CN105648112A - 一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法 - Google Patents

一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，属于分子生物学领域。本发明通过对DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3全基因组序列进行比对，在序列保守区分别分段设计兼并引物，其中两对扩增部分重叠区的大片段引物，扩增范围除了5’UTR和3’UTR部分序列外，包含大部分基因组序列，以DHAV？cDNA为模板用此两对引物进行扩增，并将扩增片段构建到T载体。在这两对引物扩增大片段区域内，在保守区分别设计8个扩增区域部分重叠的小片段测序引物。本发明节省了构建测序克隆的数量，降低了工作量，同时解决了长片段测序要根据已测序列再设计合成测序引物的问题，节省了测序时间。

Description

一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法。
背景技术
对于病毒基因组测序，特别是RNA病毒的基因组测序，目前比较成熟，应用广泛的方法是设计扩增不同序列区域的引物，分段扩增并克隆到载体上，使用载体通用引物或特异性引物进行序列测定。最后结合5’/3’RACE技术，得到5’/3’两端的序列，将所有测序的序列拼接，而获得病毒全基因组序列。
目前该方法在鸭甲型肝炎病毒(DHAV)的全基因组序列测定也得到广泛应用，但鸭甲型肝炎病毒分为好多不同的基因型，比如基因1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)、基因2型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-2)、基因3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)等，按常规的策略，按每一种基因型设计合成一套测序引物和5’/3’RACE引物，就需要3套，假如某些位点发生变异，有可能导致测序失败，另外对于未知基因型鸭甲型肝炎病毒，还需要先进行鉴定，比较麻烦。
发明内容
本发明目的在于提供一种新的简便的鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法。本发明设计了一套通用测序引物，通过用同一套引物就可以对不同基因型鸭甲型肝炎病毒DHAV-1、DHAV-2及DHAV-3进行全基因测序列，即降低了分段克隆的劳动量，又节省了测序时间与成本。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，包括如下步骤：
(1)提取DHAVRNA，并通过反转录制备DHAVcDNA。
(2)DHAV基因组5’端和3’端的扩增：使用5’RACE试剂盒、引物5gps1out和5gps1in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组5’端；使用3’RACE试剂盒、引物3GPS1-out和3GPS1-in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组3’端，将扩增的DHAV基因组5’端和3’端进行胶回收纯化备用。
(3)DHAV基因组大片段的扩增：以DHAVcDNA为模板，分别使用引物对DHV3897A-F、DHV3897A-R和DHV4867B-F、DHV4867B-R进行PCR扩增，分别得到3897bp和4867bp左右产物，将两扩增产物进行胶回收纯化备用。
(4)将步骤(2)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的菌株送测序公司进行测序，测序引物为T载体测序引物。
将步骤(3)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的菌株送测序公司分别以引物对F1-F和F1-R、F2-F和F2-R、F3-F和F3-R、F4-F和F4-R、F5-F和F5-R、F6-F和F6-R、F7-F和F7-R、F8-F、F8-R作为测序引物进行测序。
(5)以已知的DHAV全基因组序列为参考，将各测序片段进行组装。
上述各引物序列如下：
5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；
5gps1in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；
3GPS1-out：TGTGTTGGMTATGACATC；
3GPS1-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；
DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG，
DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；
DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG，
DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
F1-F：TTGCTGTGTTGGGMTATGACATCA，
