳杆菌。
2.根据权利要求1所述方法，所述种子培养基中亚硒酸钠浓度为0.05mM-0.5mM。
3.根据权利要求2所述方法，所述种子培养基中亚硒酸钠浓度为0.1mM-0.3mM。
4.根据权利要求3所述方法，所述种子培养基中亚硒酸钠浓度为0.2mM。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述预处理后的种子接种量为5％-12％。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述种子培养基为MRS液体培养基。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述MRS液体培养基，初始pH值为6.0-6.5，包含35g/L葡萄糖，15g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述发酵培养是置于25-32℃震荡发酵培养。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)将短乳杆菌CGMCCNO.6683进行活化，获得一级种子；
2)将步骤1)获得的一级种子接种至二级种子培养基中，在二级种子培养基中加入终浓度为0.1-0.3mM的亚硒酸钠进行预处理，培养后获得预处理种子液；
3)将步骤2)获得的预处理种子液接种至无菌液体培养基中，恒温发酵培养12h后加入亚硒酸钠使其终浓度为1-5mM，继续发酵培养。
10.权利要求1-9所述任一方法在富硒发酵中的应用。
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