CN105671132A - 一种评估基因对人体高密度脂蛋白影响的检测试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了人体高密度脂蛋白基因检测试剂盒，该试剂盒包括盒体及盒体内单独存放的试剂，试剂包括：（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（2）PCR扩增试剂（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应可在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到其体内高密度脂蛋白的遗传因素，从而为受测者获得一个合适的健康方案，评估相应健康风险，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测，具体涉及人体高密度脂蛋白基因检测试剂盒。
背景技术
高密度脂蛋白为血清蛋白之一。缩写为HDL。亦称为a1脂蛋白。比较富含磷脂质，在血清中的含量约为300mg/dl。由于可输出胆固醇促进胆固醇的代谢，所以现在作为动脉硬化预防因子而受到重视。高密度脂蛋白运载周围组织中的胆固醇，再转化为胆汁酸或直接通过胆汁从肠道排出，动脉造影证明高密度脂蛋白胆固醇含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关。所以高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子，俗称“血管清道夫”。
当血液中HDL含量高时，血脂及血垢的清运速度大于沉积速度，不但不会有新的血脂沉积，连早已沉积的脂质斑块也会被逐渐清除，血管越来越干净，血流畅通无阻，大量的HDL进入血管内膜及内皮细胞，修复内膜破损，恢复血管弹性，心脑血管病变几率就比较低；当HDL含量低时，血脂及血垢的清运速度小于沉积速度，血脂增高，沉积加快，硬化逐渐加重，病变必然发生。
世界卫生组织研究证实，每100毫升血液中的HDL升高1毫克，可使由动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病的发病率和死亡率降低3-4%，世界卫生组织（WHO）专家组宣称：对于心脑血管病，广为接受而又最少争议最重要的保护因素是体内高密度脂蛋白（HDL）含量越高越好！
人体内HDL水平的高低除了与日常的生活习惯有关以外，和自身的基因也密切相关。由于HDL本身就是一种基因编码的产物蛋白质，体内基因间的相互调节和表达程度的不同也在根本上决定了HDL水平的高低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高密度脂蛋白基因检测试剂盒，该试剂盒对受测者的相关基因进行检测，分析得到其体内HDL表达水平的遗传因素，且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的高效性、特异性。
一种高密度脂蛋白基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs2271293的引物组：
5’-CAGGGTCAATGGGGTAA-3’
5’-CACTATCAACATCTTC-3’
5’-TGAGCCACCGTGCCTG-3’
5’-GCGTCAATCTGAAAAAGG-3’
针对SNPrs17145738的引物组：
5’-GACCCTTCACACATTTAC-3’
5’-GTCAGATGGGCACCA-3’
5’-TGAAGCAATTTCTGC-3’
5’-GAACTCCTGACCTCAAA-3’
针对SNPrs3764261的引物组：
5’-GGTAGGCATCTGGG-3’
5’-TGAGATAGCAGACAAA-3’
5’-TATGTCCCTTAGAGGAATG-3’
5’-GGTGCAGGTTATCCCG-3’
针对SNPrs964184的引物组：
5’-GATGTACTGTTTTCCTC-3’
5’-ATGACAATAAACAGATC-3’
5’-TCAGCTTTGCCCAAATG-3’
5’-AGCACTGGCCTCTGTA-3’
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
本发明提供的高密度脂蛋白基因检测试剂盒的有益效果是：通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到其高密度脂蛋白的遗传因素，评估相关的风险因素，从而为受测者获得一个合适的健康方案，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
附图说明
图1是反应产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
高密度脂蛋白基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs2271293的引物组：
5’-CAGGGTCAATGGGGTAA-3’
5’-CACTATCAACATCTTC-3’
5’-TGAGCCACCGTGCCTG-3’
5’-GCGTCAATCTGAAAAAGG-3’
针对SNPrs17145738的引物组：
5’-GACCCTTCACACATTTAC-3’
5’-GTCAGATGGGCACCA-3’
5’-TGAAGCAATTTCTGC-3’
5’-GAACTCCTGACCTCAAA-3’
针对SNPrs3764261的引物组：
5’-GGTAGGCATCTGGG-3’
5’-TGAGATAGCAGACAAA-3’
5’-TATGTCCCTTAGAGGAATG-3’
5’-GGTGCAGGTTATCCCG-3’
针对SNPrs964184的引物组：
5’-GATGTACTGTTTTCCTC-3’
5’-ATGACAATAAACAGATC-3’
5’-TCAGCTTTGCCCAAATG-3’
5’-AGCACTGGCCTCTGTA-3’
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本实施例对测试者采用高密度脂蛋白基因检测试剂盒同时检测4个基因的SNP多态位点，并根据基因分型结果，分析得到其高密度脂蛋白的遗传因素，评估相关的风险因素，从而为受测者获得一个合适的健康方案，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
