CN105638482B - 核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法，解决了核桃杂交种的快速繁殖及缩短杂交育种的周期，并为克服核桃种间远缘杂交后杂种胚的败育提供了新的有效育种途径。具体步骤如下：1）杂交果的获得及其无菌化处理；2）幼胚的获得；3）幼胚的培养；4）胚培苗的继代；5）胚培苗的生根诱导；6）胚培苗的生根和炼苗；7）胚培苗的移栽。本发明方法是将幼胚培养技术同常规育种程序相结合，借助幼胚培养技术可以克服远缘杂交中胚败育，能够缩短育种周期的特性，迅速选育出抗性强的核桃砧木新品种，是一种高效的核桃砧木种间杂交新技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物幼胚培养技术，具体为一种核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法。
背景技术
核桃（Juglans regia L）为胡桃科（Juglandaceae）胡桃属，作为一种经济作物，是近年来我国退耕还林的重要树种，也是我国许多地区发展农业经济，进行精准扶贫的主要干果树种。我国在核桃育种研究中取得了显著的成绩，各地充分利用当地的核桃种质资源选育出了众多的核桃优良品种和优良无性系。但在核桃砧木方面的育种研究，国内很少有人问津。核桃砧木对核桃的嫁接亲和力、结果期、品质优劣、树体大小、适应性和抗逆性均有一定影响，是核桃生产的基础，是做大做强我国核桃产业的必经之路。因此，选择优良亲本进行杂交，是培育适应性强、抗性高适合我国地域特征和生态特点的优良核桃砧木新品种的一项根本性措施。核桃楸是我国特有的乡土核桃砧木资源和育种材料，通过杂交育种将核桃楸高抗病优良性状与核桃优良特性整合在一起，可以培育出适宜我国气候特点的抗病、抗逆的核桃砧木新品种。
核桃和核桃楸的种间杂交属于远缘杂交，是利用种间的杂交优势创新核桃砧木种质资源的重要方法。但是由于进行种间杂交的亲本间，亲缘关系较远，胚发育不协调和胚败育是杂交的主要障碍。幼胚培养是解决杂交胚败育的有效途径，迄今已在柑桔、葡萄、苹果、梨及核果类的杏、梅、桃、樱桃等多种果树树种上获得成功。表明此种培养方法有广泛适用性，实用价值较大。在核桃砧木的抗性育种中，利用该项技术，可在核桃和核桃楸授精胚败育发生之前进行胚培养，获得种间杂交后代，解决核桃砧木抗性育种中杂种胚败育和远缘杂交不实的难题。鉴于上述原因，我们认为有必要将生物技术（幼胚培养）同常规育种程序相结合，借助幼胚培养技术可以克服远缘杂交中胚败育现象的途径，在不影响世代间选择进度及遗传背景的前提下，大大缩短育种周期，可以改进目前常规核桃砧木育种方法，建立新的育种程序，对加快育种进程,快速选育出适应性强、多抗的核桃砧木有重要的现实意义。
发明内容
本发明为了解决核桃砧木种间杂交育种中的难题，将生物技术 （幼胚培养）同常规育种程序相结合，借助幼胚培养技术可以克服核桃和核桃楸种间远缘杂交胚败育现象，为快速选育出适应性强、多抗的核桃砧木提供新的育种方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法，包括以下步骤：
（1）、杂交果的获得及其无菌化处理
以优良核桃为父本，核桃楸为母本，进行杂交，杂交60天后取幼果，并进行无菌化处理；
（2）幼胚的获得
在超净工作台上，将幼果用无菌纸包裹，然后打开果核后，看到置于核桃顶端、夹在两片子叶间的幼胚，将幼胚取出放入有培养基的试管中，进行培养；
（3）幼胚的培养
幼胚的培养基为DKW培养基，附加植物生长调节剂6-BA 1.0mg/L，IBA 0.01mg/ L；培养条件：首先在4℃冰箱中放3周，然后在25℃条件下暗培养3周；待幼胚萌发，长出胚根和嫩茎，将胚根切去，仅留嫩茎，放培养室光照下培养，每天光照时间16小时，温度25℃；
