CN105671104A - 一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法 - Google Patents

一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法，属于右旋糖酐领域。本发明先得发酵培养基，将棘孢青霉菌和醋杆菌接在培养基上发酵培养得菌体，再超声破碎后得菌液，将菌液和卡拉胶混合滴加到氯化钙溶液中，制得右旋糖酐酶固定化细胞微球，将微球转接至底物溶液中摇床反应，反应后用乙醇沉淀，捏洗干燥后即可本发明将棘孢青霉菌和醋杆菌发酵得菌体，里，面含有右旋糖酐酶，并利用卡拉胶进行固化，固定化率高而且提高右旋糖酐酶的活性和稳定性，用其降解右旋糖酐，可使其分子量降低，副产物少，提高右旋糖酐的质量。

Description

一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法
技术领域
本发明公开了一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法，属于右旋糖酐领域。
背景技术
右旋糖酐，又名葡聚糖，是一种由葡萄糖单元脱水形成的高分子聚合物，它的结构具有多样性，通常被定义为一种完全由α-D-吡喃葡萄糖单体构成的多糖。右旋糖酐是某些细菌产生的一种胞外多糖，是由分泌性酶催化生成的胞外产物，作为最早发现的微生物多糖，右旋糖酐是美国FDA(食品和药物管理局)批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖，也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖。右旋糖酐因其安全、无毒、生物相容性好等优点，被广泛应用于医药、食品、色谱分析等多个领域。
右旋糖酐的生产包括有如下两种方法：微生物直接发酵法和酶合成法，而工业生产上主要以直接发酵法为主。但直接发酵法生产葡聚糖时，产物分子大小难以控制，发酵后菌体与产品很难分离，生产中引入的氮、氯等杂质，致使右旋糖酐质量低，临床副反应多。而利用诱导分离出的葡聚糖合成酶来制备右旋糖酐可以克服这些不足，因此，从特有的微生物中通过分子生物学技术构建和筛选的右旋糖酐合成酶的全新酶源是目前研究重点之一。
发明内容
本发明主要解决的技术问题：针对目前右旋糖酐分子量的调控方法包括有化学法、物理法和生物法，其中化学法是传统所使用的方法，主要是通过盐酸把大分子量的右旋糖酐降解成小分子量的右旋糖酐，该法由于反应条件剧烈，不易控制，反应后部分右旋糖酐被降解成了单糖，因而导致收率很低的问题，提供了一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法，本发明先得发酵培养基，将棘孢青霉菌和醋杆菌接在培养基上发酵培养得菌体，再超声破碎后得菌液，将菌液和卡拉胶混合滴加到氯化钙溶液中，制得右旋糖酐酶固定化细胞微球，将微球转接至底物溶液中摇床反应，反应后用乙醇沉淀，捏洗干燥后即可本发明将棘孢青霉菌和醋杆菌发酵得菌体，里，面含有右旋糖酐酶，并利用卡拉胶进行固化，固定化率高而且提高右旋糖酐酶的活性和稳定性，用其降解右旋糖酐，可使其分子量降低，副产物少，提高右旋糖酐的质量。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）按重量份数计，分别选取30～40份葡萄糖，10～15份蛋白胨，5～8份磷酸氢二钠，2～4份磷酸二氢钾，0.5～1.2份氯化钾，3～5份酵母浸膏和30～50份去离子水，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，在105～110℃和0.1MPa下灭菌处理10～15min得发酵培养基；
（2）向上述发酵培养基中加入培养基体积8～12%棘孢青霉菌种子液和培养基体积10～15%醋杆菌种子液，放入37℃恒温摇床培养中，在200～220r/min下培养15～20h，将培养后的发酵液在4℃和5000～7000r/min转速下离心分离12～15min，收集沉淀物，将沉淀物按固液比1:2加入去离子水，得菌体悬浮液；
（3）将上述菌体悬浮液按体积比1:1加入pH6.8浓度0.05mol/LHAC-NaAC缓冲液，混合后在0℃和250～300W下超声破碎15～20min，每破碎2s，间隔2s，超声破碎后再在4℃和10000～12000r/min条件下离心分离15～20min，去除沉淀物，得上清液即菌液；
