CN105663162A - 抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法。本发明以鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，然后用植物血凝素和鸭瘟病毒诱导培养淋巴细胞，体外生产抗鸭瘟病毒特异性转移因子。本发明所制备的特异性转移因子可以用于预防和治疗鸭瘟，同时可以提高鸭自身的免疫力。本发明具有特异性强、成本低、效果好等优点，是一种较为理想的抗鸭瘟病毒转移因子制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及兽药领域，更具体的说，是一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法。
背景技术
鸭瘟(DuckPlague，DP)又称鸭病毒性肠炎(DVE)，是鸭、鹅、天鹅的一种急性、热性、败血性传染病，其特征是血管损伤导至组织出血，体腔溢血，消化道粘膜坏死性病变，淋巴器管受损以及实质器管的退行性变化。本病流行广泛，传播迅速，发病率高，病死率大，通常在90％以上，因此对水禽业发展危害极大。
鸭瘟一年四季均可发生，主要发生于多种家鸭，包括北京白鸭、康贝尔鸭、印度疾走鸭、杂交鸭和混合杂交的土种鸭。偶尔也见有番鸭和家鹅的暴发。家鸭暴发鸭瘟常常与野生水禽共同栖息的环境有关。病鸭可通过感染鸭和易感鸭的直接接触传播，也可通过环境污染而间接接触传播。因为水禽觅食、饮水、栖息依靠共同的水生资源，水就成为病毒从感染者传播到易感者的自然媒介。此病一旦暴发，便会在短时间内迅速扩散，造成巨大经济损失。目前，除了每年定期对易感鸭群接种鸭瘟疫苗进行预防外并无特效药，兽医临床上多通过加强营养和应用抗生素药物来调节免疫力来进行鸭瘟的预防。近年来，不断有研究发现转移因子可提高机体抵抗力或调节免疫力预防多种疾病，可用于鸭瘟的预防和治疗。
转移因子(Transferfactor,TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能。可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染，也可以是否白介素与干扰素作用于免疫应答过程。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用，是一种新型而又安全的免疫制剂。此外，转移因子无种属特异性，动物来源的转移因子可用于人体。
目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等，反复冻融并经半透膜透析得到，工艺复杂，无特异性，回收率低。本发明通过体外制备抗鸭瘟病毒特异性转移因子特异性强、产出率高，对转移因子的大规模工厂化生产以及大范围应用具有很好的促进作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备以及针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫方法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗鸭瘟病毒特异性转移因子的制备方法。
一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其制备方法的步骤如下：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血20-30ml，加0.8％肝素溶液0.2m1抗凝，静置30-60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤2-3次，离心速度800-1200转/分，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；
(2)对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养：显微镜下观察(1)中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)病毒的提纯：将鸭瘟病毒接种于9-10日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养48-120h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯正的病毒；
(4)抗鸭瘟病毒特异性转移因子的制备：当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和鸭瘟病毒(终浓度为1000-1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2-3天后，8000转/分、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18-24h，超滤除菌，即获得体外制备抗鸭瘟病毒特异性转移因子。
一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，刺激鸭脾细胞和鸭血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为50-100mg/L。
一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，制备淋巴细胞单层以及细胞培养均在无菌状态下进行。
一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，离心时均需在4℃进行。
一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，超滤除菌所需滤膜为0.22μm滤膜。
本发明的优点及有益效果是：
(1)本发明所需鸡脾脏或外周血等原料较少，用植物血凝素和鸭瘟病毒诱导培养诱导淋巴细胞单层即可体外生产出大量抗鸭瘟病毒特异性转移因子的混合体。
(2)本发明的方法制备的抗鸭瘟病毒特异性转移因子无需进一步的提纯，直接将混合体用于禽类。
(3)本发明所得到的特异性转移因子即可起到抗鸭瘟病毒及抗菌的作用，同时又可以提高禽类的免疫力。
(4)本发明具有特异性强、成本低、产出率高、效果好等优点，是一种较为理想的鸭瘟病毒转移因子制备方法。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1
一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其制备方法的步骤如下：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血30ml，加0.8％肝素溶液0.2m1抗凝，静置45min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤3次，离心速度1200转/分，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；
(2)对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养：显微镜下观察(1)中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)病毒的提纯：将鸭瘟病毒接种于9-10日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养48-120h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯正的病毒；
