CN1056279C - 防治缺血性脑中风的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明发现下列式I化合物可用于防治缺血性脑中风，本发明涉及用式I化合物制备防治缺血性脑中风的药物，本发明还涉及含有式I化合物的药物组合物及其制备方法，

其中R₁、R₂、R₃可相同或不同，并且各自独立地代表氢或C_1-4烷氧基，

R₄和R₅可相同或不同，并且各自独立地代表氢或C_1-6烷基，

n代表1～12的整数。

Description

防治缺血性脑中风的药物组合物及其制备方法

本发明涉及用取代的苯甲酸酯类化合物制备用于防治缺血性脑中风的药物、用于防治缺血性脑中风的含有取代的苯甲酸酯类化合物的药物组合物及其制备方法，本发明还涉及防治缺血性脑中风的方法。

脑中风是一种发病率高的致人于死的疾病，其生存者难以完全康复，脑中风对患者身心打击及对其家人经济影响极大。仅在美国就有200万人由于脑中风而残疾，据美国心脏血管协会统计，由于脑中风所引起的治疗和生产力减少所导致的损失在1987年一年就高达128亿美元之多。

75％的脑中风属于缺血性脑中风。目前尚无有效的防治缺血性脑中风的药物。绝大部分缺血性脑中风乃因脑血管的暂时性收缩痉孪而引起，其作用机理可能是因为脑血管细胞内游离钙离子浓度(下文中称之为[Ca²⁺]i)过高和脑细胞能量消费过多所引起(Sauter等人，Neuroc hem 9：211-236(1988))。脑血管收缩痉孪导致局部脑组织缺血或停止供血。众所周知，神经细胞高度依赖血液不断提供氧气和葡萄糖以维持生命，当血流停止45分钟以上时神经细胞就会损伤和坏死，导致脑中风。据信某些Ca²⁺拮抗剂(antagonist)对缺血性脑中风有一些疗效，但其疗效十分有限(参见Nishikib等人Life Sci.43：1715-1723(1988)；Sauter等人，Neurochem，9：211-236(1988)和Fieschi等人，EuropeJ.Pharmacol.81：587-594(1982))。较近的研究指出脑血管的结构和全身其它细管的结构可能有所不同(McCaldlen等人，Am.J.Physiol，241：H129-133(1981)；Allen等人，J.Neurosurg.44：594-600(1976)；Van Breeman等人Cir.Res.46：426-429(1980))，后者的细胞内[Ca²⁺]i较多依赖细胞外Ca²⁺向细胞内的流入，而脑血管细胞内[Ca²⁺]i较多依赖于细胞内存在的Sarcoplasmic reticulum(SR)的游离，因此一般的Ca²⁺拮抗剂因基于阻断细胞外Ca²⁺向细胞内的流入而能较为有效地使脑血管以外的血管松驰，降低全身血压，但对脑血管的松驰作用不大而对缺血性中风的防治未能发生良效。而且，就算少数普通Ca²⁺拮抗剂能松驰脑血管而有利于缺血性脑中风的治疗，但由于它们也能降低血压而减少进入脑的血流量，抵消了脑血管松驰后原本可以增加血流的作用(Voldby等人，Acta.Neurcchirurgia 70：243-254(1984)；Nishikibe等人，LifeSci.43：1715-1723(1988)。

因此，用于对缺血性脑中风进行治疗的一般的Ca²⁺拮抗剂不能有效地降低脑血管细胞内[Ca²⁺]i，同时也不能以任何形式为脑细胞增加能源物质，因此不能有效地用于缺血性脑中风的防治和康复。

本发明人发现一种化合物即式I化合物，能有效地减少脑血管细胞内SR中Ca²⁺的游离，同时又能阻断Ca²⁺由脑血管细胞外向脑血管细胞内的流入，因而有效地降低脑血管细胞内[Ca²⁺]i。令人惊异的是式I化合物还能增加脑细胞的cAMP，减低高能量环腺苷酸(cAMP)的消耗，保持和恢复神经细胞生命力，使脑坏死部分复元。本发明式I化合物能有效地用于缺血性脑中风的防治。