（4）胚培苗的继代
将高为3-4cm的胚培苗截成1.5-2.0cm长的茎段，进行继代，继代培养基以DKW为基本培养基，附加植物生长调节剂BA 2.0mg/ L和IBA 0.01mg/ L；培养条件：光照下培养，每天光照时间16小时，温度25℃；
（5）胚培苗的生根诱导
将高为5-6cm继代胚培苗，插入生根诱导培养基中；生根诱导培养基以DKW为基本培养基，附加植物生长调节剂IBA 10mg/L，培养条件：暗培养一周，温度25℃；
（6）胚培苗的生根和炼苗
将生根诱导后的嫩茎，移栽到生根基质中；将移栽好的苗盘，放入湿度100%的环境中，直到嫩茎生根，且根长3cm以上，每个苗至少有3条根以上；将达到这一标准的幼苗移栽到湿度为85%的环境中继续炼苗1周，然后逐渐降低湿度，直到可以适应普通大棚中的环境；
（7）胚培苗的移栽
将炼好苗的胚培苗移栽到营养钵中，正常管理，当胚培苗长高到50cm以上，移栽到大田，并按大田日常管理程序进行即可。
本发明提供的核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法，可以使杂种幼胚的萌发率达到95%，胚培苗茎段的生根率达到75%，移栽成活率达到85%。本发明通过生物技术和传统育种有机结合，提供了核桃和核桃楸远缘杂交可以获得杂交苗的育种新途径。并且可以缩短育种进程，提高育种效率，建立新的育种程序。为获得优良抗性核桃砧木，扩大核桃砧木育种种质资源奠定了良好的育种基础，对核桃砧木育种的快速、有效进行开辟了新的育种途径，有重要的现实意义。
本发明设计合理，该核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法，具体是以优良核桃为父本，核桃楸为母本进行杂交，从杂交幼果中取出幼胚进行无菌培养，获得种间杂交植株。是一种将生物技术和传统育种程序相结合，进行核桃种间杂交，获得优良核桃砧木的育种方法。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
一种核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法，包括以下步骤：
（1）杂交果的获得及其无菌化处理
以优良核桃为父本，核桃楸为母本，进行杂交。杂交60天后取幼果，带回实验室进行无菌化处理。无菌化步骤为：将幼果用流水冲洗干净。用70%酒精浸泡30秒，在20%次氯酸钠溶液中浸泡20分钟，然后浸泡在5%的次氯酸钠溶液中，放在超净工作台上备用。
（2）幼胚的获得
在超净工作台上，将幼果用无菌纸包裹，用虎钳子夹紧，并继续用力直到果核裂开。将裂开的幼果放工作台上，把包裹的无菌纸和青皮及果核用无菌镊子拨开，即可看到置于核桃顶端，夹在两片子叶间的幼胚，将幼胚取出放入有培养基的试管中，进行培养。
（3）幼胚的培养
幼胚的培养基为DKW（Driver and Kuniyuki，1984）培养基，附加植物生长调节剂6-BA（6-苄氨基嘌呤）1.0mg/L，IBA（吲哚丁酸）0.01mg/L。首先在4℃冰箱中放3周，然后在25℃条件下暗培养3周。这时幼胚已经萌发，长出胚根和嫩茎，将胚根切去，仅留嫩茎，放培养室光照下培养，每天光照时间16小时，温度25℃；
（4）胚培苗的继代
将高约3-4cm的胚培苗，截成1.5-2.0cm长的茎段，进行继代，继代培养基以DKW为基本培养基，附加植物生长调节剂BA 2.0mg/L，IBA 0.01mg/L。培养条件：光照下培养，每天光照时间16小时，温度25℃。
（5）胚培苗的生根诱导
将高约5-6cm的继代胚培苗，插入生根诱导培养基中。生根诱导培养基为DKW培养基，附加植物生长调节剂IBA 10mg/L，培养条件：暗培养一周，温度25℃。
