CN105624302A - 用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于节肢动物多样性高通量测序复合标签及其应用，复合标签的序列如编号NO.1～NO.48所示。标签的应用方法包括：提取每一个样本的总DNA；对每一个样本，从48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量；将所有样本等量混合后建立一个基因文库；对所建基因文库进行高通量测序。本发明提高超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中整个稻田生态系统中节肢动物种群，为探明稻田中节肢动物多样性研究提供高通量分析途径。

Description

用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其应用

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其应用。

背景技术

可持续的害虫调控是21世纪害虫综合治理的发展方向，也是农业可持续发展的要求(Altieri，2004)AltieriMA.Biodiversityandpestmanagementinagroecosystems(2ndedition).NewYork:FoodProductsPress,2004:203-224。农田节肢动物生物多样性研究是害虫可持续治理中非常重要的基础性工作(Bahaar&Bhat,2011)BahaarSWN,BhatGA.CommunityorganizationanddistributionofLepidopterainthericefieldsofKashmirIndia.AsianJournalofBiologicalSciences,2011,4(7):563-569。但在生物多样性调查中，生态系统中种类的鉴定是一个复杂而艰难的工作，传统的分类方法存在许多的不足，DNA条形码技术的发展和普及为物种分类鉴定工作提供了新的快速有效的研究方法和手段(FrézalandLeblois,2008)FrézalL,LebloisR,2008.FouryearsofDNAbarcoding:currentadvancesandprospects.InfectionGeneticsandEvolution,8(5):727-736，也极大地促进物种分类，特别是节肢动物分类的发展(Miller,2007)MillerSE，2007.DNAbarcodingandtherenaissanceoftaxonomy.PNAS,104(12):4775-4776。因此，利用节肢动物独特的线粒体基因组细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)为靶标序列(Hebert等，2003.HebertP,eta1.,2003.BiologicalidentificationsthroughDNAbarcodes.ProceedingsoftheRoyalSociety,270(1512):313-321)，用PCR扩增的方法从复杂样本中富集稻田节肢动物DNA，利用所扩增序列代表种的特异性来检测环境样本节肢动物多样性，成为一种非常有效的方法。

本发明所指的节肢动物线粒体基因组细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)微型条形码区域是指稻田生境中全部节肢动物COI微条形码序列的总和，为研究节肢动物多样性与环境之间的关系提供了一条新的思路。

在动物分类领域，DNAbarcoding采用的标记基因主要是线粒体COⅠ基因；该基因在引物对应部分比较保守，其它序列部分变异相当大，并且容易利用通用引物进行PCR扩增；同时在近缘种间，这段基因的差异也足够大，因此适合作为动物分子鉴定的标记，也是目前在动物分子生态学上应用最广泛的分子标记。线粒体DNA(mtDNA)结构简单、几乎不发生重组、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点，被公认为是研究动物系统发育的重要标记。线粒体基因组包括13个蛋白质编码基因，2个rDNA基因，22个tRNA编码基因和一个非编码区。最常见于物种鉴定研究的mtDNA基因是细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)和16SrRNA基因。由于COI基因具有相对高的种间变异和低度的种内变化，以及相当长的变化序列，又容易扩增，使得COI成为能够鉴别密切相关的物种的重要DNA条形码之一。

发明内容

本发明提供一种用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其应用，提高超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中所含稻田节肢动物种群，为探明稻田节肢动物多样性提供高通量分析途径。

该种用于稻田生态系统节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其碱基序列如下序列编号NO.1～NO.48所示。

本发明复合标签的每一条序列均由左侧8-12个碱基组成具唯一性序列和右侧23～27个源于细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)的序列所组成。其中，右侧23～27个源于COI的序列具有一定的简并性，序列中的R为A或G；S为C或G；W为A或T；Y为C或T。