就本申请人所知，在先有技术中，曾发现某些式I化合物对心律不齐有很好的整心作用(Chiou等人，J.pharmacol.Exp.Ther，198：444(1976)；Posner等人，Pharmacol 14：97-103(1976)；Chiou等人，Europe J.Pharmacol 81：587-594(1982))，但尚未见有关式I化合物用于防治缺血性脑中风的报道。

本发明的第一目的是提供一种防治缺血性脑中风的方法，包括给需要所述治疗的患者施用式I化合物或其可药用的酸加成盐，

其中R₁、R₂、R₃可相同或不同，并且各自独立地代表氢和C_1-4烷氧基，

R₄和R₅可相同或不同，并且各自独立地代表氢和C_1-6烷基，

n代表1～12的整数。

本发明的另一目的涉及一种用于防治缺血性脑中风的药物组合物，其中含有如上定义的式I化合物和/或其可药用的酸加成盐以及一种或多种药学上可接受的药物载体和辅助剂。

本发明的再一目的是所述药物组合物的制备方法，该方法包括将如上定义的式I化合物和/或其可药用的酸加成盐与一种或多种药学上可接受的药物载体和辅助剂混合。

本发明的再一目的涉及如上定义的式I化合物或其可药用的酸加成盐在制备用于防治缺血性脑中风的药物中的应用。

在本发明中，优选的式1化合物是其中R₁、R₂、R₃各自独立地代表氢和C_1-2烷氧基，R₄和R₅各自独立地代表氢和C_1-4烷基并且n代表1～12的整数的式I化合物或其可药用的酸加成盐。

在本发明中，更优选的式I化合物是其中R₁、R₂、R₃各自独立地代表氢和甲氧基，R₄、R₅各自独立地为甲基或乙基并且n代表1～12的整数的式I化合物或其可药用的酸加盐。

在本发明中，最优选的式I化合物是下列化合物或其可药用的酸加成盐：3，4，5-三甲氧基苯甲酸(N，N-二乙氨基)甲基酯，3，4，5-三甲氧基苯甲酸2-(N，N-二乙氨基)乙基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸3-(N，N-二乙氨基)丙基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸4-(N，N-二乙氨基)丁基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸5-(N，N-二乙氨基)戊基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸6-(N，N-二乙氨基)己基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸7-(N，N-二乙氨基)庚基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸8-(N，N-二乙氨基)辛基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸9-(N，N-二乙氨基)壬基酯，和/或3，4，5-三甲氧基苯甲酸10-(N，N-二乙氨基)癸基酯。

本发明式I化合物是已知化合物，可以按有机化学领域中常规的合成方法制备，例如按Sastry等人J.Org.Chem.23：1577(1958)中所述方法或其类似方法制备。该文献的内容并入本文作为参考。

本发明式I化合物由于其具有取代的氨基而呈碱性，它可以与任何可药用的酸形成可药用的酸加成盐，本发明范围包括式I化合物及其或药用的酸加成盐。

本发明术语“C_1-6烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，包括C_1-4烷基以及1-甲基丁基、2-甲基丁基、2-乙基丁基、正戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基等。

本发明术语“C_1-4烷基”是指具有1～4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基等。

本发明术语“C_1-4烷氧基”是具有1～4个碳原子的直链或支链的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基和叔丁氧基等。

本发明术语“C_1-2烷氧基”是指具有1～2个碳原子的烷氧基，例如甲氧基和乙氧基。

式1中“-(CH₂)_n-”是指具有1～12个(优选1～10个)碳原子的任意被C_1-2烷基取代的直链或支链的亚烷基，例如是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、亚十一烷基、亚十二烷基，以及所述基团在不同碳位上被C_1-2烷基取代的基团，如2-甲基-亚戊基，3-乙基-亚己基等等。