（6）胚培苗的生根和炼苗
将生根诱导后的嫩茎，移栽到生根基质中。基质配比如下，泥炭：珍珠岩：蛭石为3:1:1。将移栽好的苗盘，放入湿度100%的迷雾小棚中，保持2周直到嫩茎生根，且根长3cm以上，每个苗至少有3条根以上。将达到这一标准的幼苗移栽到湿度为85%的迷雾小棚中继续炼苗1周，然后逐渐降低湿度，直到可以适应普通大棚中的环境。
（7）胚培苗的移栽
将炼好苗的胚培苗移栽到营养钵中，正常管理，当胚培苗长高到50cm以上，移栽到大田。并按大田日常管理程序进行即可。
特别注意的是，步骤（1）中杂交幼果的获取时间很重要，过早幼胚培养不容易成功；过晚，幼果容易脱落。幼果消毒后，在超净工作台上准备取出幼胚前，一定要在5%的次氯酸钠中浸泡，不能只用无菌水，以确保幼果无菌。步骤（3）中获得的幼胚必须在4℃冰箱中放3周，否则胚萌发很慢，且萌发不一致，畸形苗多。步骤（5）中，胚培苗茎段在生根诱导阶段，必须暗培养一周，这是诱发根原基的基本条件，否则很难发根。
上述方法将幼胚培养技术同常规育种程序相结合，借助幼胚培养技术可以克服远缘杂交中胚败育，能够缩短育种周期的特性，迅速选育出抗性强的核桃砧木新品种，是一种高效的核桃砧木种间杂交新技术，同时实现了核桃杂交种的快速繁殖及缩短杂交育种的周期，克服了传统核桃种间远缘杂交后杂种胚的败育问题，提供了新的有效育种途径。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
Claims (2)
1.一种核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）杂交果的获得及其无菌化处理
以核桃为父本，核桃楸为母本，进行杂交，杂交60天后取幼果，并进行无菌化处理；无菌化步骤为：将幼果用流水冲洗干净；用70%酒精浸泡30秒，在20%次氯酸钠溶液中浸泡20分钟，然后浸泡在5%的次氯酸钠溶液中，放在超净工作台上备用；
（2）幼胚的获得
在超净工作台上，将幼果用无菌纸包裹，然后打开果核后，看到置于核桃顶端、夹在两片子叶间的幼胚，将幼胚取出放入有培养基的试管中，进行培养；
（3）幼胚的培养
幼胚的培养基为DKW培养基，附加植物生长调节剂6-BA 1.0mg/L，IBA 0.01mg/ L；培养条件：首先在4℃冰箱中放3周，然后在25℃条件下暗培养3周；待幼胚萌发，长出胚根和嫩茎，将胚根切去，仅留嫩茎，放培养室光照下培养，每天光照时间16小时，温度25℃；
（4）胚培苗的继代
将高为3-4cm的胚培苗截成1.5-2.0cm长的茎段，进行继代，继代培养基以DKW为基本培养基，附加植物生长调节剂BA 2.0mg/ L和IBA 0.01mg/ L；培养条件：光照下培养，每天光照时间16小时，温度25℃；
（5）胚培苗的生根诱导
将高为5-6cm继代胚培苗，插入生根诱导培养基中；生根诱导培养基以DKW为基本培养基，附加植物生长调节剂IBA 10mg/L，培养条件：暗培养一周，温度25℃；
（6）胚培苗的生根和炼苗
将生根诱导后的嫩茎，移栽到生根基质中；将移栽好的苗盘，放入湿度100%的环境中，直到嫩茎生根，且根长3cm以上，每个苗有3条根以上；将达到这一标准的幼苗移栽到湿度为85%的环境中继续炼苗1周，然后逐渐降低湿度，直到可以适应普通大棚中的环境；
（7）胚培苗的移栽
将炼好苗的胚培苗移栽到营养钵中，正常管理，当胚培苗长高到50cm以上，移栽到大田，并按大田日常管理程序进行即可。
2.根据权利要求1所述的核桃与核桃楸种间杂交幼胚培养的方法，其特征在于：步骤（6）中，生根基质配比如下，泥炭：珍珠岩：蛭石为3:1:1。
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