CN105658094B - 植物提取物用于预防和治疗脱发的用途 - Google Patents

Abstract

在一方面，本发明涉及基于Galeopsis segetum Necker的植物提取物的组合物和生理上可接受的载体在治疗或预防脱发中的用途。所述组合物发现适用于毛发学领域并且可在头皮上局部应用或口服施用。

Description

植物提取物用于预防和治疗脱发的用途

发明领域

本发明涉及植物提取物用于预防和治疗脱发的用途。

本发明发生在毛发学和营养或饮食产品领域。

特别地，本发明涉及植物提取物用于刺激受到变稀和/或秃头影响的区域中的毛发生理生长的用途。

背景技术

毛发具有保护性功能并且与皮脂腺、汗腺和指甲一起被认为是皮肤附属物。毛发具有独特和特殊的特征：周期性。

毛球的生命周期本质上由三个相继的阶段代表：生长期(生长)、退化期(退化)和终期(休止阶段)。

毛发生长时期随后是退化阶段，在退化阶段期间毛囊的最深部分经历程序性细胞死亡。

在该阶段的末期，周期重新启动。这种现象的生物学阶段在于毛球的干细胞在交替步骤中离开其静止状态的能力。在毛球生长和毛发产生阶段期间，受到生长因子调节的增殖、分化和生存活性占优势。退化阶段，正相反，特征在于诱导毛球细胞的凋亡的分子途径的激活。

如果考虑毛发在社会关系中的作用，对许多人来说脱发可能是难以面对的。

在生长期，真皮乳头产生化学信号激活并且指导隆突(bulge)的干细胞通过迁移到毛囊的基部形成毛发基质。随着该“迁移”，隆突的干细胞产生生成外根鞘或ORS的细胞的“路径”。

响应于真皮乳头的进一步信号，衍生自干细胞的基质细胞通过向上移动以形成毛囊的毛干和内鞘而增殖并且开始分化过程。

退化期的开始由细胞增殖的终止和基质细胞的凋亡表征。在退化期期间，真皮乳头朝向隆突的最底部分迁移。乳头对隆突的这种紧密贴近被认为对于起始另一个毛发产生周期是至关重要的。这使得在毛发生长的一个新周期中休止的隆突细胞能够相互作用/活化。

退化期/终期过渡之后，隆突的一些细胞迁移以与乳头相遇产生毛芽。

在终期的毛发在其基部含有实际上被称作毛芽的、位于紧密贴近真皮乳头的细胞群。毛芽被激活以增殖朝向终期阶段的末期，甚至在隆突之前，以通过围绕乳头形成新毛球的基质。

包括压力、缺乏营养和老化在内的不同的因素负面影响毛球的生命周期，使得毛发数目的减少和毛发的变稀。

在患有雄激素源性脱发(AGA)的个体中，随着时间的推移，在新生长期阶段的开始再次形成的毛囊在大小上更小，导致与最初的直径相比具有更小直径的毛发的形成。因此，发生微小毛发的形成。观察到虽然头皮的毛囊萎缩，仍保留转化成祖细胞的干细胞的供应，尽管与生理状况的头皮相比到了更少的程度。

大多数市场上可得的毛发制品靶向毛球并且对改善有助于毛发生理生长的状况的头皮新陈代谢、供养、氧化和微循环起作用。

在市场上可以得到用于治疗和预防脱发的不同产品和治疗。然而，到目前为止已经表明在治疗脱发中特别有效的那些产品的使用诸如米诺地尔或一些合成起源的抗甾族药物不是没有缺陷。尤其是，米诺地尔的局部施用可确定一定程度的副作用的发生，所述副作用诸如皮疹、局部炎症、头痛，而药物诸如非那雄胺的口服施用可确定产生对性生活有潜在负作用的激素功能障碍。

当前在毛发学领域使用的其他产品，尽管基于天然来源的产品，相反却具有通过复杂制备过程制造的缺陷，因此，特别昂贵。

因此，目前存在提供含有在刺激毛发生长的生理过程中有效并且其使用不会引起显著负作用的物质的产品的需要。

本发明的一个目标是提供一种组合物或制剂，所述组合物或制剂包含适用于在患有脱发或变稀的受试者中刺激生理性毛发生长并且其使用几乎不具有显著负作用的非合成来源的活性剂。

本发明的另一个目标是提供一种用于毛发学用途的组合物，所述组合物可被局部应用或口服施用，所述组合物的活性剂具有经由简单方法可获得的植物性来源。

发明概述

在本发明的技术领域中，申请人发现从选择的草本植物获得的植物提取物，当局部应用在头皮上或当口服施用时，刺激毛发生长的生理过程。

特别是申请人出乎意料地发现植物Galeopsis segetum Necker含有刺激毛球活性并且有助于恢复毛发生长的生理状况的一种或更多种活性成分。

因此，根据本发明的第一方面，提供了Galeopsis segetum Necker的植物提取物用于刺激毛发生理性生长的用途。

根据第二方面，本发明提供了一种用于来自Galeopsis segetum Necker的植物提取物，所述植物提取物用于在治疗或预防脱发中使用。

惊人地观察到，在患有毛发变稀的受试者中局部或口服施用Galeopsis segetumNecker的植物提取物使得头皮较稀区域的逐步变厚。

根据第三方面，本发明提供了包含Galeopsis segetum Necker的植物提取物和生理上可接受的载体的组合物用于刺激毛发生理性生长的用途。

根据第四方面，提供了一种组合物,所述组合物包含Galeopsis segetum Necker的植物提取物和生理可接受的载体,用于在治疗或预防脱发中使用。

典型地，本发明的组合物含有毛发学上活性量的存在于Galeopsis segetumNecker的提取物中的一种或更多种活性成分。

附图简述

从所附的图表中，本发明的特征和优势将变得更加明显，其中：

图1示出了涉及通过实施例8的MTT测定获得的关于以下样品在剂量范围2-200μg/ml内，持续24、48和72小时的细胞毒性数据的柱状图：植物生物质、Galeopsis segetum的水乙醇提取物、Galeopsis segetum的乙酸乙酯提取物、在Galeopsis segetum的超临界CO₂中的提取物；

图2示出了报告在如在实施例8的表1中记录的对以下样品的诱导的氧化胁迫的MTT测定结果的柱状图：α生育酚、植物生物质、Galeopsis segetum的水乙醇提取物、Galeopsis segetum的乙酸乙酯提取物和Galeopsis segetum的使用超临界CO₂的提取物；