F1-R：GGGTGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
F2-F：AAGCTAGTGAYAARTATATTGG，
F2-R：TCTCCATAGCTRACRACATA；
F3-F：ATACTTGGAATWGGAMCACTTGG，
F3-R：GAATTTGATCCAKRACATCCTGT；
F4-F：ATTATGTTAGCAYTGTGTGATG，
F4-R：GGAGTCCAATTGAGTRAAYTTAGA；
F5-F：AAAAATGTATCGYCAYTATGGTGT，
F5-R：GTTCGGGTCGGTGWGTCCAYTCCA；
F6-F：TTGCGSTTYTTTGCCTATTT，
F6-R：CCCAATGCTRCAGCCCACAT；
F7-F：CCCTATGCCATCTTGGATCT，
F7-R：GGGATAAGAAYACYCCCCAT；
F8-F：CCAAACCCCTTAATTCAACG，
F8-R：ATCAACAGTRTTRGAGGTTCC。
引物序列中，W代表碱基G或T，M代表碱基A或C，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，K代表碱基G或T，S代表碱基G或C。
所述的鸭甲型肝炎病毒包括DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3。
步骤(3)中的PCR扩增优选为：先以cDNA为模板，进行长片段PCR扩增，所用Taq酶为LATaq，扩增反应程序为：94℃3min；94℃1min，68℃15min，20个循环；72℃10min。再以纯化后的长片段PCR扩增产物为模板进行PCR扩增，所用Taq酶为ExTaq，扩增反应程序为：94℃3min；94℃1min，58℃2min，72℃2min，20个循环；72℃20min。
步骤(4)中的T载体优选为pGEM-T载体，大肠杆菌优选为Top10菌株。
本发明通过对3种不同基因型的鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3)全基因组序列进行比对，在序列保守区分别分段设计兼并引物，其中两对扩增部分重叠区的大片段引物(DHV3897A-F、DHV3897A-R和DHV4867B-F、DHV4867B-R)，扩增范围除了5’UTR和3’UTR部分序列外，包含大部分基因组序列，以鸭甲型肝炎病毒cDNA为模板用此两对引物进行扩增，并将扩增片段构建到T载体。在这两对引物扩增大片段区域内，在保守区分别设计8个扩增区域部分重叠的小片段(F1-F8)测序引物。通过本发明方法，节省了构建测序克隆的数量，降低了工作量，同时解决了长片段测序要根据已测序列再设计合成测序引物的问题，节省了测序时间。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
(1)由于将克隆测序片段减少，所以可降低构建克隆的工作量。
(2)根据保守区设计了测序引物，因此可以直接walk，不用等部分序列出来后再设计合成测序引物，节省测序列时间。
(3)一套引物便可实现对3种基因型DHAV的全基因测序，具有很好通用性。
附图说明
图1是DHAV全基因序列通用测序方法的原理图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1兼并引物的设计与合成
从NCBI网站以fasta格式下载DHAV3个基因型的全基因组序列，使用生物学软件BioEdit进行ClustalW多序列比对，根据比对结果查找序列保守区，并以保守区为引物设计选定区，使用引物设计软件Oligo进行兼并引物设计与评价，对符合要求的引物送生物公司进行合成，序列合成要求PAGE纯化级。各引物序列如下：
5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；
5gps1in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；
3GPS1-out：TGTGTTGGMTATGACATC；
3GPS1-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；
DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG，
DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；
DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG，
DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
F1-F：TTGCTGTGTTGGGMTATGACATCA，
F1-R：GGGTGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
F2-F：AAGCTAGTGAYAARTATATTGG，
F2-R：TCTCCATAGCTRACRACATA；
F3-F：ATACTTGGAATWGGAMCACTTGG，
F3-R：GAATTTGATCCAKRACATCCTGT；
F4-F：ATTATGTTAGCAYTGTGTGATG，
F4-R：GGAGTCCAATTGAGTRAAYTTAGA；