在本发明中，“TMB”是指本发明中R₁、R₂和R₃均为甲氧基并且R₄和R₅均为乙基的式I化合物，根据n数值的不同，而称之为TMB-n，例如TMB-2是指3，4，5-三甲氧基苯甲酸2-(N，N-二乙氨基)乙酯，TMB-5是指3，4，5-三甲氧基苯甲酸5-(N，N-二乙氨基)戊酯，TMB-8是指3，4，5-三甲氧基8-(N，N-二乙氨基)辛酯；及其可药用的酸加成盐。

本发明术语“可药用的酸加成盐”是指本发明化合物与“可药用的酸”形成的适于药学应用的盐，所述盐也包括在本发明范围内。用于生成所述盐的“可药用的酸”包括无机酸和有矾酸。典型的无机酸包括盐酸、氢溴酸氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、连二磷酸等。也可以应用由有机酸生成的盐，有机酸例如是脂肪族一或二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸和羟基链烷二酸，以及芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等等。所述可药用的盐包括乙酸盐、苯基乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、

-2-苯甲酸盐、溴化物、异丁酸盐、苯基丁酸盐、β-羟基丁酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、乙炊-1，4-二酸盐、癸酸盐、辛酸盐、氯化物、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、富马酸盐、羟基乙酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、异烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磺酸盐、苯磺酸盐、对溴苯磺酸盐、氯代苯磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、甲磺酸盐、

-1-磺酸盐、

-2-磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐等。优选的盐是盐酸盐。

可药用的酸加成盐一般可通过式I化合物与等摩尔或过量的酸反应制得。反应物通常于常规有机溶剂如苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或乙醚中或者在水中进行反应。盐一般在约1小时～10天内从溶液中析出，并且可以经过滤分离，或者按常规方法除去溶剂。

如上述讨论的那样，式I的化合物和/或其可药用的酸加成盐可用于防治哺乳动物的缺血性脑中风。此方法包括给需此治疗的哺乳动物(优选人)施用足量的一种或多种式I化合物，以获得所需治疗或预防作用。该化合物可通过多种途径施用，包括口服、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌内或鼻腔内等途径。口服途径是优选的。无论选择什么途径施用，该给药方式最好是借助药物组合物完成，这些药物组合物是运用药物科学领域熟知的技术制备的。

在制备这些组合物中，常将一种或多种活性成分与载体混合，或用载体稀释，或包封在诸如胶囊、香囊、纸状或其它容器中。当载体用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体物质，它作为该活性成分的载体，赋形剂或介质。因此，该组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、香囊剂、扁囊剂、酏剂、悬浮液剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌注射液及无菌包装的粉针剂。其中口服剂型是最优选的。

适宜的载体、赋形剂和稀释剂是无毒的药学上适用的载体、赋形剂和稀释剂，其实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄耆胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、糖浆、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯或丙酯类、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等等。该制剂另外可包括润滑剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或芳香剂，这些添加剂对于本领域普通技术人员都是熟知的。通过使用本领域熟悉的方法可配制该组合物，以使该组合物施用后给患者提供速释、缓释或延迟释放的该活性成分。缓释制剂可以这样构成，即使得它们最好在肠道的特定部位或者其它特定的给药部位，在一定时间内连续释放活性成分，并在一定时间内维持有效的血药浓度，例如可将本发明的活性成分制成包衣小丸的胶囊剂或制成包衣颗粒，或将活性成分包藏在溶蚀性骨架材料或亲水性胶体物质中，或者利用离子交换树脂或多孔性载体及海绵通道型载体材料配制制剂，这些制剂技术都是本领域普通技术人员熟知的，可参见任何有关药剂学教科书和手册。

优选以单位剂量形式配制该组合物，这样每剂含有约1～1000mg、更经常是约25～500mg的活性成分。术语“单位剂量形式”指适宜用于人或其它哺乳动物单次剂量使用的物理独立单元，每单位含有依计算产生所需防治效果的预定量的活性成分，以及一种或多种适宜的稀释剂、赋形剂或载体。