图3示出了代表关于通过实施例8测定的由以下代表的样品的细胞内ROS产生的数据的柱状图：α生育酚、植物生物质和Galeopsis segetum的水乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和使用超临界CO₂的提取物；

图4示出了代表如实施例8中记录的对α-生育酚、植物生物质和Galeopsissegetum的水乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和使用超临界CO₂的提取物的样品的5-α还原酶同工型2的活性的影响的柱状图；

图5示出了代表如在实施例8中记录的对植物生物质、Galeopsis segetum的水乙醇提取物、Galeopsis segetum的乙酸乙酯提取物、Galeopsis segetum的超临界CO₂中的提取物中的每种两个浓度中的细胞角蛋白6A的表达的影响的柱状图；

图6示出了涉及根据实施例7的24小时MTT测定的柱状图，展示了与对照相比通过用含有增加量的Galeopsis segetum Necker的植物提取物处理确定的细胞活性的百分比；

图7示出了在实施例9描述的通过用高极性洗脱液的TLC色谱的Galeopsissegetum的三种提取物的特征性数据；

图8示出了在实施例9中描述的通过用高极性洗脱液的TLC色谱的Galeopsissegetum的三种提取物的特征性数据；

图9示出了实施例9的Galeopsis segetum的水乙醇提取物的FT-IR光谱图；

图10示出了实施例9的Galeopsis segetum的乙酸乙酯提取物的FT-IR光谱图；

图11示出了实施例9的Galeopsis segetum的使用超临界CO₂的提取物的FT-IR光谱图；

发明详述

申请人发现Galeopsis segetum Necker的植物提取物当局部施用或皮肤施用时，完成对细胞的毛囊细胞刺激作用，再激活毛发毛囊的生命周期。

此外，惊人地发现Galeopsis segetum Necker的提取物的，毛发学活性也被施加在典型地存在于其中发现毛发变稀的那些头皮区域的头皮静止毛球上。

因此，根据本发明的第一方面，提供了来自植物Galeopsis segetum Necker的植物提取物用于刺激毛发生理生长的用途。

根据第二方面，提供了一种来自植物Galeopsis segetum Necker的植物提取物，所述植物提取物用于在刺激毛发的生理生长中使用。

根据本发明的植物提取物来源于的植物是Galeopsis segetum Necker(G.ochroleuca Lam.、G.dubia Leers、G.villosa Huds。也被称为霜麻荨麻(Downy HempNettle))，一种属于唇形科的具有典型唇形花的草本直立种。

用于本发明的用途的植物提取物可来自植物Galeopsis segetum Necker的根、叶、果实或花或来自所述植物的这些部分的两种或更多种。

在一些实施方案中，植物提取物来自植物Galeopsis segetum Necker的气生部分。

根据一些实施方案，本发明的植物提取物是通过使用生理上可接受的或可食用的溶剂的提取方法从植物的一部分，特别是气生部分或其植物组织，提取获得的。术语可食用意指可被人体吸收的生理上可接受的溶剂。

获得植物提取物的适当的溶剂是生理上可接受的和/或可食用的液体，其中生物活性组分是可溶的并且其中所述生物活性组分不经历使其丧失其活性的改变。

在一些实施方案中溶剂是亲水性的并且选自水、乙酸乙酯、乙醇或其混合物。

为了获得植物Galeopsis segetum Necker的植物提取物，可采用使用超临界CO₂或固-液技术的提取技术，所述超临界CO₂或固-液技术适用于从植物的植物组织中分离/提取一种或更多种恢复毛球活性生理状况的生物活性组分。

在某些实施方案中，通过将Galeopsis segetum Necker的植物部分或基质浸渍在适当的溶剂例如水乙醇混合物中，发生一种或更多种生物活性组分的提取。

例如，将植物Galeopsis segetum Necker的植物部分或基质，典型的是气生部分，浸入适当的溶剂例如水乙醇混合物中，持续适于使溶剂富集一种或更多种生物活性组分的一段时间。在这些状况下，存在于植物的植物组织中的生物活性组分在溶剂中的提取通过扩散和渗透发生。

典型地在浸渍期间，植物Galeopsis segetum Necker的基质与溶剂接触一段可变的时间以获得有效量的生物活性组分的提取。在某些实施方案中浸渍时间可从1至48小时变化。

在某些实施方案中，Galeopsis segetum Necker的植物提取物以从0.01到100mg/ml的浓度施用。

根据某些实施方案，Galeopsis segetum Necker的合适的提取物的制备包括以下步骤：

-研磨植物的一部分，例如气生部分，

-加入提取溶剂，例如以获得在约1:10和约1:50之间的包含的药物/水乙醇溶剂的重量比，

-浸渍，

-提取，

-过滤，

-浓缩滤液，例如在减小的压力下通过溶剂的蒸发，

-可选地继续蒸发直到消除溶剂

-可选地干燥提取物。

在某些实施方案中，提取步骤可重复二或三次，直到耗尽待提取的物质。

在最后的通过蒸发去除溶剂的步骤中，可以可选地加入固体载体，诸如作为非限制性实例，淀粉或麦芽糊精，以获得干粉形式的提取物。

根据另一个实施方案，从Galeopsis segetum Necker的提取方法包括以下步骤：

-研磨例如植物的气生部分

-将获得的粉末转移到合适的渗滤器中

-渗滤出，例如使用一定量的提取溶剂以具有从约1:20至约1:100的药品/溶剂重量比

-重新循环渗滤液的一部分直到耗尽待提取的物质

-压按提取的植物床用于回收所有的提取溶剂

-过滤渗滤液

-浓缩滤液，例如在减小的压力下通过溶剂的蒸发

-可选地继续蒸发直到消除溶剂

-可选地干燥提取物。

根据某些实施方案，在最后的通过蒸发去除溶剂的步骤中，加入固体载体，例如淀粉或麦芽糊精，以获得干粉形式的提取物。

典型地获得的提取物可以是流体的、软的或干燥的。例如，在流体提取物中1ml提取物包含可溶于1g植物药物的生物活性组分，在软提取物中溶剂被部分蒸发尤其是直到提取物湿润滤纸，在干燥的提取物中溶剂几乎被完全蒸发以获得粉末。