F5-F：AAAAATGTATCGYCAYTATGGTGT，
F5-R：GTTCGGGTCGGTGWGTCCAYTCCA；
F6-F：TTGCGSTTYTTTGCCTATTT，
F6-R：CCCAATGCTRCAGCCCACAT；
F7-F：CCCTATGCCATCTTGGATCT，
F7-R：GGGATAAGAAYACYCCCCAT；
F8-F：CCAAACCCCTTAATTCAACG，
F8-R：ATCAACAGTRTTRGAGGTTCC。
引物序列中，W代表碱基G或T，M代表碱基A或C，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，K代表碱基G或T，S代表碱基G或C。
本发明鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法的原理图如图1所示，5’RACE和3’RACE连接到T载体上使用T载体测序引物进行测序；DHAV3897和DHAV4867连接到T载体上使用F1～F8引物对进行测序，可快速实现对DHAV中部序列测定。
实施例2DHAV-1全基因组序列测定
(1)病毒核酸总RNA的提取
取DHAV-1病毒，氯仿抽提，再超速离心纯化，然后用商品化病毒核酸提取纯化试剂盒进行总RNA抽提，确保总RNA提取质量，避免DNA污染。
(2)制备cDNA模板
取上述制备的总RNA4.0μL，随机引物(20μM)、Oligod(T)6(20μM)各0.5μL，dNTPmixture(2.5μMeach)4.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV0.5μL。将反应混合物混合均匀后，瞬离。反应条件为：42℃保温1h，70℃作用10min，灭活反转录酶。将制备的cDNA模板于4℃保存备用。
(3)目的片段的扩增
1)5’/3’RACE扩增基因组两端序列
按照5’RACE试剂盒(TAKARA，No.6107)操作说明书，以DHAV-1总RNA为模板，分别进行CIAP、TAP处理，然后将5’RACEAdaptor(试剂盒组分)连接到上述提取的RNA上，再进行反转录制备cDNA，依次使用引物5gps1out、5’RACEOuterPrimer(试剂盒组分)和5gps1in、5’RACEInnerPrimer(试剂盒组分)套式PCR扩增DHAV基因组5’端。按照3’RACE试剂盒(TAKARA，No.6106)操作说明书，使用3’RACEAdaptor(试剂盒组分)进行反转录制备cDNA，再使用引物3GPS1-out、3’RACEOuterPrimer(试剂盒组分)和3GPS1-in、3’RACEInnerPrimer(试剂盒组分)套式PCR扩增DHAV基因组3’端，扩增片段进行胶回收纯化备用。
2)基因组大片段序列的扩增
使用两对引物DHV3897A-F、DHV3897A-R和DHV4867B-F、DHV4867B-R，以DHAV-1cDNA为模板，进行长片段PCR扩增DHAV-1基因组主体部分。扩增体系为：cDNA4μL，dNTPmixture(2.5μMeach)8μL，10×PCRbuffer5μL，上下游混合引物(10μM)0.5μL，LATaq(5U/μL)0.5μL，加无菌水至50μL。扩增反应程序为：94℃3min，热变性；20个循环(94℃1min，68℃15min)，72℃10min，延伸。
长片段PCR扩增反应结束后，乙醇沉淀纯化PCR扩增产物，以长片段PCR扩增产物为模板再进行普通PCR扩增。扩增体系为：长片段PCR扩增产物5μL，dNTPmixture(2.5μMeach)8μL，10×PCRbuffer5μL，上下游混合引物(10μM)0.5μL，ExTaq(5U/μL)0.5μL，加无菌水至50μL。扩增反应程序为：94℃3min，热变性；20个循环(94℃1min，58℃2min，72℃2min)；72℃20min，总延伸。对扩增片段通过胶回收方式纯化备用。
(4)扩增片段的克隆构建及鉴定
将回收纯化的各目的片段，分别与pGEM-T载体进行连接，为保证连接效率，采用4℃过夜连接的方式，将连接产物转化Top10感受态细胞，涂LB平板进行蓝白斑筛选，对长出的白斑菌落进行扩大培养，取菌液进行PCR鉴定，对鉴定正确的菌液，送测序公司测序。分别以引物对F1-F和F1-R、F2-F和F2-R、F3-F和F3-R、F4-F和F4-R、F5-F和F5-R、F6-F和F6-R、F7-F和F7-R、F8-F和F8-R作为测序引物对基因组大片段进行测序，使用T载体测序引物(测序公司自备)直接对基因组5’端和3’端两小片段进行测序。
(5)序列的拼接与分析
采用生物学软件Lasergene，执行Seqman程序，以已知的DHAV-104G株全基因组序列(GenBank:EF067923)为参考，导入测序公司反馈的各序列片段，进行组装，便可得到该病毒的全基因组序列，全基因组测序结果见SEQIDNO.25，该病毒全基因组序列与已知DHAV-104G株全基因组序列相似性为99.3％。
实施例2DHAV-3全基因组序列测定
本实施例中检测的病毒样本为DHAV-3，将种毒接种鸭胚后，将收获的鸭胚的尿囊液病毒(毒价＞106.0ELD50/mL)，其余处理皆同实例1，经过以上步骤得到DHAV-3鸭胚致弱疫苗毒的全基因组序列，全基因组序列见SEQIDNO.26，与DHAV-3参考病毒DHAV-3EY株(GenBank:KP995438)全基因组序列相似性为98.7％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取鸭甲型肝炎病毒RNA，并通过反转录制备鸭甲型肝炎病毒cDNA；