口服制剂是本发明组合物的优选剂型。所用载体或赋形剂是如上文所述的任何药学上无毒的适宜物质。口服制剂包括溶液剂、悬浮液剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂和片剂等，其中包括缓释剂型等。这些制剂可含有1～95％、优选1～10％(重量)的活性药物成分。非胃肠道给药剂型也是本发明优选的剂型，包括注射给药例如皮下注射、肌内注射或静注等所用制剂，例如是溶液剂、乳剂或悬浮液剂，或者是粉针剂，其在注射前即时配制成便于注射用的溶液剂、乳剂或悬浮液剂，其适当的溶剂或载体包括无菌水、生理盐水、葡萄糖、甘油、酒精等，如果需要也可加入其它药学上适用的添加剂如表面活性剂、乳化剂、缓冲剂(如乙酸钠、三乙醇胺等)。所述口服制剂，包括片剂、胶囊剂、粒剂、丸剂、粉剂等在内，均可以制成缓释制剂，例如按Ariens等人，Drug Design，VolIV p37-73，Academic Press，New York and London，1973中所述方法制成多聚物树脂珠粒、多孔性载体型或海绵通道型制剂等等，上述文献内容并入本文作为参考。本药也可用植入法给药，使药品在缓慢恒定的速度下释放活性成分，有关植入法给药及其剂型可参见Ueno等人专著Controlled Drug Delivery Vol.II，chap 4，CRC Pressed，1983，该文献有关内容并入本文作为参考。上述制剂包括口服制剂和非胃肠道给药的制剂的制法对于本领域普通技术人员是熟知的，可参见Remington′s PharceuticalSciences，Mack Pull.Co.Easton PA，15th版，1975。

为防治缺血性脑中风所应用的本发明式I化合物的具体剂量将取决于由主治医师决定的疾病的严重程度、给药途径以及有关因素，对于口服给药的本药剂量大致为1～50mg/kg体重，预防给药时可在中风前分成一天3次给药即每6小时给药一次；中风发作后应多次给药，例如每4～8小时给药一次，维持3～10天，通常是每6小时给药一次共给5～7天左右。非胃肠道途径给药例如注射给药剂量为0.1～20mg/kg体重，给药次数和时间与口服给药相似。至于植入法缓释给药，可将本药调制成释放剂量为0.1～20mg/kg/天，可在中风前植入，也可在中风后植入以防止眼盲的发生，新的植入物可在每3～10天植入一次而维持到60天左右，最常用剂量是每5～7天植入一次并维持30天左右。

本发明式I化合物的效用及其药理学特性可通过下述附图和药理实验进一步说明和证实。

图1表示的是本发明化合物对缺血性大脑坏死的效果，大脑经TTC染色。图A是对照组大脑；图B是经TMB-2治疗的大脑；图C是经TMB-5治疗的大脑；图D是经TMB-8治疗的大脑。

图2是指由50mM KCl刺激后细胞内钙离子浓度增加的时间过程。180秒处的箭头是指加入50mM KCl。每一数值点代表均值±SEM(n＝6)。

图3表示TMB-2对细胞内钙离浓度的影响。200秒处的箭头是指加入0.1mg/ml TMB-2，而400秒处的箭头是指加入50mM KCl。图示结果表明TMB-2抑制高浓度KCl所增加的钙离子向细胞内的流入。每一数值点代表均值±SEM(n＝6)。

图4表示TMB-5对细胞内钙子浓度的影响。200秒处的箭头是指加入0.1mg/ml TMB-5，而400秒处的箭头是指加入50mM KCl。图示结果表明TMB-5抑制由于注入高浓度KCl导致的钙离子经L-型钙离子通道的进入。每一数值点代表均值±SEM(n＝6)。

图5表示TMB-8对细胞内钙离子浓度的影响。200秒处的箭头是指加入0.1mg/ml TMB-8，而400秒处的箭头是指加入50mM KCl。图示结果表明TMB-8不仅阻断由于高浓度KCl所增加的钙离子的流入，而且还降低细胞内游离的钙离子浓度。每一数值点代表均值±SEM(n＝6)。