可以制备具有不同极性的Galeopsis segetum的提取物。例如可以使用极性溶剂诸如水乙醇溶液获得高极性的提取物，使用较低极性的溶剂诸如乙酸乙酯获得中间极性的提取物，使用超临界CO₂获得非极性的提取物。优选的提取技术是使用高极性溶剂的那些和超临界CO₂的技术。特别地，使用这些技术有效提取对5-α还原酶具有抑制活性的植物复合物(phytocomplex)的一部分，5-α还原酶在雄激素源性脱发中发挥重要作用并且是非那雄胺的靶标，非那雄胺是一种已知的具有抗雄激素活性的化合物，在刺激毛发生长和再激活毛囊的生理周期上有效。

在某些实施方案中，使用在1:10和10:1之间的包含的溶剂和植物基质之间的重量比进行提取。

用于获得本发明的植物提取物的另外的方法包括通过消化、灌注、压榨、煎煮、沥滤、逆流提取、索式提取、用超临界气体或超声波提取的提取技术。

在一些实施方案中，包含在Galeopsis segetum Necker的提取物中的生物活性组分包含至少一种类黄酮，特别是，选自包含以下的组：单乙酰化的hypolaetin 4′-甲醚7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷、二乙酰化的hypolaetin 4′-甲醚7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷、单乙酰化的异黄芩素7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷、hypolaetin 4′-甲醚7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷、单乙酰化的hypolaetin 7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷、异黄芩素7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷和二乙酰化的hypolaetin 7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷。

申请人发现对于刺激毛球活性特别有活性的类黄酮是单乙酰化的hypolaetin4′-甲醚7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷和/或二乙酰化的hypolaetin 4′-甲醚7-(2″-阿洛糖基)葡萄糖苷。

在一些实施方案中，本发明的组合物具有在0.01和10％w/w之间，例如3％w/w的含量的Galeopsis segetum Necker的植物提取物。

包含在本发明的植物提取物中的生物活性组分再激活变稀区域和/或受到脱发影响的区域的头皮的(甚至当静止时的)毛囊的生命周期。这种作用还在毛发稀疏的头皮区域转化成毛发的再生长。

根据第三方面，本发明提供了包含Galeopsis segetum Necker的植物提取物和生理上可接受的载体的组合物在治疗和/或预防脱发中或用于刺激毛发的生理生长的用途。

根据第四方面，提供了一种组合物，所述组合物包含Galeopsis segetum Necker的植物提取物和生理上可接受的载体，用于在治疗或预防脱发中使用的。

特别是，本发明的组合物包含活性量的从植物Galeopsis segetum Necker提取的一种或更多种生物活性组分。

典型地，本发明的组合物是医疗设备、药用制剂、饮食或营养补充物、或化妆品。

本发明的组合物，当局部或全身施用时，增加生长期和微型化期的毛囊细胞的活力，并且通过再生毛囊和刺激新的毛发的生长再激活头皮的休眠细胞。

在一些实施方案中本发明的组合物包含生理上和/或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

典型地，本发明的组合物的生理上可接受的载体是适用于局部应用和/或口服施用的赋形剂、载体或稀释剂。

在本文件的范围内，术语“载体”是指可存在于本发明的组合物中的赋形剂、载体、稀释剂或佐剂。任何适用于期望用于施用的制剂形式的载体和/或赋形剂被预期在植物提取物或本文描述的存在于其中的活性成分的使用中。

典型地，本发明的组合物使用当口服或局部施用时是有生物活性的并且基本上没有副作用的植物来源的组分。

在一些实施方案中，本发明的组合物是口服施用的。在另外的实施方案中，组合物被应用至皮肤，并且特别是至头皮。

可基于得到的药物组合物预期施用的途径选择生理上和/或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物的施用途径是局部。在这些情况下，本发明的组合物可以以有效量直接应用至头皮。

例如，在雄激素源性脱发的治疗中，美容上活性量的本发明的组合物可以被方便地一天一次或多次直接应用至头皮，达交替有休息时间的持续2-3个月的周期。

根据本发明的另一方面，提供了一种美容治疗的方法，所述方法包括将有效量的以前描述的类型的组合物应用至头皮。

用于局部应用的组合物可以是固体、半固体或流体形式。适当的固体形式的制剂包括乳霜、凝胶、糊剂、软膏。

在其它实施方案中用于局部施用的制剂是流体形式，例如洗液、凝胶、洗发水、悬浮剂、乳剂的形式。

在流体或半流体形式的制剂的情况下，植物提取物可稀释在生理上可接受的液体形式的载体诸如水、乙醇、水乙醇的或甘油的溶液中或与适用于局部应用的其他液体混合。

举例来说，液体形式的本发明的组合物可以通过将提取物的生物活性组分溶解在水和/或乙醇中制备。液体组合物可以被缓冲以获得在5和7之间方便选择的pH范围以与头皮的pH兼容，并且然后被过滤并包装在适当的容器诸如小瓶或安瓶中。

在一些实施方案中，本发明的组合物可包含通常用于局部使用所用的化妆品或药物制剂制备中的赋形剂，诸如防腐剂、杀菌剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润湿剂、着色剂和通常用于化妆品/药物制剂制备技术中的其他赋形剂。

在一个实施方案中，用于局部应用的制剂是包含携带在合适的赋形剂中的提取物的乳剂的形式。

举例来说，合适的赋形剂是纤维素衍生物，诸如羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素和其混合物。

合适的赋形剂的另外的实例包括属于内酰胺家族的聚合物，诸如吡咯烷酮和其衍生物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮和其混合物；无机盐诸如磷酸钙或磷酸二钙；润滑剂诸如例如硬脂酸镁；三酰基甘油；以及其混合物。

在一些实施方案中，用于局部应用的组合物包含羟甲基纤维素类型的赋形剂和/或具有适用于制剂和物质的HLB的胶凝剂。

根据其他的实施方案，本发明的组合物的施用口服发生。

口服施用的组合物可以是固体或液体形式。典型的固体形式的组合物包括片剂、胶囊、粉末、颗粒、丸剂。典型的液体形式的组合物包括溶液、乳剂、悬浮剂、糖浆。所有的组合物还包含其控释形式。

