CN105669559B

CN105669559B - 蒎烷基吡唑类化合物及其合成方法与应用

Info

Publication number: CN105669559B
Application number: CN201610018362.2A
Authority: CN
Inventors: 王石发; 张齐; 徐徐; 杨益琴; 徐海军; 杨金来; 孙楠; 丁志斌; 张燕; 匡洪波; 谷文
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2036-01-12
Also published as: CN105669559A

Abstract

本发明公开了蒎烷基吡唑类化合物及其合成方法与应用。合成方法为：在碱催化作用下，诺蒎酮与芳香醛进行羟醛缩合反应，得到3‑苯亚甲基诺蒎酮；3‑芳亚甲基诺蒎酮再与水合肼进行缩合、环化和脱氢芳构化反应，得到蒎烷基吡唑类化合物；以DMF为溶剂，在碱催化作用下，蒎烷基吡唑类化合物与2‑氯乙酰胺进行N‑烷基化，制得蒎烷基吡唑酰胺化合物。所合成的化合物具有较好的杀虫活性和抗菌活性，具有广泛的应用前景。

Description

蒎烷基吡唑类化合物及其合成方法与应用

技术领域

本发明属有机合成和药物合成技术领域，涉及蒎烷基吡唑类化合物及其合成方法与应用。

背景技术

吡唑环是一类非常重要的含氮杂环化合物。自从发现了具有止痛、抗炎、退热作用的安替吡啉(Antipyrine)和可抑制植物生长的2-吡唑-5-酮，吡唑类化合物便引起了药物学家和有机化学家的广泛关注，并在医药、农药等领域发挥重要的作用。

吡唑类农药包括除草剂、杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂和植物生长调节剂等。1947年，瑞士汽巴-嘉吉公司研制的氨基甲酸吡唑酯类杀虫剂吡虫威，成为最早的吡唑类杀虫剂，随后相继推出了异索威和敌蝇威。1992年，由法国罗纳-普朗克公司研发的吡唑型类杀虫剂锐劲特被批准在我国的水稻、蔬菜中开展大田杀虫药效试验，试验发现该杀虫剂可有效地消杀多种害虫，且对某些已对杀虫剂产生耐药性的害虫也有优良的防治效果，在农作物及植物保护方面起着重要的作用。

吡唑类化合物在医药领域的研究和开发也一直受到人们的广泛关注，具有良好生物活性的吡唑类化合物更是屡见不鲜。由美国Searle制药厂研发的塞来西布是全球第一个环氧化酶-2-(COX-2)抑制剂，通过特异性地抑制COX-2酶活性来阻止炎性前列腺素类物质的合成和聚积，可达到抗炎、镇痛及退热作用，可有效地治疗风湿性、类风湿性关节炎及骨关节炎。塞来西布在缓解疼痛的同时，可以避免以往的非甾体抗炎药带来的严重的胃肠道副作用。Dvorak等用1,3-二羰基化合物与肼类化合物发生环化缩合反应时，由于肼类物质在进攻两个羰基C＝O时无先后顺序之分，所以可生成不同异构体的混合物，得到1,3,4,5-位取代基不同的吡唑类衍生物的同分异构体。NakhaiA等用简单的α,β-不饱和酮与水合肼回流反应数小时后，合成出吡唑啉类衍生物，不进行分离就再直接氧化得到1-位无取代的吡唑类化合物。JohnRegan等通过β-羰基氰化合物为底物，先与苯肼发生关环反应得到5-氨基吡唑化合物，再与异氰酸酯加成得到5-氨基芳环脲吡唑衍生物。β-蒎烯是脂松节油的主要成分之一，其氧化衍生物诺蒎酮是合成许多生物活性的重要中间体。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供蒎烷基吡唑类化合物以及蒎烷基吡唑酰胺衍生物，使其能够满足杀菌抑菌活性需求。本发明的另一目的在于提供上述化合物的合成方法。本发明还有一目的是提供上述化合物的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

