CN105652020A - 血清中DCD的Elisa检测方法 - Google Patents

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邱芳华
薛志锋
梁东艳
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract

本发明提供血清中DCD的Elisa检测方法，包括以下步骤：1)配制标准溶液、2)取样、3)加含HRP的亲和素、4)显色检测、建立标准曲线和5)通过标准曲线计算血清样本的DCD浓度。该检测方法简单易行，先采用预包被DCD抗体的孔板与DCD反应，再依次与生物素标记抗体、含HRP的亲和素进行反应，从而形成DCD抗体-DCD-生物素标记抗体-含HRP亲和素的四元复合物，进而可以有效避免干扰，检测人和动物血液样品中的DCD的含量，具有较高的灵敏性和抗干扰性。

Description

血清中DCD的Elisa检测方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测方法，具体涉及血清中DCD的Elisa检测方法。
背景技术
Dermcidin(DCD)第一次是从人体汗液中分离出来的一种天然活性肽，其编码基因dermcidin最初被认为在汗腺中特异性表达。DCD在汗腺中表达并分泌至汗液中，具有抗菌活性。后来Porter等研究发现在前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺组织、肝细胞中都有dermcidin的表达，并同时证实它是一种潜在的致癌因子。
随着DCD出现在编码公认的肿瘤存活因子和恶病质因子，它是癌症病人身上一种重要的潜在治疗靶点。而目前通用的DCD的检测方法存在抗干扰性差的问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供血清中DCD的Elisa检测方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
血清中DCD的Elisa检测方法，包括以下步骤：
1)配制标准溶液：取标准样品，加稀释缓冲液配制一组梯度浓度的标准溶液；
2)取样：将DCD抗体预包被于孔板；分别取标准溶液和血清样本加至板孔后依次加入生物素标记抗体；取TMB显色液加入板孔作为对照孔；孔板加上盖，反应；
3)加含HRP的亲和素：加入洗涤液洗涤，将含HRP的亲和素加入除对照孔以外的板孔，反应；
4)显色检测：加入洗涤液洗涤，加入TMB显色液，反应；加入TMB终止液；酶标仪在450nm测定O.D.值；以浓度为横坐标、以步骤1)的标准溶液的O.D.值为纵坐标作标准曲线；
5)计算浓度：通过标准曲线计算血清样本中DCD的浓度。
作为优选，DCD抗体的获得方法如下：向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kgb.w.的剂量皮下注射DCD进行免疫，第5天以同样的剂量再次免疫，第15天收集存活小鼠或大鼠的血清，凝胶电泳分离出DCD抗体。
作为优选，所述洗涤液为质量分数为10-20％的吐温水溶液。
作为优选，步骤1)中，所述稀释缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
作为优选，步骤2)中，血清样本是经稀释缓冲液稀释1-100倍的血清样本。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供了血清中DCD的Elisa检测方法，该检测方法简单易行，先采用包被DCD抗体的孔板与DCD反应，再依次与生物素标记抗体、酶标抗体进行反应，从而形成DCD抗体-DCD-生物素标记抗体-含HRP亲和素的四元复合物，从而可以避免干扰，检测人和动物血液样品中的DCD的含量，具有较高的灵敏性和抗干扰性。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为实施例1的标准曲线图。
具体实施方式
以下具体实施方式中，如未特别说明，所采用的试剂均可通过市售途径获得，或是通过常规的实验手段可获得。本中心募集了88名志愿者作为受试者。
其中DCD抗体采用以下方式获得：
向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kgb.w.的剂量皮下注射DCD冻干标准品的生理盐水溶液进行免疫，第5天以同样的剂量再次免疫，第15天收集存活小鼠或大鼠的血清，凝胶电泳分离出DCD抗体。
本发明提供血清中DCD的Elisa检测方法，包括以下步骤：
1)配制标准溶液：取标准样品，加稀释缓冲液配制一组梯度浓度的标准溶液；
2)取样：将DCD抗体预包被于孔板；分别取标准溶液和血清样本加至板孔后依次加入生物素标记抗体；取TMB显色液加入板孔作为对照孔；孔板加上盖，反应；
3)加含HRP的亲和素：加入洗涤液洗涤，将含HRP的亲和素加入除对照孔以外的板孔，反应；
4)显色检测：加入洗涤液洗涤，加入TMB显色液，反应；加入TMB终止液；酶标仪在450nm测定O.D.值；以浓度为横坐标、以步骤1)的标准溶液的O.D.值为纵坐标作标准曲线；
5)计算浓度：通过标准曲线计算血清样本中DCD的浓度。
实施例1：
1)采血：取受试者清晨空腹外周静脉血8mL，4℃下静置，离心提取血清样本，储存于-80℃超低温冰箱备用；
2)配制标准溶液：取标准样品，使用PBS缓冲液稀释至浓度为50ng/mL，再依次等体积稀释得到25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL一组7个浓度的标准溶液；
4)取样：将DCD抗体预包被于孔板；分别取标准溶液和血清样本加至板孔后依次加入生物素标记抗体；取TMB显色液加入板孔作为对照孔；孔板加上盖，37℃反应；
5)加含HRP的亲和素：加入10％的吐温水溶液洗涤，将含HRP的亲和素加入除对照孔以外的板孔，37℃反应；
6)显色检测：加入10％的吐温水溶液洗涤，加入TMB显色液，37℃反应；加入TMB终止液；酶标仪在450nm测定O.D.值；标准溶液、TMB显色液的O.D.值如表1所示，
表1DCD的标准溶液的浓度与O.D.值
以浓度(ng/mL)为横坐标X，以O.D.值为纵坐标Y，作标准曲线，由图1可知，O.D.值与浓度呈较好的线性关系，经计算，标准方程为：Y＝0.049X+0.215，R2＝0.986。
7)计算浓度：通过标准曲线计算血清样本中DCD的浓度。
88名志愿者的性别、年龄和血清样本中DCD的含量水平如表2所示。
表288份血清样本中DCD的含量水平汇总表
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (5)

1.血清中DCD的Elisa检测方法，包括以下步骤：
1)配制标准溶液：取标准样品，加稀释缓冲液配制一组梯度浓度的标准溶液；
2)取样：将DCD抗体预包被于孔板；分别取标准溶液和血清样本加至板孔后依次加入生物素标记抗体；取TMB显色液加入板孔作为对照孔；孔板加上盖，反应；
3)加含HRP的亲和素：加入洗涤液洗涤，将含HRP的亲和素加入除对照孔以外的板孔，反应；
4)显色检测：加入洗涤液洗涤，加入TMB显色液，反应；加入TMB终止液；酶标仪在450nm测定O.D.值；以浓度为横坐标、以步骤1)的标准溶液的O.D.值为纵坐标作标准曲线；
5)计算浓度：通过标准曲线计算血清样本中DCD的浓度。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，DCD抗体的获得方法如下：向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kgb.w.的剂量皮下注射DCD进行免疫，第5天以同样的剂量再次免疫，第15天收集存活小鼠或大鼠的血清，凝胶电泳分离出DCD抗体。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述洗涤液为质量分数为10-20％的吐温水溶液。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述稀释缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，血清样本是经稀释缓冲液稀释1-100倍的血清样本。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103913579A (zh) * 2014-03-24 2014-07-09 北京普恩光德生物科技开发有限公司 一种降钙素原检测试剂盒
CN104142406A (zh) * 2014-08-22 2014-11-12 山东博科生物产业有限公司 一种稳定的肌钙蛋白i检测试剂盒

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Title
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