片剂通常包含植物提取物分散于其中(典型地以干燥形式)的合适的载体或赋形剂。

本发明的组合物的生物活性组分可以以可变的量存在，例如在以重量计0.0001％和以重量计10％之间被包含，典型的在以重量计0.01％和5％之间。

根据某些实施方案，本发明的组合物还包含一种或更多种活性物质，诸如维生素、矿物质、微量营养素和在刺激毛囊活性中有活性的其他物质。

根据一些实施方案，用于口服施用的组合物是功能性食品、营养组合物、饮食产品、补充物或营养产品或医疗设备。

功能性食品意指除了其含有的传统营养素之外还可提供针对缺陷或生理性状况的益处或保护的任何改造的食品或食品成分。

营养产品意指从可食用的物质中分离或纯化的产品。营养产品是当其显示具有生理优势或提供针对缺陷或生理紊乱的保护的产品。

饮食补充物或营养补充物意值指含有维生素、矿物质、植物提取物、氨基酸、代谢物、提取物、浓缩物或这些成分的混合物的产品。

组合物的施用量和施用频率将取决于待治疗的毛孔学状况的类型和严重性。

本发明的组合物在预防和/或治疗秃头或毛发变稀的形式诸如例如脱落性脱发和雄激素源性脱发是有效的。

现将参照以下实施例描述本发明，以下实施例被提供用于阐明目的并且不应视为对本发明范围的限制。

实施例1

用于口服使用的片剂

实施例2

用于口服使用的颗粒产品

实施例3

用于口服使用的片剂

实施例4

应用至毛发和头皮的洗液

实施例5

治疗性洗发水

实施例6

皮肤用乳液

实施例7

在HFDPC-c

细胞中研究Galeopsis segetum的提取物的增殖作用，HFDPC-c

细胞被在存在毛囊真皮乳头生长培养基下，并且按照制造商

的说明保持培养。

借助于MTT测定评价增殖活性。

MTT测定(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)是一种用于体外评价细胞增殖的比色测定[Mosmann T，1983]，因为其允许通过线粒体活性的测定测量细胞增殖和生存力。该方法对于测量用分裂素、抗原性刺激物、生长因子处理之后的细胞生长和用于细胞毒性研究是非常有用的。

该测定提供了发色氧化剂MTT的使用，MTT由拥有四唑环的多环系统(C₁₈H₁₆BrN₅S)组成，所述四唑环可以容易地被线粒体脱氢酶或其他电子传递系统还原，通过打开四唑环形成被命名为甲瓒的含氮发色化合物。这样的甲瓒在细胞内环境中形成不可溶的晶体，对于该晶体来说膜是基本上不可渗透的：因此分子进入细胞被允许，但是如果其已经被正确代谢即如果电子传递链仍具有代谢活性，产物离开不被允许。

然后甲瓒晶体被溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，从而导致溶液从黄色变成深蓝-紫色。

将HFDPC-c细胞以5*10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中。24小时之后，一旦达到约80％的汇合(confluence)，用在全培养基中的6个渐增浓度0.01、0.05、0.1、0.5、1和2mg/mL的Galeopsis segetum的提取物处理细胞。另一方面，将对照细胞保持在全培养基中培养。

在5％CO₂下37℃孵育板24小时，这结束时用100μL在全培养基中的0.5mg/mL MTT(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)溶液代替培养基。

37℃孵育3小时后，收集培养基，用每孔100μL的DMSO(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)溶解甲瓒晶体。将用铝包裹的板放置在机械搅拌器(Arhos 160–PBIInternational，Milan，Italy)中室温120rpm持续15分钟。

染色的溶液的吸光度用微板分光光度读数仪(BioTek Instruments Inc.，BadFrieddrichshall，Germany)以570nm的波长(参考波长为630nm)测量。

根据下列公式，数据表示为相对于对照细胞(ctr)的细胞生存力百分比

细胞生存力/ctr的％＝(Abs样品/Abs ctr)*100

所有的测定进行两次。

测试结果显示细胞增殖的剂量依赖性的增加，指示对毛囊细胞的细胞生长的刺激。

毛发毛囊的干细胞在毛发周期中发挥重要的作用，但是已知随着老化发生了干细胞的失去和恢复毛发再生能力的丧失。基质细胞从干细胞形成，基质细胞的生长和分化受到由真皮乳头的细胞产生的物质的影响。真皮乳头的分泌活性受到由外根鞘的棘层细胞产生的物质或受到激素的控制。实际上，棘层细胞产生能够导致乳头细胞有丝分裂数目增加二至五倍的大于3000道尔顿的肽。最近发现成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板源性生长因子(PDGF)增强真皮乳头细胞的生长。特别是，这些蛋白质增加溶基质素(一种酶，金属蛋白酶)的合成，溶基质素对乳头的细胞起作用并且加速其生长。真皮乳头的细胞产生许多影响毛发基质的细胞增殖的细胞因子。因此，鼬瓣花(Galeopsis)的提取物表现的刺激这些细胞生长的作用有利于促进毛发生长。

实施例8

实验工作的目标

下文报告的实验程序具有研究经历不同提取过程的Galeopsis segetum的不同样品的体外活性，以便表征其抗氧化剂活性和刺激毛发生长的活性的目标。

实验材料

测定的样品

所有提取物在DMSO中稀释至100mg/ml并且在无菌条件下过滤。

储液保存在-20℃。

使用的试剂和设备

使用的生物学模型

鼠胚胎成纤维细胞的培养

鼠胚胎成纤维细胞BALB/c3T3的永生化株系，克隆A31(ATCC，Manassas，VA，USA)从Istituto Nazionale di Ricerca sul Cancro(Genova，Italy)获得。

细胞被保持在25cm3的无菌烧瓶中培养并且在37℃湿润的气氛中在5％CO2下孵育。当使用培养基DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基，ATCC,Manassas,VA,USA)时，加入10％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素的混合物(Pen-Strep混合物)。这些后面的试剂均购买自Lonza，Inc.(Barcelona，Spain)。

在培养步骤期间，每2天达到80％汇合之后通过用1×PBS(Lonza，Barcelona，Spain)洗涤并且37℃用胰蛋白酶-EDTA溶液(Lonza，Barcelona，Spain)处理2分钟分离细胞，进行1:3分离。

人类毛囊外根鞘细胞的细胞培养

由Innoprot提供的人类毛囊外根鞘细胞(HHFORSC)是由Scien细胞研究实验室从毛发外根鞘分离的。细胞系培养在用于间充干细胞的培养基(MSCM)：500ml基础培养基、10％胎牛血清(FBS)、1％间充干细胞生长补充剂(MSCGS)、1％青霉素/链霉素溶液(P/S溶液)中，并且在37℃和5％CO₂保持在25cm²培养瓶中。

在进行将细胞铺板之前，必须用聚-L-赖氨酸包被烧瓶(2μg/cm²)

