CN105646731B - 一种制备高品质生物多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由普通黄原胶纯化制备高透明黄原胶的方法。包括：将脂肪酶溶液等酶液加入到黄原胶原样溶液中，搅拌混匀后酶解，以除去黄原胶原样中的杂质，得到酶解除杂后的黄原胶溶液；采用澄清过滤纸板、细过滤纸板和部分除菌过滤纸板对酶解除杂的黄原胶溶液进行减压抽滤；将所述抽滤后的黄原胶溶液与醇盐混合溶液混合，搅拌至黄原胶析出，乙醇漂洗并浸泡过夜，烘干，即得高透明黄原胶产品。本发明的高透明黄原胶的生产工艺流程步骤少，技术操作简便易掌握，成本低，产品透光率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄原胶粗粉提纯方法，具体涉及一种由普通黄原胶纯化制备高透明黄原胶的方法。
背景技术
黄原胶(Xanthan gum)是由细菌Xanthomonas campestris发酵产生的天然多聚糖，具有对人体低毒、难消化、粘度高、稳定性优良的特征，被广泛应用于食品、石油工业、药物、化妆品、个人护理产品及农业生产中。
黄原胶极易溶于水，且溶解过程中胶粉易结块。其特殊分子结构致使其水溶液具有非牛顿流变性(假塑性特征)，即剪切稀化，随后又能快速恢复粘性。此外，不同温度导致胶体分子构象和有序结构的外观发生变化，在40～60℃之间，粘度随温度升高而增加；高于60℃后，粘度随温度升高而减小；当温度达到80～130℃时，能够提高黄原胶在水中的溶解性而不导致黄原胶分子降解。所以，溶解黄原胶时，可将胶粉与分散介质充分混匀，并以高速搅拌法溶解于热水中。
工业上多以生物合成途径生产黄原胶，其生物合成途径可归纳为同化单糖、装配、聚合重复单元三步，其中涉及发酵微生物、发酵培养基及非目标代谢产物等杂质。其生产技术决定其产物含有诸多低分子量成分、残留的培养基成分、菌体碎片及其它代谢产物、盐及蛋白质等杂质，从而影响黄原胶产品的含量和质量(如，透光度、粘度等)。
为获得高纯度等级产品，常通过化学、物理及二者结合的方法，具体包括以下一种或几种操作：低浓度黄原胶水溶液(<1.0g/l)的再沉淀、化学除蛋白(如盐析或通过三氯乙酸使蛋白质沉淀析出)、酶解(如蛋白酶)、膜处理(如超滤和渗滤)等。此外，利用乙醇也可溶解黄原胶溶液中的有色杂质、微凝胶(microgel)、盐、有机残留物及细胞碎片等，且高浓度乙醇能够降低黄原胶在水溶液中的溶解度，从而发生相位分离，可达到除杂作用。仅使用乙醇，需≥6倍样品体积的乙醇才能使黄原胶完全析出，在醇析时加入盐，可降低醇的用量。但是，通过以上方法或降低产品回收率，或一定程度上破坏产品性状，例如化学去蛋白过程中所用试剂可能与黄原胶发生反应。终产物黄原胶的含量和质量成为比较各提取方法优劣性的重要标准，因此在黄原胶提纯过程中必须兼顾回收率、产品纯度及产物性状等方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种由普通黄原胶纯化制备高透明黄原胶的方法。
本发明所提供的由普通黄原胶纯化制备高透明黄原胶的方法，包括下述步骤：
1)配制酶液，将所述酶液加入至黄原胶原样溶液中，搅拌混匀后进行酶解，得到酶解除杂后的黄原胶溶液：
所述酶液为下述a)-d)中任一种：
a)脂肪酶溶液；
b)脂肪酶溶液和溶菌酶溶液；
c)脂肪酶溶液和蛋白酶溶液；
d)脂肪酶溶液、溶菌酶溶液和蛋白酶溶液；
2)利用滤板，对所述酶解除杂后的黄原胶溶液进行减压抽滤得到抽滤后的黄原胶溶液；
3)将所述抽滤后的黄原胶溶液与醇盐溶液混合，搅拌至黄原胶析出，即得所述高透明黄原胶。
上述的方法中，步骤1)中，所述酶液由酶溶于缓冲液中制备得到，所述酶为脂肪酶、溶菌酶或蛋白酶；
所述缓冲液具体可为磷酸盐缓冲液；
所述脂肪酶溶液中所述脂肪酶的用量为0.1～1 000U/ml所述黄原胶原样溶液，具体可为10～200U/ml所述黄原胶原样溶液、10U/ml所述黄原胶原样溶液或200U/ml所述黄原胶原样溶液；
所述溶菌酶溶液中所述溶菌酶的用量为0.1～20 000U/ml所述黄原胶原样溶液，具体可为5 000U/ml所述黄原胶原样溶液；