蒎烷基吡唑类化合物为6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑，结构式为：

所述的的蒎烷基吡唑类化合物的合成方法，包括以下步骤：

1)诺蒎酮与苯甲醛进行羟醛缩合，得到3-苯亚甲基诺蒎酮；

2)3-苯亚甲基诺蒎酮与水合肼进行缩合环化，得到吡唑啉中间体，吡唑啉中间体经二氯二氰基苯醌(DDQ)氧化芳构化，得到6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑。

所述的6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑的合成方法，具体包括以下步骤：

1)将0.1mol诺蒎酮、0.1～0.2mol苯甲醛、0.1～1.0molNaOH和150～300mL蒸馏水依次加入配有搅拌器、温度计和回流冷凝器的三口烧瓶中，在氮气保护下在0～100℃范围内进行反应；

2)反应物用0.5～1.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用蒸馏水洗涤至中性，然后再用饱和食盐水洗涤1次，有机相用无水硫酸钠干燥去水份；过滤去除干燥剂后浓缩回收溶剂，得到3-苯亚甲基诺蒎酮粗产物；

3)3-苯亚甲基诺蒎酮粗产物在丙酮-乙醇溶剂中进行重结晶，得到精制3-苯亚甲基诺蒎酮；

4)将0.015mol 3-苯亚甲基诺蒎酮、0.075～0.09mol水合肼和80～160mL乙醇依次加入配有搅拌器和回流冷凝器的单口烧瓶中，回流反应12h，用GC跟踪检测，直到3-苯亚甲基诺蒎酮转化率达到95％后停止反应；

5)加入10～20mL乙腈，在80～120℃旋干，除去乙醇和过量的水合肼，得到粘稠状物质；依次加入90mL干燥的1,4-二氧六环、3.75g DDQ，搅拌并加热，回流反应8h；

6)反应液冷却至室温，加入45mL浓度为20％KOH水溶液、90mL二氯甲烷，室温搅拌0.5h后，再用二氯甲烷萃取，合并的有机相用去离子水洗涤至中性；经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后得到油状初产物，采用硅胶色谱柱纯化，得到6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑。

所述的蒎烷基吡唑类化合物的酰胺衍生物，为2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺，结构式为：

所述的蒎烷基吡唑类化合物酰胺衍生物的合成方法，包括以下步骤：

1)诺蒎酮与对氟苯甲醛进行羟醛缩合，得到3-对氟苯亚甲基诺蒎酮；

2)3-对氟苯亚甲基诺蒎酮与水合肼进行缩合环化，得到吡唑啉中间体，吡唑啉中间体经二氯二氰基苯醌(DDQ)氧化芳构化，得到6,6-二甲基-3-对氟苯基-45,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑。

3)在碱性条件下，6,6-二甲基-3-对氟苯基-45,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑与2-氯乙酰胺进行烷基化，得到蒎烷基吡唑酰胺衍生物2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺。

所述的蒎烷基吡唑酰胺衍生物的合成方法，具体过程如下：

1)将0.1mol诺蒎酮、0.1～0.2mol对氟苯甲醛、0.1～1.0molNaOH和150～300mL蒸馏水依次加入配有搅拌器、温度计和回流冷凝器的三口烧瓶中，在氮气保护下在0～100℃范围内进行反应；

2)反应物用0.5～1.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用蒸馏水洗涤至中性，然后再用饱和食盐水洗涤1次，有机相用无水硫酸钠干燥去水份；过滤去除干燥剂后浓缩回收溶剂，得到3-对氟苯亚甲基诺蒎酮粗产物；

3)3-对氟苯亚甲基诺蒎酮粗产物在丙酮-乙醇溶剂中进行重结晶，得到精制3-对氟苯亚甲基诺蒎酮；

4)将0.015mol 3-对氟苯亚甲基诺蒎酮、0.075～0.09mol水合肼和80～160mL乙醇依次加入配有搅拌器和回流冷凝器的单口烧瓶中，回流反应12h，用GC跟踪检测，直到3-对氟苯亚甲基诺蒎酮转化率达到95％后停止反应；