每2天，用DPBS(达尔伯克磷酸缓冲盐水)洗涤之后，使用T/E溶液(胰蛋白酶/EDTA溶液)和TNS(胰蛋白酶中和溶液)以1:3-1:6分离汇合培养物，并且在37℃，5％CO₂以2-5×10⁴个细胞/cm²接种。

对照

MTT测定(BALB3T3)

阳性对照：在添加有10％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)的DMEM培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基，ATCC,Manassas,VA,USA)中并且在37℃和5％CO₂下保持在25cm²(96孔)培养板中的未处理的细胞。

DCFH-DA测定和MTT诱导的氧化胁迫测试(BALB3T3)

阴性对照：在添加有2.5％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)的DMEM培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基，ATCC,Manassas,VA,USA)中并且在37℃和5％CO₂下保持在25cm²(96孔)培养板中的未处理的细胞。

阳性对照：在添加有2.5％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)的DMEM培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基，ATCC,Manassas,VA,USA)中用1mM过氧化氢处理2小时并且在37℃和5％CO₂下保持在25cm²(96孔)培养板中(黑暗中)的细胞。

5-α还原酶的诱导活性的研究(BALB3T3)

阴性对照：在添加有10％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)和10ng/mL睾酮的DMEM培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基，ATCC,Manassas,VA,USA)中，并且在37℃和5％CO₂下保持在25cm²(12孔)培养板中的未处理的细胞。

阳性对照：在添加有10％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)和10ng/mL睾酮的DMEM培养基(达尔伯克改良英格尔培养基，ATCC,Manassas,VA,USA)中用非那雄胺(0.05mg/mL)处理24小时，并且在37℃和5％CO₂下保持在25cm²(12孔)培养板中的细胞。

角蛋白6A的表达的研究(ORS)

阴性对照：在MSCM，10％牛胎血清(FBS)、1％间充干细胞生长补充剂(MSCGS)、1％青霉素/链霉素溶液(P/S溶液)中并且在37℃和5％CO₂下保持在25cm²(12孔)培养板中的未处理的细胞。

在进行将细胞铺板之前，必须用聚-L-赖氨酸包被烧瓶(2μg/cm²)。

方法：

-预备细胞毒性测定(MTT测定)-BALB3T3

方法原理

MTT测定(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)是用于评价体外细胞增殖的比色测定，由于其允许通过评价线粒体活性的测定测量细胞增殖和生存力。该方法对于测量用分裂素、抗原性刺激物、生长因子处理之后的细胞生长和用于细胞毒性研究是非常有用的。

该测定提供了发色氧化剂MTT的使用，MTT由拥有四唑环的多环系统(C₁₈H₁₆BrN₅S)组成，所述四唑环可以容易地被线粒体脱氢酶或其他电子传递系统还原，通过打开四唑环形成被命名为甲瓒的含氮发色化合物。甲瓒在细胞内环境中形成不可溶的晶体，对于该晶体来说膜是基本上不可渗透的：因此分子进入细胞被允许，但是如果其已经被正确代谢即如果电子传递链仍具有代谢活性，产物离开不被允许。

甲瓒结晶然后被溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，因此导致溶液从黄色变成深蓝紫色。

实验程序

该测定根据Mosmann(1983)的方法进行，有一些小修改。将BALB3T3细胞以5*10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中。24小时之后，一旦达到约80％的汇合，用在全培养基中的6个渐增浓度2-10-20-50-100-200mg/mL的Galeopsis segetum的提取物(植物生物质；干水乙醇样品；乙酸乙酯中的样品；CO₂中的样品)处理细胞。另一方面，将对照细胞保持在全培养基中培养。

在5％CO₂下37℃孵育板24、48和72小时。所有处理结束时收集培养基并用100μL的在全培养基中的0.5mg/mL MTT溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)代替培养基。

37℃孵育3小时后，收集培养基，并用每孔100μL的DMSO(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)溶解甲瓒晶体。将用铝包裹的板放置在机械搅拌器(Arhos 160–PBIInternational，Milan，Italy)中室温120rpm持续15分钟。

染色的溶液的吸光度用微板分光光度读数仪(BioTek Instruments Inc.，BadFrieddrichshall，Germany)以570nm的波长(参考波长为630nm)测量。

根据下列公式，数据表示为相对于对照细胞(ctr)的细胞生存力百分比

细胞生存力/ctr的％＝(Abs样品/Abs ctr)*100

所有的测定进行至少两次。

具有诱导的氧化胁迫的MTT-BALB3T3

方法原理

鼠成纤维细胞BALB3T3代表用于体外研究氧化胁迫的经过验证的模型的一种(Subiradeet等，1995；Kutuk等，2004)。

由Rajapakse及同事在2005年进行的研究强调应用广泛使用的和通用的方法MTT测定用于研究活性化合物的体外抗氧化剂活性的可能性。特别是，通过这种方法可能研究这类化合物对随后经历氧化胁迫的细胞的保护作用。氧化胁迫的诱导是通过与过氧化氢孵育完成的，过氧化氢是一种通过形成ROS在细胞中产生氧化损伤的诱导剂。可能的保护作用可以通过评价与经历同样氧化胁迫的细胞相比预处理/预暴露于待测试的活性化合物的细胞的后氧化胁迫细胞生存力确定。较大的细胞生存力将对应于测试化合物的保护作用。

实验程序

该测定根据由Coda和同事(Coda等，2012)描述的方法进行，有一些改变。

将鼠成纤维细胞BALB3T3以5*10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中并且在37℃，5％CO₂下孵育，直至达到约80％的汇合。

随后，细胞用以下浓度：20-50和100μg/mL的Galeopsis segetum的提取物(植物生物质；干水乙醇样品；乙酸乙酯中的样品；CO₂中的提取物)孵育16小时。

从DMSO中的1000×储液开始，在无菌条件下过滤并使用加入2.5％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)的DMEM培养基制备稀释物。

将用1mM H₂O₂处理的细胞用作阳性对照；在另一方面，将保持在仅培养基(DMEM2.5％FCS)中的细胞用作阴性对照。

在16小时预处理结束时，用1×PBS洗涤细胞并在黑暗中37℃和5％CO₂下用在无血清的培养基中的1mM H₂O₂溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)孵育90分钟。

一旦氧化胁迫的诱导步骤结束，根据部分4.1.2描述的方法(MTT测定)进行各种样品的细胞生存力的评价。

根据下列公式，数据表示为相对于未胁迫的对照细胞(ctr)的细胞生存力百分比：

细胞生存力/ctr的％＝(Abs样品/Abs ctr)*100

所有测定进行至少两次重复。

通过DCFH-DA测定Galeopsis segetum的提取物对ROS产生的影响的研究-BALB3T3

方法原理

如Tobi和同事(Tobi等，2000)描述的，经由荧光光谱测定法通过2,7-二氯荧光素-二乙酸酯(DCFH-DA)测定确定鼠成纤维细胞BALB3T细胞系中ROS的产生。