所述蛋白酶溶液中所述蛋白酶的用量为0.1～1 000U/ml所述黄原胶原样溶液，具体可为60U/ml所述黄原胶原样溶液；
所述酶解的温度为大于15℃，具体如37～70℃，所述酶解的时间大于0.2h，具体如0.5～24小时；
使用所述蛋白酶时，根据所使用的蛋白酶酸碱性质不同，在酶解处理前，应使用酸液或碱液将黄原胶溶液的酸碱度调节至相应pH值；
所述脂肪酶的酶活力单位定义为：在37℃，pH＝7.4条件下，每小时水解乙酸甘油酯中1μg当量脂肪酸的酶量为一个酶活力单位U；
所述溶菌酶的酶活力单位定义为：在25℃，pH＝6.24条件下，每分钟能使溶壁小球菌悬浮液在450nm波长处的吸光度(1cm光径)下降0.001的酶量为一个酶活力单位U。
所述蛋白酶的酶活力单位定义为：在40℃，pH＝7.5条件下，每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位U。
上述的方法中，步骤1)中，所述黄原胶原样溶液为下述1)或2)：
1)生产黄原胶的发酵液；
2)按照下述方法制备得到：将黄原胶原样粉末，或黄原胶原样粉末与葡萄糖粉末混合均匀后的粉末，加入至蒸馏水中至溶解充分，即得到所述黄原胶原样溶液；
所述黄原胶原样粉末指的是现有的普通的黄原胶样品，其透光度比较低，如阜丰食品级80目黄原胶粉末；
所述葡萄糖粉末的重量为所述黄原胶原样粉末重量的0～20倍，但不为零，如为10倍；
所述黄原胶原样溶液中黄原胶的质量百分含量可为0.01％～10％，具体可为0.25％～0.5％、0.25％或0.5％。
上述的方法中，步骤1)之前，所述方法还包括利用活性炭对所述黄原胶原样溶液进行吸附的步骤，以进行初步除杂。
上述的方法中，步骤2)之前，所述方法还包括用水浴对所述酶解除杂后的黄原胶溶液进行灭活的步骤；
上述的方法中，步骤2)中，采用不同孔径的精细过滤纸板对所述酶解除杂后的黄原胶溶液进行抽滤，所述精细过滤纸板包括澄清过滤纸板(孔径6～15μm)、细过滤纸板(孔径1～6μm和0.6～1μm)和部分除菌过滤纸板(孔径<0.6μm)，上述各过滤纸板依次使用；
采用硅藻土和/或珍珠岩作为过滤助剂。
上述的方法中，步骤3)中，所述醇盐溶液由氯化钠水溶液与乙醇混合得到；
用于配制醇盐溶液的所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量百分含量为0.1％～20％，具体可为10％～15％、10％、12％或15％，用于配制醇盐溶液的所述乙醇的体积百分含量不小于80％，如95％。
上述的方法中，步骤3)中，所述醇盐溶液的体积为所述抽滤后的黄原胶溶液体积的0.5～10倍，具体可为1～2倍、1倍、1.6倍或2倍；
步骤3)还依次包括用乙醇或乙醇水溶液对析出的黄原胶进行漂洗和浸泡的步骤和烘干的步骤，所述漂洗可进行一次或多次；
所述烘干在大于25℃的恒温条件下进行，如37～90℃。
上述的方法还可进一步包括对步骤3)得到的高透明黄原胶产品按不同需求研磨粉碎至指定直径的粉末的操作。
由上述方法制备得到的高透明黄原胶也属于本发明的保护范围。
1％高透明黄原胶水溶液在波长为600nm时的透光率可达90％。
本发明高透明黄原胶中的“高透明”指的是其质量百分含量为1％时的水溶液在波长为600nm时透光率可达90％。
本发明利用脂肪酶单酶解或包括脂肪酶酶解在内的复合酶解、滤板抽滤和醇盐析相结合的方法，由普通黄原胶纯化制备出高品质的高透明黄原胶。本发明的高透明黄原胶的生产工艺流程步骤少，技术操作简便易掌握，成本低，产品透光率高。目前国内外制备的1％黄原胶水溶液在波长为600nm时的透光率最高基本在87％，本发明制备得到的高透明黄原胶产品，其1％水溶液在波长为600nm时透光率可达90％。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的1％高透明黄原胶与1％食品级80目黄原胶的全波长扫描图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；下述提及的试剂、材料和样品的浓度，除乙醇和活性炭为体积百分含量外，其余均为质量百分含量。