（4）取50～80mL质量分数3～5%卡拉胶溶液，将卡拉胶溶液和菌液按体积比1:1混合，将混合液缓慢滴加到质量分数5～8%的氯化钙溶液中，控制在50～60min滴完，滴加同时在250～350r/min转速下搅拌，滴加后再搅拌固定25～35min，固定后加入总体积5～8%戊二醛进行交联1～2h，形成卡拉胶钙珠，将卡拉胶钙珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸盐缓冲液中静置过夜，过滤，将过滤物用蒸馏水洗涤2～3次，即可得到右旋糖酐酶固定化细胞微球；
（5）将上述右旋糖酐酶固定化细胞微球按体积5～10%转接量接至底物溶液中，在27℃和100～150r/min恒温摇床中反应18～20h，反应结束后用质量分数80%乙醇按体积比3:1混合进行沉淀，将沉淀物放入质量分数90%乙醇中捏洗2～3次，捏洗后的过滤物放入烘箱中在70～80℃下干燥5～6h即可。
所述的底物溶液是每升水中含100～120g蔗糖，1.7～2.2g蛋白胨，1.8～2.2g磷酸氢二钠，0.02～0.05g氯化钙和0.003～0.006g硫酸镁配比组成。
本发明制备得到的右旋糖酐酶固定化细胞微球在15～65℃进行测试热稳定性，右旋糖酐酶的相对活性从35～40%升高到100%，随着温度的升高又降低至25～30%，在42℃时达到最高，对右旋糖酐转化率高达92%以上，重均分子量平均为3000～7000Da。
本发明的有益效果是：
（1）本发明将棘孢青霉菌和醋杆菌发酵得菌体，里面含有右旋糖酐酶，并利用卡拉胶进行固化，固定化率高而且提高右旋糖酐酶的活性和稳定性；
（2）用本发明制备得到右旋糖酐酶固定化细胞微球降解右旋糖酐，可使其分子量降低，副产物少，提高右旋糖酐的质量；
（3）本发明的方法不仅绿色、环保、低成本、简便，而且右旋糖酐转化率高。
具体实施方式
首先按重量份数计，分别选取30～40份葡萄糖，10～15份蛋白胨，5～8份磷酸氢二钠，2～4份磷酸二氢钾，0.5～1.2份氯化钾，3～5份酵母浸膏和30～50份去离子水，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，在105～110℃和0.1MPa下灭菌处理10～15min得发酵培养基；向发酵培养基中加入培养基体积8～12%棘孢青霉菌种子液和培养基体积10～15%醋杆菌种子液，放入37℃恒温摇床培养中，在200～220r/min下培养15～20h，将培养后的发酵液在4℃和5000～7000r/min转速下离心分离12～15min，收集沉淀物，将沉淀物按固液比1:2加入去离子水，得菌体悬浮液；将菌体悬浮液按体积比1:1加入pH6.8浓度0.05mol/LHAC-NaAC缓冲液，混合后在0℃和250～300W下超声破碎15～20min，每破碎2s，间隔2s，超声破碎后再在4℃和10000～12000r/min条件下离心分离15～20min，去除沉淀物，得上清液即菌液；取50～80mL质量分数3～5%卡拉胶溶液，将卡拉胶溶液和菌液按体积比1:1混合，将混合液缓慢滴加到质量分数5～8%的氯化钙溶液中，控制在50～60min滴完，滴加同时在250～350r/min转速下搅拌，滴加后再搅拌固定25～35min，固定后加入总体积5～8%戊二醛进行交联1～2h，形成卡拉胶钙珠，将卡拉胶钙珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸盐缓冲液中静置过夜，过滤，将过滤物用蒸馏水洗涤2～3次，即可得到右旋糖酐酶固定化细胞微球；将右旋糖酐酶固定化细胞微球按体积5～10%转接量接至底物溶液中，在27℃和100～150r/min恒温摇床中反应18～20h，反应结束后用质量分数80%乙醇按体积比3:1混合进行沉淀，将沉淀物放入质量分数90%乙醇中捏洗2～3次，捏洗后的过滤物放入烘箱中在70～80℃下干燥5～6h即可。
所述的底物溶液是每升水中含100～120g蔗糖，1.7～2.2g蛋白胨，1.8～2.2g磷酸氢二钠，0.02～0.05g氯化钙和0.003～0.006g硫酸镁配比组成。
实例1