DCFH-DA以其亲脂形式是一种非荧光化合物，能够扩散通过细胞膜。一旦在细胞内，其被细胞内的酯酶脱乙酰化为还原的2,7-二氯荧光素(DCFH)，DCFH也没有荧光性。不能再次穿过细胞膜的DCFH随后在细胞中积累(Curtin等，2002)。与细胞内ROS的反应导致DCFH氧化为高度荧光化合物2,7-二氯荧光素(DCF)。这类荧光的强度可以用荧光计检测到，允许评价细胞中产生的ROS的量。

实验程序

本实验所用的方案代表了由Tobi和同事在工作中描述的方案(Tobi等，2000)的修改版本。

将鼠成纤维细胞BALB3T3以5*10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中并且孵育直至达到约80％的汇合。

随后，将细胞用以下浓度：20-50和100μg/mL的Galeopsis segetum的提取物(植物生物质；干水乙醇样品；乙酸乙酯中的样品；CO₂中的提取物)孵育16小时。

从DMSO中的1000×储液开始，在无菌条件下过滤并使用加入2.5％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)的DMEM培养基制备稀释物。

将用1mM H₂O₂处理的细胞用作阳性对照；在另一方面，将保持在仅培养基(DMEM2.5％FCS)中的细胞用作阴性对照。

α-生育酚，以25-50-250-500μM的浓度被测试；

孵育结束时，通过在黑暗中37℃和5％CO₂下用4mM H2O2溶液处理90分钟进行氧化胁迫的诱导。

处理结束后，用1×PBS洗涤细胞两次并且根据供应商的方案用CelLytic^TM裂解缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)裂解。

随后，将裂解物转移至黑暗的96孔板，并且使用FluoroskanAscent FL微板荧光读数仪(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)使用分别为485nm和538nm的激发波长和发射波长以荧光光谱测定读取DCF荧光。将每个样品获得的与细胞内ROS产生相关的发射值(RFU)与阴性对照(ctr，用1mM H₂O₂处理的细胞)获得的发射值比较，并且根据以下等式表示为产生的ROS的百分比：

％产生的ROS/ctr＝(Abs538nm样品/Abs538nm ctr)*100

所有的测定进行至少两次重复。

Galeopsis segetum的提取物对5α还原酶(同工型2)的活性的影响的研究-BALB3T3

实验程序

通过定量RT-PCR(定量反转录聚合酶链式反应-qRT-PCR)评价细胞BALB3T3中5α-还原酶的同工型2(SRD5A2)的基因表达。

该分析具有3个连续步骤：

●提取总RNA；

●反转录成cDNA；

●qRT-PCR。

将鼠成纤维细胞BALB3T3以0.5*10⁶个细胞/孔的密度接种在12孔板中并且孵育，直至达到约80％的汇合。

随后，将细胞用以下浓度：20-50和100μg/mL的Galeopsis segetum的提取物(植物生物质；干水乙醇样品；乙酸乙酯中的样品；CO₂中的提取物)孵育24小时。

从DMSO中的1000×储液开始，在无菌条件下过滤并使用加入10％胎牛血清(FCS)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％青霉素和链霉素混合物(Pen-Strep混合)的DMEM培养基制备稀释物。

在另一方面，将保持在仅培养基(DMEM 2.5％FCS)中的细胞用作阴性对照。

非那雄胺，5α还原酶的同工型2(SRD5A2)的选择性抑制剂，以0.05mg/mL的浓度被测试。

孵育结束时，进行RNA提取。

通过使用RibospinTM商用试剂盒(Gene All Biotechnology Co.,LTD)从BALB3T3细胞提取总RNA。

用感兴趣的活性化合物孵育结束时，细胞被用PBS(1×)洗涤并且最后经历RNA提取程序。在提取结束时，通过使用分光光度计(Jenway UV/VIS MOD:6715，BS-6715B0)在260nm的波长下，计算以μg/mL计的提取的总RNA的浓度。

最后，通过在1％琼脂糖凝胶上运行的电泳评价RNA(2μg/mL)的完整性。

使用能够使用RNA链作为模板合成DNA分子的酶将总RNA转化成cDNA(互补DNA)；这种RNA-依赖性的DNA聚合酶取名为反转录酶。

反转录酶结合至单RNA链的3′末端并且借助于随机引物和脱氧核苷三磷酸(DNTP)合成cDNA链。

为了这个目的，使用含有5×PrimeScript缓冲液(用于实时)；PrimeScript RT酶混合物1；OligodTPrimer；Random 6mers和无RNAse dH₂O的“PrimeScript^TM RT ReagentKit(perfect Real Time)(TakaraBioInc.,Japan)”。

将提取并定量的RNA稀释至2μg/mL的浓度并且反转录成cDNA。制备10μL MasterMix(含有5×PrimeScript缓冲液(用于实时)；PrimeScript RT酶混合物1；OligodTPrimer50μM；Random 6mers 100μM)，向其中加入10μL RNA(2μg/mL)。

将样品放置在热循环仪(Stratagene Mx3000P实时PCR系统，AgilentTechnologies Italia S.p.A.，米兰，意大利)并在下列条件下经历反转录：

37℃15分钟；

85℃5秒；

4℃保持。

在反转录结束时，样品被补加30μL DEPC水以获得40ng/μL的cDNA最终浓度。

qRT-PCR是一种用于扩增并监控反应期间发射的荧光实时定量产生的扩增子的方法。

对于RT-PCR扩增，使用

探针系统(Applied Biosystems)。使用下列TaqMan探针：Mm00446421ml(SDR5A2)和Mm00466519ml(β-肌动蛋白)。β-肌动蛋白被用作对照基因(持家)。

TaqMan探针是一类允许推进扩增后显影荧光的探针。在其5′端存在结合的报告基团(荧光团FAM^TM)，同时3′端存在猝灭基团。报告基团和猝灭基团的接近取消了荧光信号的发射。用热稳定DNA聚合酶(Taq聚合酶)的5′核酸外切酶活性检测荧光，并且可以通过增加每轮增加的报告基团的荧光评价扩增产物的积累。