实施例1、
1、制备黄原胶原样溶液：将阜丰食品级80目黄原胶粉末与10倍重量葡萄糖粉末混合均匀，逐次少量加入高速搅拌的90℃的蒸馏水中，继续搅拌至溶解充分，制备得到质量百分含量为0.25％的黄原胶原样溶液，并冷却至37℃左右备用。
2、脂肪酶酶解除杂：将Solarbio脂肪酶(L8070，酶活力100～400U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按10U/ml的酶用量，将脂肪酶溶液加入步骤1制备的0.25％黄原胶原样溶液中。之后，将混合液在37℃搅拌混匀30min，并于37℃静置酶解12h。
3、灭酶活：沸水浴加热经步骤2酶解处理后的黄原胶溶液，以灭活脂肪酶。
4、减压抽滤：按311#(澄清过滤纸板，孔径10μm)、321#(细过滤纸板，孔径1.5μm)、332#(细过滤纸板，孔径0.8μm)和334#(部分除菌过滤纸板，孔径0.45μm)的顺序，使用滤板对经步骤3灭酶活处理的黄原胶溶液进行减压抽滤，抽滤过程中使用硅藻土为助滤剂。
5、醇盐析：将6ml 12％的氯化钠溶液与90ml 95％的乙醇充分混合后，加入50ml经过步骤4减压抽滤处理的黄原胶溶液，轻搅至黄原胶析出后，再用95％乙醇漂洗析出的黄原胶两次，并浸泡过夜。醇盐析产物于40℃恒温彻底烘干。
6、产品加工：将经步骤5处理烘干后的样品按不同需求研磨粉碎至指定直径粉末，即得高透明黄原胶产品。
将通过上述方法制备得到的高透明黄原胶与10倍重量的葡萄糖粉末混合均匀，逐次少量加入到高速搅拌的90℃的恒温蒸馏水中，继续搅拌至溶解充分，得到质量含量为1％的高透明黄原胶水溶液。该1％高透明黄原胶水溶液的全波长扫描图谱与蒸馏水接近，明显优于相同浓度未经处理的食品级80目黄原胶原样溶液(如图1)。
此外，在波长为600nm时，本实施例中质量百分含量为1％的高透明黄原胶水溶液的透光率高于90％，而未经处理的原样仅26％左右(表1)。
表1 实施例1中食品级80目黄原胶处理前后的透光率
| 样品名称 | 食品级80目黄原胶 | 实施例1产物 | 蒸馏水对照 |
| 样品浓度 | 1.0％ | 1.0％ | - |
| 透光率T600 | 26.0％ | 93.5％ | 100.0％ |
实施例2、
1、制备黄原胶原样溶液：将阜丰食品级200目黄原胶粉末，逐次少量加入高速搅拌的90℃的蒸馏水中至溶解充分，制备得到质量百分含量为0.25％的黄原胶原样溶液，并冷却至40℃左右备用。
2、脂肪酶酶解除杂：将Solarbio脂肪酶(L8070，酶活力100～400U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按200U/ml的酶用量，将脂肪酶溶液加入步骤1制备的0.25％黄原胶原样溶液中。之后，将混合液在40℃连续搅拌2h，以进行酶解。
3、灭酶活：90℃水浴加热步骤2酶解后的黄原胶溶液，以灭活酶。
4、减压抽滤：按311#(孔径10μm)→321#(孔径1.5μm)→332#(孔径0.8μm)→334#(孔径0.45μm)的顺序，使用滤板对经步骤3灭酶活处理的黄原胶溶液进行减压抽滤，抽滤过程中以硅藻土为助滤剂。
5、醇盐析：将10ml 15％的氯化钠溶液与90ml 95％的乙醇充分混合后，加入100ml经步骤4处理后的黄原胶溶液，轻搅至黄原胶析出，再用95％乙醇漂洗析出的黄原胶两次，并浸泡过夜。醇盐析产物于60℃恒温彻底烘干。
6、产品加工：将步骤5烘干后的样品按不同需求研磨粉碎至指定直径粉末，即得高透明黄原胶产品。
将通过上述方法制备得到的高透明黄原胶与10倍重量的葡萄糖粉末混合均匀，逐次少量加入到高速搅拌的90℃恒温蒸馏水中至溶解充分，得到质量百分含量为1％的高透明黄原胶水溶液。该1％高透明黄原胶水溶液在波长为600nm时，其透光率高于90％，而未经处理的200目黄原胶1％水溶液的透光率仅为30％左右(表2)。
表2实施例2中食品级200目黄原胶处理前后的透光率
| 样品名称 | 食品级200目黄原胶 | 实施例2产物 | 蒸馏水对照 |