6)反应液冷却至室温，加入45mL浓度为20％KOH水溶液、90mL二氯甲烷，室温搅拌0.5h后，再用二氯甲烷萃取，合并的有机相用去离子水洗涤至中性；经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后得到油状初产物，采用硅胶色谱柱纯化，得到6,6-二甲基-3-对氟苯基-45,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑；

7)25mL DMF、6,6-二甲基-3-对氟苯基-45,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑2.56g，1mol/L乙醇钠醇溶液10mL，0.014mol的2-氯乙酰胺DMF溶液10mL，依次加入配有搅拌器、温度计和回流冷凝器的三口烧瓶中，回流反应24～48h；

8)反应液经过滤、旋蒸除去DMF后，加入乙酸乙酯，用蒸馏水和饱和食盐水洗至中性，用无水硫酸钠干燥，过滤后回收溶剂，粗产物经重结晶，得到2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺。

所述的蒎烷基吡唑类化合物在制备杀虫剂或抑菌剂中的应用。

所述的蒎烷基吡唑类化合物酰胺衍生物在制备杀虫剂或抑菌剂中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明利用天然可再生资源β-蒎烯的氧化产物诺蒎酮为原料，制备出新型的蒎烷基吡唑类化合物及其酰胺衍生物，该类化合物在杀虫农药或杀菌剂中的具有广泛的用途，拓展松节油的应用领域，提高松节油的利用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明。

实施例16,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑(化合物I)的制备

1)3-苯亚甲基诺蒎酮的制备：

在配有温度计、搅拌器和回流冷凝器的100mL三口烧瓶中，依次加入0.01mol诺蒎酮，30mL蒸馏水或乙醇或叔丁醇，0.15molNaOH或乙醇钠或叔丁醇钾和0.012mol苯甲醛，加热至回流反应8～24h，至诺蒎酮转化率达95％以上(GC跟踪检测)。反应液冷却后，加入饱和食盐水，采用乙酸乙酯萃取3次(20mL×3)，合并的有机相用蒸馏水饱和食盐水洗至中性，经无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得到黄色固体粗产物，再用丙酮和少量乙醇溶解均匀，静置结晶，得到3-苯亚甲基诺蒎酮类化合物无色透明晶体，纯度为98.2％(GC)。

2)6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑的制备：

将0.015mol(3.39g)3-苯亚甲基诺蒎酮、90mL乙醇、0.075mol(4.69g)质量分数为80％的水合肼依次加入配有温度计和回流冷凝器的200mL三口烧瓶中，用带有磁力搅拌的油浴锅搅拌加热至回流反应10h左右，至3-苯亚甲基诺蒎酮转化率达95％以上(GC跟踪检测)。反应液冷却至室温后，加入30mL乙腈，蒸去反应液中的溶剂和过量的水合肼；依次加入90mL干燥的1,4-二氧六环和3.75g DDQ，搅拌并加热回流反应8h；反应液冷却至室温，加入30mL 20％KOH水溶液、80mL二氯甲烷，室温搅拌0.5h后，再用二氯甲烷萃取，合并有机相并用去蒸馏水洗至中性；经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后得到油状初产物，采用硅胶色谱柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)、乙醇重结晶，得到6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑(化合物I)，白色针状晶体，纯度97.1％(GC)，得率为79.6％。该化合物的结构表征具体数据如下：m.p.165.2～166.0℃；¹H NM R(DMSO，300MHz)δ：蒎烷基：0.65(s，3H，9-CH₃)，1.38(s，3H，10-CH₃)，1.27～1.28(m，1H，8α-CH)，2.29～2.33(m，1H，8β-CH)，2.68～2.71(t，J＝7.5Hz，1H，7-CH)，2.77～2.80(t，J＝9Hz，1H，5-CH)，2.82(d，J＝7.5Hz，2H，4-CH₂)；苯基：7.30(s，1H，4′-CH)7.44(d，J＝1.8Hz，2H，3′,5′-CH)，7.68(d，J＝10.8Hz，2H，2′,6′-CH)，12.39(s，1H，NH)；¹³CNM R(DMSO，75MHz)δ：21.26，25.88，26.02，32.05，38.94，39.22，39.50，39.78，40.43，40.96，41.07，108.31，124.91，126.97，128.71，131.11，137.55，157.95；IR(KBr)：3125.62(ν_N-H)，3060.59(ν_＝C-H，苯环C-H伸缩振动)，2922.96(ν_asC-H，CH₂)，1513.15，1446.13(ν_C＝C，苯环C＝C环伸缩振动)，1116.06，980.55(τ_C-H，苯环C-H面内弯曲振动)，866.00(τ_C-H，单取代苯环C-H面外弯曲振动)，768.33，689.67(τ_C-H，单取代苯环C-H面外弯曲振动)；MS(70eV)m/z(％)：238(M⁺，26)，223(34)，195(100)。