对于qRT-PCR，Master Mix安排如下：

●10μL“2×Premix Ex Taq”；

●1μL“20×TaqMan Gene ExpressionAssays”(含有2种引物和荧光团FAM^TM标记的荧光探针)；

●0.4μL阴性参考Rox II；

●5μL DEPC水。

对于靶基因，Master Mix被补加4μL cDNA，并且对于持家基因，Master Mix被补加1μL cDNA。

在下列条件下进行40轮扩增：

●95℃，30sec(Amplitaq激活)；

●95℃，5sec(变性)

●60℃，20sec(退火-延伸)

每个分析重复两次。

根据2^-△△Ct法分析获得的数据，因此可以计算相对于持家基因标准化的并且针对对照样品(未处理的细胞)校准的关于感兴趣基因的表达的值：

△△Ct＝△Ct_{靶标-持家}(对照)-△Ct_{靶标-持家}(处理的细胞)

假设100％的扩增效率，计算2^-△△Ct。

Galeopsis segetum的提取物对细胞角蛋白6A表达的影响的研究-ORS

实验程序

为了研究在ORS细胞中细胞角蛋白6A的表达，使用商业试剂盒：人类角蛋白，型II细胞骨架6A(KRT6A)ELISA试剂盒96T(CSB)。

第1天：

当细胞(HHFORSC)达到约80％的汇合时，将细胞用胰蛋白酶/EDTA分离并且以1×10⁶个细胞/ml的密度接种在12孔板中，然后在37℃5％CO₂下孵育(24h)。

第2天：

当细胞达到约80％的汇合时，将它们暴露于以下浓度：20-50和100μg/mL的待测试的活性化合物：植物生物质；干水乙醇样品；乙酸乙酯中的样品；CO₂中的提取物。

从在DMSO中的1000×储液开始，在无菌条件下过滤并且使用间充干细胞培养基制备稀释物。

第3天：

孵育结束时，通过使用以1％补充有蛋白酶抑制剂混合物的Cell Lytic^TM裂解缓冲液裂解细胞，并且将裂解物用于ELISA测定。

为了在样品中总蛋白含量上标准化蛋白的表达，通过Bradford测定(Bradford，1976)评价每个样品中总蛋白的量。

结果

通过实验获得的结果显示在附图1-5，其显示以下：

5.1预备细胞毒性测定(MTT测定)-BALB3T3

图1显示通过MTT测定获得的数据(平均值±SD)。在测试中，Galeopsis segetum的提取物：干提取物(植物生物质)、水乙醇提取物(干水乙醇样品)、乙酸乙酯中的提取物(乙酸乙酯中的样品)和CO2中的提取物(CO2中的提取物)以剂量范围2-200μg/mL被评价24、48和72小时。结果显示所有被测试的化合物没有细胞毒性。

5.2具有诱导的氧化胁迫的MTT-BALB3T3

图2显示在下列表1中指示的样品上具有诱导的氧化胁迫的MTT实验的结果。

样品	清除剂活性
		α-生育酚25μM	43.10
植物生物质50μg/mL	22.14
		干水乙醇样品50μg/mL	37.64
乙酸乙酯中的样品50μg/mL	50.13
		CO<sub>2</sub>中的提取物50μg/mL	48.58

特别地，图2示出了植物生物质、水乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、CO2中的提取物的抗氧化剂活性，同时表2示出了清除剂活性的数据。

结果显示提取物如何表达抗氧化剂活性。显示了提取过程如何决定这样的活性的提高，尤其是在乙酸乙酯和CO2中的提取。如果考虑植物生物质的清除剂活性(22.14)，按照水乙醇提取，清除剂活性是提高的(37.64；+70％)，并且用乙酸乙酯和CO2提取提高的越来越多(分别是50.13和48.58；平均+123％)。

5.3通过DCFH-DA测定Galeopsis segetum的提取物对ROS产生的影响的研究-BALB3T3

针对由H2O2诱导的氧化胁迫的细胞保护活性的数据在图3中显示。

诱导的氧化胁迫产生导致细胞群体的显著损失的细胞受苦的情形。用化合物(植物生物质、水乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、CO₂中的提取物)处理显示针对由氧化胁迫诱导的凋亡过程的保护能力。这种活性与观察到的抗氧化剂活性是一致的，并且与乙酸乙酯和CO2提取物相关。

5.4Galeopsis segetum的提取物对5α还原酶(同工型2)的活性的影响的研究-BALB3T3

图4显示非那雄胺的靶标5α还原酶的同工型2的基因表达的数据。

Galeopsis segetum(植物生物质)显示出了针对2型5α还原酶的抑制活性。水乙醇和CO2提取物(50和100μg/mL)也显示出了这种活性，而在乙酸乙酯提取物中不那么明显。

5.5Galeopsis segetum的提取物对细胞角蛋白6A的表达的影响的研究-ORS

图5显示关于细胞角蛋白6A的值，细胞角蛋白6A是一种熟知的毛囊干细胞的标记物，在毛囊干细胞中细胞角蛋白6A对于内稳态和毛发生长发挥重要功能。

获得的数据显示植物生物质不能刺激该角蛋白，而用水乙醇和乙酸乙酯提取(在两种测试剂量下)和CO2中的提取(仅较大剂量)得到的样品能够刺激该角蛋白。

乙酸乙酯样品对该角蛋白的刺激程度是显著的。

结论

进行的测试显示：

-在2-200μg/mL范围内测试的所有样品高达72h的细胞处理(成纤维细胞)不存在细胞毒性(MTT测定)

-所有化合物的良好的抗氧化剂活性，应注意提取步骤提高抗氧化剂活性。与植物生物质相比，水乙醇提取将该活性提高了+70％，而乙酸乙酯和CO2提取提高了123％(二氯荧光素测定)。

-该活性也反映在诱导的氧化胁迫后的细胞保护(在成纤维细胞上的测试)中

-关于刺激由ORS(毛囊细胞外根鞘)合成细胞角蛋白6A的测试表明植物生物质不能刺激其合成，而水乙醇、乙酸乙酯和CO₂提取(在这种情况下仅在较大测试剂量下)诱导该角蛋白的合成。

实施例9

简介

本实施例涉及三种具有不同极性的从Galeopsis segetum的气生部分获得的提取物的制备。通过用乙醇水溶液提取制备极性最强的提取物。首先进行溶剂的筛选以鉴定最合适的酒精含量。