(4)抗鸭瘟病毒特异性转移因子的制备：当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和鸭瘟病毒(终浓度为1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养3天后，8000转/分、30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18h，超滤除菌，即获得体外制备抗鸭瘟病毒特异性转移因子。
实施例2
一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其制备方法的步骤如下：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血25ml，加0.8％肝素溶液0.2m1抗凝，静置60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤3次，离心速度800转/分，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；
(2)对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养：显微镜下观察(1)中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)病毒的提纯：将鸭瘟病毒接种于9-10日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养48-120h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯正的病毒；
(4)抗鸭瘟病毒特异性转移因子的制备：当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和鸭瘟病毒(终浓度为1200血凝单位/ml)诱导培养，离心培养3天后，8000转/分、230min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析24h，超滤除菌，即获得体外制备抗鸭瘟病毒特异性转移因子。
实施例3:
对本发明所述工艺制备的抗鸭瘟病毒特异性转移因子的检测对实施例1所述工艺制备的抗鸭瘟病毒转移因子(下称“本品”)进行以下检测:
(1)标准液为黄色澄明液体，pH值在6.1-7.0之间。
(2)紫外线分光光度测定：本品在250.0-252.Onm处有一高吸收峰，且ABS260/ABS280>2.2。
(3)多肽含量测定：本品经双缩脉法测定多肽含量为1.232mg/ml。
(4)核酸含量测定：本品经地衣酚法测定核酸含量为0.591mg/ml。
(5)20％磺基水杨酸检测：本品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均为阴性，其不含大分子蛋白质。
(6)细菌学检测：本品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
(7)取健康小白鼠10只，口服本品浓缩液，相当于正常口服液剂量的20倍，观察小白鼠的生存能力变化，结果：无任何毒性反应，也无死亡现象出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。
(8)用PPD做家兔皮试实验，发现本品具有转移免疫活性的功能。
(9)用鸭瘟病毒抗原做皮试检测，有微弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。
应用实例：
选取200只15日龄黄羽肉鸭(经过健康检查无菌)，随机分为A，B，C，D，E共5组，B，C，D，E组经过人工感染0.3m1鸭瘟病毒强毒攻毒后作实验。A组为健康组，不感染病毒，不给药；B组阴性对照组，感染病毒，不给药；C组为本发明药物低剂量组，按禽0.3m1/只鸭/天肌肉注射；D组为本发明药物高剂量组，按禽0.6ml/只鸭/天注射饲喂；E组为双黄连口服液(天津中敖生物科技有限公司)，按禽1ml/只鸭/天灌服。结果表明，采用本发明药物治疗鸭瘟病毒病有着明显的疗效。
本发明抗鸭瘟病毒特异性转移因子实验结果如下:
上述试验结果表明，该药物低、高剂量治疗组与对照组差异非常显著(P<0.01)，说明本发明药物对传染性喉气管炎病毒引起的鸭瘟具有显著的治疗作用。且与“双黄连口服液”组疗效相当((P>0.01)。
Claims (5)
1.一种抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血20-30ml，加0.8％肝素溶液0.2m1抗凝，静置30-60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤2-3次，离心速度800-1200转/分，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；
(2)对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养：显微镜下观察(1)中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)病毒的提纯：将鸭瘟病毒接种于9-10日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养48-120h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯正的病毒；
(4)抗鸭瘟病毒特异性转移因子的制备：当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和鸭瘟病毒(终浓度为1000-1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2-3天后，8000转/分、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18-24h，超滤除菌，即获得抗鸭瘟病毒特异性转移因子。
2.根据如权利要求1所述的抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：刺激鸭脾细胞和鸭血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为50-100mg/L。
3.根据如权利要求1所述的抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：制备淋巴细胞单层以及细胞培养均在无菌状态下进行。
4.根据如权利要求1所述的抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：离心时均需在4℃进行。
5.根据如权利要求1所述的抗鸭瘟病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：超滤除菌所需滤膜为0.22μm滤膜。
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