| 样品浓度 | 1.0％ | 1.0％ | - |
| 透光率T600 | 30.3％ | 92.7％ | 100.0％ |
实施例3、
1、制备黄原胶原样溶液：将阜丰食品级200目黄原胶粉末加入蒸馏水中搅拌均匀，并加热至80℃以使其溶解充分，制备得到质量百分含量为0.50％的黄原胶原样溶液，并冷却至40℃左右备用。
2、活性炭吸附除杂：向步骤1制备的0.50％黄原胶原样溶液中加入体积百分含量约为2％的活性炭，搅拌均匀，于4℃吸附过夜后，使用300目滤布和311#(孔径10μm)滤板减压抽滤，以除去活性炭。
3、溶菌酶酶解除杂：将Solarbio溶菌酶(L8020，酶活力>20 000U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按5000U/ml的酶用量，将溶菌酶溶液加入经步骤2活性炭吸附除杂后的黄原胶溶液中。之后，将混合液在40℃连续搅拌2h，以进行酶解。
4、脂肪酶酶解除杂：将Solarbio脂肪酶(L8070，酶活力100～400U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按10U/ml的酶用量，将脂肪酶溶液加入经步骤3溶菌酶酶解除杂后的黄原胶溶液中。之后，将混合液在40℃连续搅拌2h，以进行酶解。
5、蛋白酶酶解除杂：将Solarbio中性蛋白酶(Z8030，酶活力>60U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按60U/ml的酶用量，将中性蛋白酶溶液加入经过步骤3以及步骤4溶菌酶和脂肪酶酶解除杂的黄原胶溶液中，混匀之后，在40℃酶解2h。
6、灭酶活：90℃水浴加热经步骤3～5复合酶解后的黄原胶溶液，以灭活酶。
7、减压抽滤：按321#(孔径1.5μm)→332#(孔径0.8μm)→334#(孔径0.45μm)的顺序，使用滤板对经步骤6灭酶活处理的黄原胶溶液进行减压抽滤，抽滤过程中使用珍珠岩作为助滤剂。
8、醇盐析：将6ml 10％的氯化钠溶液与75ml 95％的乙醇充分混合后，加入50ml经步骤7减压抽滤后的黄原胶溶液，轻搅至黄原胶析出。醇盐析产物于60℃恒温彻底烘干。
9、产品加工：将步骤8烘干后的样品，按不同需求研磨粉碎至指定直径粉末，即得高透明黄原胶产品。
将通过上述方法制备得到的高透明黄原胶，边搅拌边加入到高速搅拌的80℃的恒温蒸馏水中，至溶解充分，得到质量百分含量为1％的高透明黄原胶水溶液。该1％高透明黄原胶水溶液在波长为600nm时，其透光率高于90％(表3)。
表3实施例3中食品级200目普通黄原胶经过复合酶解处理后的透光率
| 样品名称 | 实施例3中黄原胶复合酶解产物 |
| 样品浓度 | 1.0％ |
| 透光率T600 | 90.5％ |
实施例4、
本实施例中，黄原胶原样溶液的酶解，可以是脂肪酶单独酶解，也可以是脂肪酶复合酶解。脂肪酶复合酶解，即①溶菌酶酶解之后，进行脂肪酶酶解；或者②先溶菌酶酶解，再脂肪酶酶解，最后进行蛋白酶酶解；或者③先脂肪酶酶解，再进行蛋白酶酶解。按照酶解方案的不同，选择性地进行2～4的酶解除杂步骤。
1、制备黄原胶原样溶液：将阜丰食品级200目黄原胶粉末加入蒸馏水中搅拌均匀，然后加热至80℃以使其溶解充分，制备得到质量百分含量为0.50％的黄原胶原样溶液，并冷却至40℃左右备用。
2、溶菌酶酶解除杂：将Solarbio溶菌酶(L8020，酶活力>20 000U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按5000U/ml的酶用量，将溶菌酶溶液加入步骤1制备的0.50％黄原胶原样溶液中。之后，将混合液在40℃连续搅拌3h，以进行酶解。
3、脂肪酶酶解除杂：将Solarbio脂肪酶(L8070，酶活力100～400U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按10U/ml的酶用量，将脂肪酶溶液加入经或未经步骤2中溶菌酶酶解除杂后的黄原胶溶液中。之后，将混合液在40℃连续搅拌3h，以进行酶解。