药效学实验及其方法

实验所用TMB化合物按Sastry等人，J.Org.Chem.23：1577(1985)所述方法合成制得，这些TMB皆可溶于水，在使用时临时配制成水溶液。TTC(氯化2，3，5-三苯基四唑翁)、Dowex 50w、三氯醋酸、cAMP(环腺苷酸)、牛血清蛋白和Fura-2-AM皆购自Sigma化学化司(ST.Louis，Mo)。[3H]-cAMP(28.9 Ci/mmol)购自NEW(Du Pont，Boston，MA)。大鼠缺血性脑中风模型

按Chen等人，Stroke 17：738～743(1986)所述类似方法产生并测定大脑皮层的梗死形成：将体重250～350g的Long Evans大鼠用100g/kg盐酸氯胺酮(Parke-Davis)肌注麻醉，将两侧颈总动脉分离后，将右颈总动脉永远结扎，然后把颞骨打开以暴露出颧骨和Squamosal骨，用微手术法用牙科钻在颧骨和Squamosal骨的前边连接处后方1mm处打开一个2mm的洞。之后用第11号的手术刀将脑膜细心地穿刺以免刺到大脑。然后用0.10mm×0.06mm的夹子把脑中间动脉(MCA)暴露出来，并加热封死，之后使伤口止血，并用浸有50 IU/ml青霉素的生理盐水的棉花盖住。之后把左颈总动脉(CCA)暂时压扎停止血流60分钟。将TMB-2、TMB-5和TMB-8溶解在PBS中，于结扎止血前1小时和结扎止血后0、1、6小时以2mg/kg的剂量进行腹膜内注射。手术后3天，将动物断头活杀，并迅速取出全脑，并将全脑放入新配制的2％TTC生理盐水中，在37℃维持2小时进行染色。之后，将该已染色的全脑放入10％福尔马林溶液中，缺血坏死的大脑表面面积变成白色。进行6倍放大照相用以测量其面积。实验结果参见表1。

表1  经TTC染色后大脑坏死面积的定量

药物	坏死面积(mm2)
					CCA闭塞后给药时间-1小时             0小时           1小时              6小时
	对照	216.3±6.1	216.3±6.1	216.3±6.1					216.3±6.1
TMB-2					10.2±4.5*	4.5±2.4*	6.3±2.1*	37.2±4.7*
	TMB-5	1.2±0.7*	0.8±0.4*	7.2±2.6*					47.7±4.5*
TMB-8					16.7±5.2*	4.3±1.8*	6.0±1.9*	19.5±2.8*

*与对照组比较，p＜0.01。

在左颈总动脉(CCA)闭塞60分钟后，经腹膜内注射给药TMB-2、TMB-5和TMB-8(2mg/kg)。所有数值均以均值±SEM(n＝6)表示。

当MCA被闭塞60分钟后，大致有一半的脑会部分坏死(216mm2)(表1，图1A)。当2mg/kg之TMB-2，TMB-5和TMB-8在MCA被闭塞前一小时给药时，大脑坏死面积几乎完全消失到对照脑的5％、1％和8％左右(表1及图1B、1C、1D)。将TMB-2、TMB-5和TMB-8在MCA闭塞的0小时和1小时后给药时所得的结果和MCA闭塞前1小时给药结果相似(表1)，不过在MCA闭塞后6小时才给TMB-2、TMB-5和TMB-8时大脑坏死的面积就不被完全地打消而分别有17％、22％和9％坏死的面积出现(表1)，由此可知本发明化合物预防给药可有效地防止缺血性脑中风的发生，在中风后尽早给药可有效地治疗并有利于康复。给药时间拖长后(＞6小时)其药效就大为减弱。细胞培养