实施例22-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺(化合物II)的制备

1)3-对氟苯亚甲基诺蒎酮的制备：

在配有温度计、搅拌器和回流冷凝器的100mL三口烧瓶中，依次加入0.01mol(1.38g)诺蒎酮，30mL蒸馏水或乙醇或叔丁醇，0.15molNaOH或乙醇钠或叔丁醇钾和0.012mol p-氟苯甲醛，加热至回流反应8～24h，至诺蒎酮转化率达95％以上(GC跟踪检测)。反应液冷却后，加入饱和食盐水，采用乙酸乙酯萃取3次(20mL×3)，合并的有机相用蒸馏水饱和食盐水洗至中性，经无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得到黄色固体粗产物，再用丙酮和少量乙醇溶解均匀，静置结晶，得到3-对氟苯亚甲基诺蒎酮，为无色透明晶体，纯度为98.2％以上(GC)。

2)6,6-二甲基-3-对氟苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑的制备：

将0.015mol(3.66g)3-对氟苯亚甲基诺蒎酮、90mL乙醇、0.075mol(4.69g)质量分数为80％的水合肼依次加入配有温度计和回流冷凝器的200mL三口烧瓶中，用带有磁力搅拌的油浴锅搅拌加热至回流反应10h左右，至3-芳亚甲基诺蒎酮转化率达95％以上(GC跟踪检测)。反应液冷却至室温后，加入30mL乙腈，蒸去反应液中的溶剂和过量的水合肼；依次加入90mL干燥的1,4-二氧六环和3.75g DDQ，搅拌并加热回流反应8h；反应液冷却至室温，加入30mL 20％KOH水溶液、80mL二氯甲烷，室温搅拌0.5h后，再用二氯甲烷萃取，合并有机相并用去蒸馏水洗至中性；经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后得到油状初产物，采用硅胶色谱柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)、乙醇重结晶，得到6,6-二甲基-3-对氟苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑，为白色粉状固体，纯度98.5％(GC)，得率为80.3％。该化合物的结构表征具体数据如下：m.p.167.8～169.2℃，¹HNMR(DMSO，300MHz)δ(ppm)：蒎烷基：0.65(s，3H，9-CH₃)，1.39(s，3H，10-CH₃)，1.23～1.27(m，1H，8α-CH)，2.29～2.30(m，1H，8β-CH)，2.91～2.94(t，J＝6.5Hz，1H，7-CH)，3.24(d，J＝7.2Hz，2H，4-CH₂)，4.07～4.08(t，J＝2.4Hz，1H，5-CH)；苯基：7.23(d，J＝3.6Hz，2H，3′,5′-CH)，7.71(d，J＝10.8Hz，2H，2′,6′-CH)，12.38(s，1H，NH)；¹³CNMR(DMSO，75MHz)δ(ppm)：21.21，25.69，25.96，31.98，38.92，39.19，39.47，39.75，40.40，40.93，108.07，115.45，115.73，126.86，126.97，127.96，135.89，157.87，159.50，162.74；IR(KBr)(cm^-1)：3148.92(ν_N-H)，3061.24(ν_＝C-H，苯环C-H伸缩振动)，2923.19(ν_asC-H，CH₂)，1603.69(ν_C＝N)，1517.27，1448.63(ν_C＝C，苯环C＝C环伸缩振动)，1233.49(ν_C-N)，1158.20，1116.87，981.62(τ_C-H，苯环C-H面内弯曲振动)，837.09，814.62(τ_C-H，对二取代苯环C-H面外弯曲振动)；MS(70e V)m/z(％)：256(M⁺，25)，241(33)，227(8)，213(100)。