4、蛋白酶酶解除杂：将Solarbio中性蛋白酶(Z8030，酶活力>60U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按60U/ml的酶用量，将中性蛋白酶溶液加入经过步骤3脂肪酶酶解除杂的黄原胶溶液中，并混匀。之后，将混合液在40℃酶解过夜。
5、灭酶活：90℃水浴加热经步骤3(未进行步骤4蛋白酶酶解的情况)或步骤4酶解处理后的溶液，以灭活酶。
6、活性炭吸附除杂：向经步骤5灭酶活的黄原胶溶液中加入体积百分含量约2％的活性炭，搅拌均匀，于室温吸附3h后，使用300目滤布和311#滤板(孔径10μm)减压抽滤，以除去活性炭。
7、减压抽滤：按321#(孔径1.5μm)→332#(孔径0.8μm)的顺序，使用细过滤纸板对步骤5灭酶活或者步骤6活性炭吸附除杂的黄原胶溶液进行减压抽滤。
8、醇盐析：将6ml 10％的氯化钠溶液与75ml 95％的乙醇充分混合后，加入50ml经过步骤7减压抽滤处理的黄原胶溶液，轻搅至黄原胶析出。醇盐析产物于60℃恒温彻底烘干。
9、产品加工：将经步骤8处理烘干后的样品按不同需求研磨粉碎至指定直径粉末，即得高品质黄原胶产品。
将通过上述方法制备得到的黄原胶逐次少量加入到高速搅拌的80℃恒温蒸馏水中，至溶解充分，得到质量百分含量为1％的黄原胶水溶液。
通过上述方法制备1％黄原胶水溶液，其在波长为600nm时的透光率，随着酶解除杂和减压抽滤除杂等处理方案的不同，而有差异。一般来说，经过332#滤板抽滤之后，其1％产物的透光率均高于80％(表4)。
表4实施例4黄原胶经过不同酶解和过滤组合处理后1％浓度样品的透光率
Claims (5)
1.一种制备高透明黄原胶的方法，包括下述步骤：
1)配制酶液，将所述酶液加入至黄原胶原样溶液中，搅拌混匀后进行酶解，得到酶解除杂后的黄原胶溶液：
所述酶液为脂肪酶溶液；
所述酶液由酶溶于缓冲液中制备得到，所述酶为脂肪酶；
所述酶解的温度大于15℃，所述酶解的时间大于0.2h；
所述黄原胶原样溶液按照下述方法制备得到：将黄原胶原样粉末，或黄原胶原样粉末与葡萄糖粉末混合均匀后的粉末，加入至蒸馏水中至溶解充分，即得到所述黄原胶原样溶液；
所述葡萄糖粉末的重量为所述黄原胶原样粉末重量的0～20倍，但不为零；
所述黄原胶原样溶液中黄原胶的质量百分含量为0.01％～10％；
2)利用滤板，对所述酶解除杂后的黄原胶溶液进行减压抽滤得到抽滤后的黄原胶溶液；
采用精细过滤纸板对所述酶解除杂后的黄原胶溶液进行抽滤；
采用硅藻土和/或珍珠岩作为过滤助剂；
3)将所述抽滤后的黄原胶溶液与醇与盐的溶液混合，搅拌至黄原胶析出，即得所述高透明黄原胶；
所述醇与盐的溶液由氯化钠水溶液与乙醇混合得到；
用于配制所述醇与盐的溶液的所述氯化钠水溶液中，氯化钠的质量百分含量为0.1％～20％，用于配制所述醇与盐的溶液的所述乙醇，其体积百分含量不小于80％；
所述醇与盐的溶液的体积为所述抽滤后的黄原胶溶液体积的0.5～10倍。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)之前，所述方法还包括利用活性炭对所述黄原胶原样溶液进行吸附的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)之前，所述方法还包括用水浴对所述酶解除杂后的黄原胶溶液进行灭活的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)还依次包括用乙醇或乙醇水溶液对析出的黄原胶进行漂洗和浸泡的步骤和烘干的步骤。
5.权利要求1-4中任一项所述方法制备的高透明黄原胶。
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- 2016-04-05 CN CN201610207859.9A patent/CN105646731B/zh active Active
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