从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)购得大鼠胚胎大动脉衍生的稳定细胞系A7r5。将这些细胞在补充有10％胎牛血清、3.8mM L-谷氨酰胺、50 IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素的Dulbecco′s改性的Eagle′s培养基(GLBCO，Grand Island，NY)中培养。将培养物保持在温度为37℃、湿度为100％的内含5％CO₂～95％空气的保温箱中培养，并在2～3天更换一次培养基。细胞在6孔培养板(Costar牌)上进行传代培养以用于cAMP测定，或者在9×22mm玻璃盖片上培养以用于测定细胞内钙离子浓度。细胞内cAMP的测定

用三氯醋酸将cAMP由其它核酸物中分离并用Dowex 50w树脂(200-400目)精制(Fong等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.181：1385-1391(1991)后，采用cAMP蛋白结合测定法测定细胞内cAMP(Brown等人，Adv.Cyclic Nucleotide Res.2：25-40(1972))。简述之，在按上述方法得到的单层A7r5细胞培养物中加入0.1mg/ml的TMB-2、TMB-5、TMB-8或对照液，保持1小时。随后用含有128mM NaCl、4.7mM KCl、1.25mM CaCl、1.25mM MgSO₄和10mM磷酸钠的KRP缓冲液(pH7.4)洗涤3次，再将细胞在1ml 10％三氯醋酸中均浆并于12000g离心5分钟。将上清液倒入Dowex 50w树脂上分离三氯醋酸及其它核酸物质。向液体样品中加入500cpm的[³H]-cAMP作为内标，之后用Brown等人(1972)所述蛋白结合法测定cAMP浓度。按Lowry等人，J.Boil.Chem.193：265-275(1951)所述方法测定蛋白本身。实验结果参见表2。

表2  本发明化合物对A7r5细胞内cAMP的显著效果

药物(0.1mg/ml)	cAMP(ρmol/孔)
		对照	13.9±0.6
TMB-2	51.5±2.4*
		TMB-5	50.0±1.6*
TMB-8	44.1±1.4*

*与相应的对照组比较，P＜0.01。

将细胞在含有TMB的培养基中培养1小时后，测定cAMP。所有数据均以均值±SEM(n＝6)表示。

令人惊异的是本发明化合物能使A7r5细胞内cAMP显著提高(表2)。因此本发明化合物在脑细胞短暂性缺血时能增强其能源供应，有利于脑中风的预防和康复。细胞内钙离子浓度的测定

按Yates等人，J.Neurosci.Res.32：255-260(1992)所述类似方法测定细胞内钙离子浓度。将长满A7r5单层细胞的9×22mm玻璃盖片用含有128mM NaCl、4.7mM KCl、1.25mMMgSO₄和10mM磷酸钠的对照缓冲液(pH7.4)洗涤两次后将其放入含有5μM Fura-2-AM和0.25％牛血清蛋白的同一缓冲液中于37℃培养60分钟，当细胞充足了Fura-2-AM后，将玻璃盖片用对照缓冲液洗涤并放入到含有3ml对照缓冲液的Cuvette内，用萤光光谱仪(Hitach F-4010；Hitachi Koki Co.；Japan)测定钙值，测定时把玻璃盖片放成与激发光光路交叠成30°角。在340nm或380nm光波下激发细胞，并在发射萤光波长510nm处分析钙量。在对照缓冲液平衡180秒后加入1mMCaCl₂，再在180秒后用340nm和380nm光波激发之。在此情形下，自动萤光会被20mM Mn²⁺所吸收，因而可以测定其中细胞内钙离子浓度并以在340nm和380nm下测得的萤光比值表示(在附图中表示为比值(340/380))。

50mM的KCl能明显增加细胞内[Ca²⁺]i(图2)，这个现象可被TMB-2和TMB-5部分抵消(图3和图4)，TMB-8作用最强大，它不但能降低细胞内[Ca²⁺]i，还能完全抵消由KCl所引起的细胞内[Ca²⁺]i的增加作用(图5)。这些结果明白地表明本发明化合物是Ca²⁺拮抗剂，能有效地降低脑血管细胞内[Ca²⁺]i，导致脑血管松驰，增加血流，减少脑动脉坏死。