3)2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺的制备：

将0.01mol 6,6-二甲基-3-p-氟-苯基-4,5,6,7-四氢-2H-5,7-桥亚甲基吲唑溶于25mL DMF中，加入配有温度计、搅拌器和冷凝器的100mL三口烧瓶中，加入1mol/L的乙醇钠醇溶液10mL，加热值80℃并磁力搅拌30min后，通过恒压漏斗向反应液中慢慢滴加2-氯乙酰胺0.014mol的10mL DMF溶液，保持温度不变回流反应30h(TLC跟踪)。冷却至室温过滤后，将滤液旋干并加入乙酸乙酯饱和食盐水洗至中性，有机层经无水硫酸钠干燥后，过滤并旋蒸，所得粗产物使用石油醚：乙酸乙酯的比例结晶，得到2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺，为白色透明晶体，得率48.9％，纯度98.2％(G C)，化合物5的结构表征数据如下：m.p.200.2～201.0℃，¹H NMR(DMSO，300MHz)δ(ppm)：蒎烷基：0.65(s，3H，9-CH₃)，1.39(s，3H，10-CH₃)，1.23～1.27(m，1H，8α-CH)，2.29～2.30(m，1H，8β-CH)，2.93(t，J＝6.5Hz，1H，7-CH)，3.24(d，J＝7.2Hz，2H，4-CH₂)，4.07～4.08(t，J＝2.4Hz，1H，5-CH)，4.65(s，2H，-CH₂-)；苯基：7.21(d，J＝3.6Hz，2H，3',5'-CH)，7.75(d，J＝10.8Hz，2H，2',6'-CH)，7.20(s，2H，NH₂)；¹³CNMR(DMSO，300MHz)δ(ppm)：21.21，25.69，25.96，31.98，38.92，39.19，39.47，39.75，40.40，40.93，5.89，108.07，115.45，115.73，126.86，126.97，127.96，135.89，157.87，159.50，162.74，168.59；IR(KBr)(cm^-1)：3329.38、3179.97(ν_NH2)，2928.74(ν_asC-H，CH₂)，1689.01(ν_C＝O)，1525.62、1459.50(ν_C＝C，苯环C＝C环伸缩振动)，1223.31(ν_C-N)，1154.43、1116.65、1091.12(τ_C-H，苯环C—H面内弯曲振动)，838.07、808.00(τ_C-H，对二取代苯环C-H面外弯曲振动)；MS(70eV)m/z(％)：313(M⁺，42)，298(12)，270(40)，225(100)。

实施例3化合物的抗虫活性试验

1)供试虫源

供试害虫为萝卜蚜Lipaphiserysimi(Kaltenbach)和紫薇长斑蚜Tinocalliskahawaluokalani(Kikaldy)，萝卜蚜采自南京农业大学温室种植的甘蓝上，紫薇长斑蚜采自南京农业大学紫薇树叶上。