使用到的高密度脂蛋白基因检测试剂盒内试剂由以下组成：
（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs2271293的引物组：
5’-CAGGGTCAATGGGGTAA-3’
5’-CACTATCAACATCTTC-3’
5’-TGAGCCACCGTGCCTG-3’
5’-GCGTCAATCTGAAAAAGG-3’
针对SNPrs17145738的引物组：
5’-GACCCTTCACACATTTAC-3’
5’-GTCAGATGGGCACCA-3’
5’-TGAAGCAATTTCTGC-3’
5’-GAACTCCTGACCTCAAA-3’
针对SNPrs3764261的引物组：
5’-GGTAGGCATCTGGG-3’
5’-TGAGATAGCAGACAAA-3’
5’-TATGTCCCTTAGAGGAATG-3’
5’-GGTGCAGGTTATCCCG-3’
针对SNPrs964184的引物组：
5’-GATGTACTGTTTTCCTC-3’
5’-ATGACAATAAACAGATC-3’
5’-TCAGCTTTGCCCAAATG-3’
5’-AGCACTGGCCTCTGTA-3’
（2）PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液，该PCR缓冲液为100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2；dNTPs混合物，该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四种核苷酸，各组分浓度为2.5mM；5U/μl热启动Taq酶。
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldview染色液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1X后使用。
使用上述高密度脂蛋白基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：
（1）提取样本基因组DNA。
采集该测试者唾液，向1-2ml唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，该DNA提取缓冲溶液溶剂为50mM的Tris-HClpH7.4、0.5mM的EDTA和50mM的NaCl，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液，该裂解液溶剂为50mMTris-HClpH7.4，50mMTris-HClpH7.4，150mMNaCl，1mMEDTA，1％Tritonx-100，1％Sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；得到的混合液中，加入浓度为10mg/mLRNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿体积比为1∶1，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25∶24∶1，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的3mol/L醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清液；得到的沉淀物中加入0.5mL70％乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清液，此步骤重复一次；得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存。
（2）PCR扩增
本实施例同时检测rs2271293、rs17145738、rs3764261和rs964184。每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要16条引物。每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组，共做9管PCR，所述阴性对照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。
根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.5μl10×PCR缓冲液，2μldNTPs，0.5μl引物组，热启动Taq酶0.15μl，基因组模板80mg，添加超纯水至总体积为25μl。
将装有反应溶液的Eppendorf试管放入ABI9700PCR仪中，设置反应条件如下：预变性95℃3min；热循环94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；延伸72℃3min。反应结束后，取出试管。
由于9管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效性、特异性，要求16条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基因SNP多态性的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
（3）琼脂糖凝胶电泳检测
将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：3g琼脂糖，加入100mL去离子水，微波炉加热1min，冷却到60℃时加入5μLGoldview染色液，制成3%的琼脂糖凝胶。PCR产物10μL与6×TBE缓冲液0.8μL混合上样，电压100V电泳15min。紫外灯下读取结果并拍照，所得琼脂糖电泳检测图如图1所示。
检测得到4个基因分型分析结果如下：
| SNP | 分型结果 | 影响因子 |
| rs2271293 | AA | 1.27 |
| rs17145738 | TC | 0.57 |
| rs3764261 | AA | 3.39 |
| rs964184 | CG | -1.5 |
根据以上分型结果计算4个基因对该测试者HDL的贡献总值（Y）：