下面是本发明制剂的说明性的一些具体实施例，应当明白，本发明制剂绝不仅限于此，并且它不以任何方式限制本发明的范围，如上文所述，通过阅读本申请，参照或模仿本发明方法，本领域普通技术人员能作出各种变化，将本发明化合物制成适于各种给药方式的各种制剂，所有这些制剂均包括在本发明范围内。制剂中活性成分是指本发明式I化合物或其可药用的酸加成盐，例如TMB-8或TMB-5。

            实施例1  片剂

成分                      量(mg/片)

活性成分                   120mg

微晶纤维素                 120mg

二氧化硅                   50mg

硬脂酸镁                   15mg

将上述成分混合并压制成片剂。

              实施例2  片剂

成分                       量(mg/片)

活性成分                    120mg

淀粉                        45mg

微晶纤维素                  35mg

聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液)  4mg

羧甲基纤维素钠              4.5mg

硬脂酸镁                    0.5mg

滑石                        1mg

将活性成分、淀粉和纤维素通过45目网筛，并充分地混合，使聚乙烯吡咯烷酮溶液与得到的粉末混合，过筛并于50～60℃干燥并再过18目筛。将预先通过60目网筛的羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁和滑石加到颗粒中，混合以后压制成片。

            实施例3  胶囊剂

成分                量(mg/粒)

活性成分             120mg

羟丙基甲基纤维素     150mg

硬脂酸镁             9mg

将上述成分混合制粒，通过45目网筛，并将其装入硬明胶胶囊中。

            实施例4  锭剂、胶囊剂

成分                 量(mg/粒)

活性成分              120mg

乳糖                  180mg

将上述成分混合制粒，通过45目网筛，然后装入胶囊中，或者制成锭剂。

            实施例5  粉针剂

成分               量(mg/安瓿)

活性成分             120mg

注射用水             6ml

将活性成分和注射用水分装在两个独立的安瓿瓶中，在给药前混合溶解，用于注射。

            实施例6  悬浮液剂

成分                 量(mg/3ml)

活性成分               120mg

羧甲基纤维素           3mg

糖浆                   适量

调味剂、着色剂         适量

注射用水        加至   3ml

将活性成分与羧甲基纤维素和糖浆混合，调成糊状。用一些水将适量调味剂、着色剂稀释，然后搅拌下加入足量水至3ml。

Claims (5)

1.式I化合物或其可药用的酸加成盐在制备用于防治缺血性脑中风的药物中的应用，

其中R₁、R₂、R₃可相同或不同，并且各自独立地代表氢和C_1-4烷氧基，

R₄和R₅可相同或不同，并且各自独立地代表氢和C_1-4烷基，

n代表1～12的整数。

2.根据权利要求1的应用，其中

R₁、R₂、R₃可相同或不同，并且各自独立地代表氢和C_1-2烷氧基，

R₄和R₅可相同或不同，并且各自独立地代表氢和C_1-4烷基，

n代表1～12的整数。

3.根据权利要求1的应用，其中R₁、R₂、R₃各自独立地代表氢和甲氧基，R₄和R₅各自独立地为甲基或乙基，n代表1～12的整数。

4.根据权利要求1的应用，其中式I化合物是下列化合物或其可药用的酸加成盐：

3，4，5-三甲氧基苯甲酸(N，N-二乙氨基)甲基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸2-(N，N-二乙氨基)乙基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸3-(N，N-二乙氨基)丙基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸4-(N，N-二乙氨基)丁基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸5-(N，N-二乙氨基)戊基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸6-(N，N-二乙氨基)己基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸7-(N，N-二乙氨基)庚基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸8-(N，N-二乙氨基)辛基酯；

3，4，5-三甲氧基苯甲酸9-(N，N-二乙氨基)壬基酯；和/或

3，4，5-三甲氧基苯甲酸10-(N，N-二乙氨基)癸基酯。

5.根据权利要求1的应用，其中所述可药用的酸加成盐是盐酸盐。

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