2)试验方法

萝卜蚜：采用喷雾法，测定供试杀虫剂对蚜虫的毒力效果。以0.1％TritonX-100水溶液为对照，试验时母液用0.1％TritonX-100水溶液稀释成所需要的系列浓度梯度。喷雾采用Potter喷雾塔，将未接触过药剂的甘蓝叶片放置在喷雾塔中并用相应浓度进行喷雾，然后将叶片上即刻接入无翅成蚜和个体较大的无翅若蚜，每处理15头蚜虫，重复3次。等叶片晾干后放入直径5cm培养皿中并拧紧盖口，置于温度为25±1℃，光周期为16:8h(L:D)的培养箱内。24h后检查死亡率。检查时用毛笔轻轻拨动虫体，不能动即视为死亡。

紫薇长斑蚜：采用喷雾法，测定供试杀虫剂对蚜虫的毒力效果。以0.1％Tri tonX-100水溶液为对照，试验时母液用0.1％TritonX-100水溶液稀释成所需要的系列浓度梯度。喷雾采用Potter喷雾塔，将未接触过药剂的紫薇叶片放置在喷雾塔中并用相应浓度进行喷雾，然后将叶片上即刻接入无翅成蚜和个体较大的无翅若蚜，每处理15头蚜虫，重复3次。等叶片晾干后放入直径5cm培养皿中并拧紧盖口，置于温度为25±1℃，光周期为16:8h(L:D)的培养箱内。24h后检查死亡率。检查时用毛笔轻轻拨动虫体，不能动即视为死亡。

本发明对蒎烷基吡唑类化合物的抗虫活性进行了评价，试验结果见表1和表2。

表1化合物I和II对萝卜蚜虫的抑制活性

表1中，CK为空白对照，a阳性对照为噻虫嗪。由表1可知，200mg/L的供试浓度下化合物I和II对萝卜蚜虫的抑制活性分别为73.3％和100％，于是对化合物I和II的抗虫效果做了进一步的实验研究，以紫薇长斑蚜为供试试虫，采用喷雾法，测试了不同的供试浓度下的抗虫效果，其结果见表2。

表2化合物I和II对紫薇长斑蚜虫的抑制活性

表2中，CK为空白对照，a阳性对照为噻虫嗪。由表2可知，化合物I和Ⅱ对紫薇长斑蚜虫具有较好的致死效果，而且化合物II的效果明显优于化合物I。阳性对照噻虫嗪的合成需要多步反应，成本较高。本专利以天然产物为原料，较为经济便捷地合成了具有抗虫活性的化合物，扩展了其应用价值。

实施例4化合物的抑菌活性试验

1)供试菌种

大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.sub tilis)、白色念珠菌(C.albicans)、黑曲霉(A.niger)、热带假丝酵母(G.tropi calis)均由南京林业大学化学工程学院微生物实验室提供。

2)培养基的制备

细菌培养用牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)的制备：称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖1.0g，NaCl5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，加热溶解，用10％NaOH溶液调pH至7.0～7.2，本实验省略过滤，分装于三角瓶中，分别塞上棉花塞，在1.05kg·cm^-2、121℃下灭菌20min后备用。

真菌培养用马铃薯葡萄糖琼胶培养基(PDA培养基)的制备：称取200g洗净并去皮的马铃薯丁置于1000mL水中，煮沸30min后，用4层纱布过滤，再加入20.0g葡萄糖和18.0g琼脂，加热融化后再补足水至1000mL，分装于三角瓶中，分别塞上棉花塞，在121℃下灭菌20min后备用。

3)菌悬液的制备

将测试用细菌和真菌分别接种于无菌的NA和PDA平板培养基上。细菌于35℃下培养24h；真菌于28℃下培养72h。用接种针分别挑取少许已活化的菌体置于装有无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，配成一系列10⁶～10⁷CFU·mL^-1的菌悬液。