首先按重量份数计，分别选取40份葡萄糖，15份蛋白胨，8份磷酸氢二钠，2份磷酸二氢钾，1.2份氯化钾，3.8份酵母浸膏和30份去离子水，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，在105℃和0.1MPa下灭菌处理10min得发酵培养基；向发酵培养基中加入培养基体积8%棘孢青霉菌种子液和培养基体积10%醋杆菌种子液，放入37℃恒温摇床培养中，在200r/min下培养15h，将培养后的发酵液在4℃和5000r/min转速下离心分离12min，收集沉淀物，将沉淀物按固液比1:2加入去离子水，得菌体悬浮液；将菌体悬浮液按体积比1:1加入pH6.8浓度0.05mol/LHAC-NaAC缓冲液，混合后在0℃和250W下超声破碎15min，每破碎2s，间隔2s，超声破碎后再在4℃和10000r/min条件下离心分离15min，去除沉淀物，得上清液即菌液；取50mL质量分数3%卡拉胶溶液，将卡拉胶溶液和菌液按体积比1:1混合，将混合液缓慢滴加到质量分数5%的氯化钙溶液中，控制在50min滴完，滴加同时在250r/min转速下搅拌，滴加后再搅拌固定25min，固定后加入总体积5%戊二醛进行交联1h，形成卡拉胶钙珠，将卡拉胶钙珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸盐缓冲液中静置过夜，过滤，将过滤物用蒸馏水洗涤2次，即可得到右旋糖酐酶固定化细胞微球；将右旋糖酐酶固定化细胞微球按体积5%转接量接至底物溶液中，在27℃和100r/min恒温摇床中反应18h，反应结束后用质量分数80%乙醇按体积比3:1混合进行沉淀，将沉淀物放入质量分数90%乙醇中捏洗2次，捏洗后的过滤物放入烘箱中在70℃下干燥5h即可。
所述的底物溶液是每升水中含100g蔗糖，1.7g蛋白胨，1.8g磷酸氢二钠，0.02g氯化钙和0.003g硫酸镁配比组成。
本发明制备得到的右旋糖酐酶固定化细胞微球在15℃进行测试热稳定性，右旋糖酐酶的相对活性为35%，，对右旋糖酐转化率高达94%，重均分子量平均为58962Da。
实例2
首先按重量份数计，分别选取35份葡萄糖，10份蛋白胨，6份磷酸氢二钠，3份磷酸二氢钾，1份氯化钾，5份酵母浸膏和40份去离子水，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，在108℃和0.1MPa下灭菌处理13min得发酵培养基；向发酵培养基中加入培养基体积10%棘孢青霉菌种子液和培养基体积13%醋杆菌种子液，放入37℃恒温摇床培养中，在210r/min下培养17h，将培养后的发酵液在4℃和6000r/min转速下离心分离14min，收集沉淀物，将沉淀物按固液比1:2加入去离子水，得菌体悬浮液；将菌体悬浮液按体积比1:1加入pH6.8浓度0.05mol/LHAC-NaAC缓冲液，混合后在0℃和275W下超声破碎17min，每破碎2s，间隔2s，超声破碎后再在4℃和11000r/min条件下离心分离17min，去除沉淀物，得上清液即菌液；取65mL质量分数4%卡拉胶溶液，将卡拉胶溶液和菌液按体积比1:1混合，将混合液缓慢滴加到质量分数7%的氯化钙溶液中，控制在55min滴完，滴加同时在300r/min转速下搅拌，滴加后再搅拌固定30min，固定后加入总体积6%戊二醛进行交联1.5h，形成卡拉胶钙珠，将卡拉胶钙珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸盐缓冲液中静置过夜，过滤，将过滤物用蒸馏水洗涤2次，即可得到右旋糖酐酶固定化细胞微球；将右旋糖酐酶固定化细胞微球按体积8%转接量接至底物溶液中，在27℃和125r/min恒温摇床中反应19h，反应结束后用质量分数80%乙醇按体积比3:1混合进行沉淀，将沉淀物放入质量分数90%乙醇中捏洗2次，捏洗后的过滤物放入烘箱中在75℃下干燥5.5h即可。
所述的底物溶液是每升水中含110g蔗糖，2.0g蛋白胨，2.0g磷酸氢二钠，0.04g氯化钙和0.004g硫酸镁配比组成。
本发明制备得到的右旋糖酐酶固定化细胞微球在42℃进行测试热稳定性，右旋糖酐酶的相对活性为100%，对右旋糖酐转化率高达96%，重均分子量平均为38924Da。
实例3
首先按重量份数计，分别选取30份葡萄糖，11份蛋白胨，5份磷酸氢二钠，4份磷酸二氢钾，0.8份氯化钾，4.2份酵母浸膏和45份去离子水，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，在110℃和0.1MPa下灭菌处理15min得发酵培养基；向发酵培养基中加入培养基体积12%棘孢青霉菌种子液和培养基体积15%醋杆菌种子液，放入37℃恒温摇床培养中，在220r/min下培养20h，将培养后的发酵液在4℃和7000r/min转速下离心分离15min，收集沉淀物，将沉淀物按固液比1:2加入去离子水，得菌体悬浮液；将菌体悬浮液按体积比1:1加入pH6.8浓度0.05mol/LHAC-NaAC缓冲液，混合后在0℃和300W下超声破碎20min，每破碎2s，间隔2