(2)鸭甲型肝炎病毒基因组5’端和3’端的扩增：使用5’RACE试剂盒、引物5gps1out和5gps1in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组5’端；使用3’RACE试剂盒、引物3GPS1-out和3GPS1-in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组3’端，将扩增的鸭甲型肝炎病毒基因组5’端和3’端进行胶回收纯化备用；
(3)鸭甲型肝炎病毒基因组大片段的扩增：以DHAVcDNA为模板，分别使用引物对DHV3897A-F、DHV3897A-R和DHV4867B-F、DHV4867B-R进行PCR扩增，将两扩增产物进行胶回收纯化备用；
(4)将步骤(2)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的菌株送测序公司进行测序，测序引物为T载体测序引物；
将步骤(3)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的菌株送测序公司分别以引物对F1-F和F1-R、F2-F和F2-R、F3-F和F3-R、F4-F和F4-R、F5-F和F5-R、F6-F和F6-R、F7-F和F7-R、F8-F、F8-R作为测序引物进行测序；
(5)以已知的鸭甲型肝炎病毒全基因组序列为参考，将各测序片段进行组装；
上述各引物序列如下：
5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；
5gps1in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；
3GPS1-out：TGTGTTGGMTATGACATC；
3GPS1-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；
DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG，
DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；
DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG，
DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
F1-F：TTGCTGTGTTGGGMTATGACATCA，
F1-R：GGGTGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
F2-F：AAGCTAGTGAYAARTATATTGG，
F2-R：TCTCCATAGCTRACRACATA；
F3-F：ATACTTGGAATWGGAMCACTTGG，
F3-R：GAATTTGATCCAKRACATCCTGT；
F4-F：ATTATGTTAGCAYTGTGTGATG，
F4-R：GGAGTCCAATTGAGTRAAYTTAGA；
F5-F：AAAAATGTATCGYCAYTATGGTGT，
F5-R：GTTCGGGTCGGTGWGTCCAYTCCA；
F6-F：TTGCGSTTYTTTGCCTATTT，
F6-R：CCCAATGCTRCAGCCCACAT；
F7-F：CCCTATGCCATCTTGGATCT，
F7-R：GGGATAAGAAYACYCCCCAT；
F8-F：CCAAACCCCTTAATTCAACG，
F8-R：ATCAACAGTRTTRGAGGTTCC；
引物序列中，W代表碱基G或T，M代表碱基A或C，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，K代表碱基G或T，S代表碱基G或C。
2.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，其特征在于：所述的鸭甲型肝炎病毒包括DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3。
3.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，其特征在于：
步骤(3)中的PCR扩增为：先以cDNA为模板，进行长片段PCR扩增，所用Taq酶为LATaq，扩增反应程序为：94℃3min；94℃1min，68℃15min，20个循环；72℃10min；
再以纯化后的长片段PCR扩增产物为模板进行PCR扩增，所用Taq酶为ExTaq，扩增反应程序为：94℃3min；94℃1min，58℃2min，72℃2min，20个循环；72℃20min。
4.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，其特征在于：步骤(4)中的T载体为pGEM-T载体。
5.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，其特征在于：步骤(4)中的大肠杆菌为Top10菌株。
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