使用超临界CO₂制备非极性提取物。

使用乙酸乙酯提取水乙醇提取物的较低极性的成分制备具有中等极性的提取物。

这些提取物被用于筛选活性。

1.测试的目标

三种具有不同极性的从Galeopsis segetum的气生部分获得的提取物的制备和其表征。

制备了以下提取物：

Galeopsis segetum的干水乙醇提取物-IDN6764

Galeopsis segetum的用乙酸乙酯的干提取物-IDN6765

Galeopsis segetum的用CO₂的提取物-IDN6766

2.实验步骤

2.1生物质

本文件中提到的所有工作都是在Galeopsis segetum的气生部分CoA 1054/9394上进行的。

2.2水乙醇提取物：乙醇含量的筛选

为了发现在产量、特征和通过TLC的次级代谢物方面最好的提取溶剂，用不同乙醇含量即20％、40％和70％进行筛选。对于每个测试，20g介质(medium)的生物质被悬浮到400ml 50℃的溶剂中混合4小时。过滤悬浮液并且浓缩溶液直至干燥。

每种提取在提取物产量、特征和TLC方面被评价。

结果显示在表1中。

表1

#用同样的浓度(5％)进行染色强度的比较

根据TLC，最好的提取溶剂是40％和70％EtOH。在另一面，后一提取物含有更多叶绿素，叶绿素产生绿色和发粘的提取物。为此，选择§40％EtOH作为提取溶剂。

2.3Galeopsis segetum的干水乙醇提取物的制备-IDN6764(ref.测试921/30/D)

a)将100g的Galeopsis segetum的地面气生部分CofA 1054/9394倒入渗滤器中，用0.54l 40％乙醇覆盖，加热至50℃并且置于静态条件下4h。

进行排出后，使用同样的温度和同样的接触时间进行三次另外的提取(3×0.3l)。

b)收集渗滤液并且在真空下浓缩以获得约0.15l的悬浮液和10％干残余物。

c)将悬浮液离心以分离不溶的残余物，并且在真空下浓缩清澈的溶液直到其干燥。

将残余物在50℃真空下干燥24h。

产量：14.79g Galeopsis segetum的干水乙醇提取物-IDN6764，lot 921/30/D，CofA 14/0605/LRE

产量w/w：14.79％

2.4Galeopsis segetum的用乙酸乙酯的干提取物的制备-IDN6765(ref.测试921/30/G)

a)将850g的Galeopsis segetum的地面气生部分CofA 1054/9394倒入渗滤器中，用4.6l 40％乙醇覆盖，加热至50℃并且置于静态条件下4h。

进行排出后，保持同样的温度和同样的接触时间进行三次另外的提取(4×2.5l)。

b)收集渗滤液并且在真空下浓缩以获得约1.4l的悬浮液和10％干残余物。

c)将悬浮液离心以分离不溶的残余物，并且使清澈的溶液经历使用乙酸乙酯的提取(3×0.35l)。

d)加入有机相并且浓缩直到获得软块(soft bulk)。加入水(10ml)并且再次浓缩悬浮液直到获得软块。重复这种处理以便去除任何残余的乙酸乙酯。

最后，将残余物在50℃真空下干燥24h。

产量：2.85g Galeopsis segetum的使用乙酸乙酯的干提取物-IDN6765，lot 921/30/G，CofA 14/0606/LRE

产量w/w：0.34％

2.5用CO₂的Galeopsis segetum的提取物的制备-IDN6766

a)将5kg的Galeopsis segetum CofA 1054/9394的地面气生部分倒入提取器的容器中。根据下列条件进行提取：

-温度，55℃

-压力，270-280bar

-CO₂流，70kg/h

-提取时间，4.5h

b)提取提供乳液(94g)。将乳液在60℃真空下干燥4h。

产量：74g的用CO₂的Galeopsis segetum的提取物-IDN6766，lot 522/14/23A，CofA 14/0604/LRE

产量w/w：1.48％

3.结果

进行下列检测表征提取物：

-外观

-用TLC鉴定，如附图7和8所示

-用FT-IR鉴定，如附图9-11所示

结果记录在表2中

表2

4.结论

从Galeopsis segetum的气生部分，制备并表征了三种具有不同极性的提取物。

Claims (16)

1.一种组合物用于刺激生理性毛发生长的非治疗用途，所述组合物包含来自Galeopsis segetum Necker的植物提取物和生理上可接受的载体，所述来自 Galeopsissegetum Necker的植物提取物通过用生理上可接受的溶剂对植物Galeopsis segetumNecker的一部分提取获得，所述生理上可接受的溶剂选自水、乙醇、其混合物或在超临界相的二氧化碳。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物呈用于口服施用或局部应用的形式。

3.一种组合物用于刺激生理性毛发生长的非治疗用途，所述组合物包含来自Galeopsis segetum Necker的植物提取物和生理上可接受的载体，所述来自 Galeopsissegetum Necker的植物提取物通过用生理上可接受的溶剂对植物Galeopsis segetumNecker的组织提取获得，所述生理上可接受的溶剂选自水、乙醇、其混合物或在超临界相的二氧化碳。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述组合物呈用于口服施用或局部应用的形式。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物呈选自洗液、乳霜或软膏的用于局部应用的形式。

6.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物呈洗发液的用于局部应用的形式。

7.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物呈乳液的用于局部应用的形式。

8.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物呈选自片剂、丸剂或粒化粉末的用于口服施用的形式。

9.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物还包含微量营养素。

10.根据权利要求1-4任一项所述的用途，所述组合物还包含选自维生素、矿物质和其混合物中的一种或更多种成分。

11.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物是营养制品或化妆品。

12.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物是功能性食品。

13.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述组合物是饮食补充物。

14.来自Galeopsis segetum Necker的植物提取物用于制造用于治疗或预防雄激素性脱发或脱落性脱发的药物的用途，所述来自 Galeopsis segetum Necker的植物提取物通过用生理上可接受的溶剂对植物Galeopsis segetum Necker的一部分提取获得，所述生理上可接受的溶剂选自水、乙醇、其混合物或在超临界相的二氧化碳。

15.来自Galeopsis segetum Necker的植物提取物用于制造用于治疗或预防雄激素性脱发或脱落性脱发的药物的用途，所述来自 Galeopsis segetum Necker的植物提取物通过用生理上可接受的溶剂对植物Galeopsis segetum Necker的组织提取获得，所述生理上可接受的溶剂选自水、乙醇、其混合物或在超临界相的二氧化碳。

16.根据权利要求14或15所述的用途，其中所述药物用于口服施用或局部应用。

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