Y=2*1.27+0.57+2*3.39-1.5=8.39mg/dL
计算公式的含义是rs2271293的每个A代表1.27mg/dL，rs17145738的每个T代表增加0.57mg/dL，rs3764261的每个A代表增加3.39mg/dL，rs964184代表每个G减少1.5mg/dL。根据分型结果带入公式求和既得4个基因对HDL的总贡献值。因此，该测试者较人群均值的HDL增加8.39mg/dL，这表示其内在体质状况应该较佳。如果临床检测的HDL值较低，可能该人存在某种潜在的健康风险未被发现，需要极早排查。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
核苷酸序列表
<110>武汉白原科技有限公司
<120>一种评估基因对人体高密度脂蛋白影响的检测试剂盒和方法
<130>1
<160>16
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cagggtcaatggggtaa17
<210>2
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<212>DNA
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<400>2
cactatcaacatcttc16
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tgagccaccgtgcctg16
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gcgtcaatctgaaaaagg18
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gacccttcacacatttac18
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<211>15
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gtcagatgggcacca15
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tgaagcaatttctgc15
<210>8
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<400>16
agcactggcctctgta16
Claims (9)
1.高密度脂蛋白基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征在于：存放的试剂包括：
（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs2271293的引物组：
5’-CAGGGTCAATGGGGTAA-3’
5’-CACTATCAACATCTTC-3’
5’-TGAGCCACCGTGCCTG-3’
5’-GCGTCAATCTGAAAAAGG-3’
针对SNPrs17145738的引物组：
5’-GACCCTTCACACATTTAC-3’
5’-GTCAGATGGGCACCA-3’
5’-TGAAGCAATTTCTGC-3’
5’-GAACTCCTGACCTCAAA-3’
针对SNPrs3764261的引物组：
5’-GGTAGGCATCTGGG-3’
5’-TGAGATAGCAGACAAA-3’
5’-TATGTCCCTTAGAGGAATG-3’
5’-GGTGCAGGTTATCCCG-3’
针对SNPrs964184的引物组：
5’-GATGTACTGTTTTCCTC-3’
5’-ATGACAATAAACAGATC-3’
5’-TCAGCTTTGCCCAAATG-3’
5’-AGCACTGGCCTCTGTA-3’
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
2.根据权利要求1所述的高密度脂蛋白基因检测试剂盒，其特征在于：所述引物用量均为0.5-1.0μl。
3.根据权利要求1所述的高密度脂蛋白基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括：10×PCR缓冲液，dNTPs，热启动Taq酶，基因组模板。
4.根据权利要求3所述的高密度脂蛋白基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包含：100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2。
5.根据权利要求3所述的高密度脂蛋白基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂用量为：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，热启动Taq酶0.1-0.2μl，基因组模板50-100ng。
6.根据权利要求1所述的高密度脂蛋白基因检测试剂盒，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳分析试剂包括：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。
7.根据权利要求6所述的高密度脂蛋白基因检测试剂盒，其特征在于：所述DNA无毒染料优选BiotiumGelred无毒染料。
8.根据权利要求1所述的HDL基因检测试剂盒，其特征在于：高密度脂蛋白基因对体重的总贡献值为各基因对体重贡献值之和。
9.其单位是mg/dL，根据权利要求8所述的计算方法，其特征在于：各基因对体重的贡献值为α×β，α为系数，β为基因的影响因子，α系数是各个基因分型结果当中不同差异碱基个数，β为单个差异碱基的影响因子单位是mg/dL。
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2014
- 2014-11-17 CN CN201410651952.XA patent/CN105671132A/zh active Pending
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