4)最低抑菌浓度(MIC)测定

最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)采用二倍稀释法测定。具体操作如下：

先将第2孔到第12孔加入75μL无菌水，再将待测化合物和阳性对照品酮康唑及阿米卡星分别用DMSO配成500μg/mL的溶液150μL加入第1孔，将化合物和阳性对照溶液分别在96孔分析板上进行二倍稀释，从第1到第12孔配成一系列的浓度梯度(500μg/mL～0.244μg/mL)，每孔含75μL溶液，以纯的DMS O作为参照，然后向每个孔中加入75μL预先配好的菌悬液，充分混匀。最后将96孔分析板置于30℃培养箱中，细菌培养24h，真菌培养48h后观察，使用酶标仪测定96孔板在600nm波长下的OD值，理论依据是在600nm波长下的OD值与菌体浓度呈正相关的线性关系。

本发明对蒎烷基吡唑类化合物的抑菌活性进行了评价，试验结果见表3。

表3化合物I和II的最低抑菌浓度(MIC)

^a阳性对照(positivecontrol)：细菌为阿米卡星，真菌为酮康唑。

从表3数据可知，化合物I和II大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、白色念珠菌(C.albicans)、黑曲霉(A.niger)、热带假丝酵母(G.tropicalis)等具有很好的抑制活性能力，在制备真菌、细菌的杀菌剂或抑制剂中将有广泛的用途。

Claims

1.蒎烷基吡唑类化合物的合成方法，所述的蒎烷基吡唑类化合物为6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑，结构式为：

其特征在于，包括以下步骤：

1)诺蒎酮与苯甲醛进行羟醛缩合，得到3-苯亚甲基诺蒎酮；所述的3-苯亚甲基诺蒎酮的结构式如下：

2)3-苯亚甲基诺蒎酮与水合肼进行缩合环化，得到吡唑啉中间体；吡唑啉中间体经二氯二氰基苯醌氧化芳构化，得到6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑；所述的吡唑啉中间体的结构式为：

2.根据权利要求1所述的蒎烷基吡唑类化合物的合成方法，其特征，包括以下步骤：

5)加入10～20mL乙腈，在80～120℃旋干，除去乙醇和过量的水合肼，得到吡唑啉中间体；依次加入90mL干燥的1,4-二氧六环、3.75g DDQ，搅拌并加热，回流反应8h；

3.蒎烷基吡唑类化合物酰胺衍生物的合成方法，所述的蒎烷基吡唑类化合物的酰胺衍生物为2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺，结构式为：

其特征在于，包括以下步骤：

1)诺蒎酮与苯甲醛进行羟醛缩合，得到3-芳亚甲基诺蒎酮；所述的3-苯亚甲基诺蒎酮的结构式如下：

2)3-芳亚甲基诺蒎酮与水合肼进行缩合环化，得到吡唑啉中间体，吡唑啉中间体经二氯二氰基苯醌氧化芳构化，得到6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑；所述的吡唑啉中间体的结构式为：

3)在碱性条件下，6,6-二甲基-3-苯基-4,5,6,7-四氢-5,7-桥亚甲基吲唑与2-氯乙酰胺进行烷基化，得到2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺。

4.根据权利要求3所述的蒎烷基吡唑酰胺衍生物的合成方法，其特征在于，步骤3)的具体过程如下：

1)25mL DMF、蒎烷基吡唑类化合物2.56g，1mol/L乙醇钠醇溶液10mL，0.014mol的2-氯乙酰胺DMF溶液10mL，依次加入配有搅拌器、温度计和回流冷凝器的三口烧瓶中，回流反应24～48h；

2)反应液经过滤、旋蒸除去DMF后，加入乙酸乙酯，用蒸馏水和饱和食盐水洗至中性，用无水硫酸钠干燥，过滤后回收溶剂，粗产物经重结晶，得到2-(6′,6′-二甲基-3′-对氟苯基-4′,5′,6′,7′-四氢-5′,7′-桥亚甲基-吲唑-2′-基)乙酰胺。