s，超声破碎后再在4℃和12000r/min条件下离心分离20min，去除沉淀物，得上清液即菌液；取80mL质量分数5%卡拉胶溶液，将卡拉胶溶液和菌液按体积比1:1混合，将混合液缓慢滴加到质量分数8%的氯化钙溶液中，控制在60min滴完，滴加同时在350r/min转速下搅拌，滴加后再搅拌固定35min，固定后加入总体积8%戊二醛进行交联2h，形成卡拉胶钙珠，将卡拉胶钙珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸盐缓冲液中静置过夜，过滤，将过滤物用蒸馏水洗涤3次，即可得到右旋糖酐酶固定化细胞微球；将右旋糖酐酶固定化细胞微球按体积10%转接量接至底物溶液中，在27℃和150r/min恒温摇床中反应20h，反应结束后用质量分数80%乙醇按体积比3:1混合进行沉淀，将沉淀物放入质量分数90%乙醇中捏洗3次，捏洗后的过滤物放入烘箱中在80℃下干燥6h即可。
所述的底物溶液是每升水中含120g蔗糖，2.2g蛋白胨，2.2g磷酸氢二钠，0.05g氯化钙和0.006g硫酸镁配比组成。
本发明制备得到的右旋糖酐酶固定化细胞微球在65℃进行测试热稳定性，右旋糖酐酶的相对活性为30%，对右旋糖酐转化率高达97%以上，重均分子量平均为68624Da。

Claims (2)

1.一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）按重量份数计，分别选取30～40份葡萄糖，10～15份蛋白胨，5～8份磷酸氢二钠，2～4份磷酸二氢钾，0.5～1.2份氯化钾，3～5份酵母浸膏和30～50份去离子水，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，在105～110℃和0.1MPa下灭菌处理10～15min得发酵培养基；
（2）向上述发酵培养基中加入培养基体积8～12%棘孢青霉菌种子液和培养基体积10～15%醋杆菌种子液，放入37℃恒温摇床培养中，在200～220r/min下培养15～20h，将培养后的发酵液在4℃和5000～7000r/min转速下离心分离12～15min，收集沉淀物，将沉淀物按固液比1:2加入去离子水，得菌体悬浮液；
（3）将上述菌体悬浮液按体积比1:1加入pH6.8浓度0.05mol/LHAC-NaAC缓冲液，混合后在0℃和250～300W下超声破碎15～20min，每破碎2s，间隔2s，超声破碎后再在4℃和10000～12000r/min条件下离心分离15～20min，去除沉淀物，得上清液即菌液；
（4）取50～80mL质量分数3～5%卡拉胶溶液，将卡拉胶溶液和菌液按体积比1:1混合，将混合液缓慢滴加到质量分数5～8%的氯化钙溶液中，控制在50～60min滴完，滴加同时在250～350r/min转速下搅拌，滴加后再搅拌固定25～35min，固定后加入总体积5～8%戊二醛进行交联1～2h，形成卡拉胶钙珠，将卡拉胶钙珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸盐缓冲液中静置过夜，过滤，将过滤物用蒸馏水洗涤2～3次，即可得到右旋糖酐酶固定化细胞微球；
（5）将上述右旋糖酐酶固定化细胞微球按体积5～10%转接量接至底物溶液中，在27℃和100～150r/min恒温摇床中反应18～20h，反应结束后用质量分数80%乙醇按体积比3:1混合进行沉淀，将沉淀物放入质量分数90%乙醇中捏洗2～3次，捏洗后的过滤物放入烘箱中在70～80℃下干燥5～6h即可。
2.根据权利要求1所述的一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法，其特征在于：所述的底物溶液是每升水中含100～120g蔗糖，1.7～2.2g蛋白胨，1.8～2.2g磷酸氢二钠，0.02～0.05g氯化钙和0.003～0.006g硫酸镁配比组成。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109456955A (zh) * 2018-08-28 2019-03-12 安徽医学高等专科学校 一种固定化右旋糖酐酶的制备方法
CN112111479A (zh) * 2020-09-30 2020-12-22 江苏海洋大学 一种右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料及其制备方法和用途

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