表1复合标签序列。

本发明还提供一种节肢动物生物多样性高通量基因测序方法，包括如下步骤：

(1)提取每一个样本的总DNA；

(2)对每一个样本，从所示48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；

(3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；

(4)对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量；

(5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库；

(6)对所建测序文库进行高通量测序。

本发明所述稻田节肢动物细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列是指所有落在动物线粒体基因组COI基因之间的区域的总和，复合标签如表1所示；利用表1的稻田节肢动物细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列复合标签可达到在一次超高通量测序中同时对1～48个样本中的稻田节肢动物COI基因序列进行检测。

利用目前超高通量测序自身提供96种测序标签(8-12个碱基)，可做96个样本，但需在超高通量测序前先对96个样本分别建96个测序库，然后等量混合成1个再同时测序，而本发明只需建1个库就能对48个样本同时测序。如果将测序自带的96个标签和本发明的48个复合标签结合使用，则同时可对96×48个样本的稻田节肢动物细胞色素C氧化酶序列进行超高通量测序。

步骤(1)中对每个样本总DNA提取采用通用提取方法。

步骤(2)中对每一个样本从表1所示48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物，其选择原则具体为：确定每一样本的编号，对每一个编号样本，从表1中选择一序列编号所对应的序列1和序列2(NO.1的序列1和序列2为一对，NO.2的序列1和序列2为一对，NO.3的序列1和序列2为一对，以此类推)，确定每一个样本的一对序列；每个编号的样本可选表1中48对中的任何一对，但要求不同编号的样本之间从表1选择时不要重合，即不同编号样本不选择同一个复合标签。

步骤(2)中对对应样本的总DNA进行扩增的扩增体系为：

PCR扩增的50μL体系中含：1μL样本总DNA，25μL2×Buffer，10μLdNTP，1μLKODFX酶，浓度为10μM引物各5μL，补水至50μL。

PCR扩增程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，45℃退火30s，68℃延伸30s，31个循环；68℃10min；产物4℃保存。

步骤(3)中对每个样本扩增产物进行纯化回收采用通用的PCR产物回收试剂盒。

步骤(4)中DNA精确定量使用Lifetechnologiesinvitrogen的dsDNAHSAssay试剂盒或分光光度计。

本发明所述高通量测序采用基于IonProton第二代超高通测序仪的测序平台进行。

优选地，步骤(5)中建库所用建库试剂盒为IonProton第二代超高通测序仪对应的IonXpress^TMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation试剂盒。

步骤(6)中测序时扩增所用扩增试剂盒为IonProton第二代超高通测序仪对应的IonPI^TMTemplateOT2200KitV3试剂盒。

步骤(6)中测序时测序所用测序试剂盒为IonProton第二代超高通测序仪对应的IonPI^TMSequencing200KitV3试剂盒。

所述样本为含节肢动物的样本。

与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：

稻田生态系统中存在大量的节肢动物种类，这些种类的种群组成、群落结构与稻田生态系统的稳定性以及对外界环境变化和人类活动影响的抵抗力有密切关系。传统方法上，对稻田生态系统节肢动物多样性的研究基本在于田间调查，用传统的分类方法鉴定。本方法以稻田系统中节肢动物为研究对象，基于宏基因组学的研究思路，采用本方法所述的序列，建一个库最多可对48个样本同时进行超高通量测序，进行基于宏条形码的稻田生态系统中生物多样性的研究，为稻田生态系统的稳定性提供基础，也为各种生态系统中生物多样性的研究提供参考方法。

附图说明

图1是实施例4中1～24号样本PCR扩增产物电泳检测结果图；

图2是实施例4中25～48号样本PCR扩增产物电泳检测结果图。

其中，M表示DNAMarker，条带从下往上大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2500bp。

具体实施方式

实施例1

稻田节肢动物样本总DNA的提取可以参照CTAB方法。主要步骤如下：

(1)水浴锅预热至65℃，CTAB裂解液预热至65℃；

(2)取适量样品，用液氮研磨样品，直至粉末。移到1.5ml离心管中，每管加600μLCTAB裂解液，65℃温浴1.5h左右，期间轻轻摇晃几次；

(3)加入等体积氯仿，轻轻摇匀，水平摇床摇15～20min；12000g离心10min；

(4)取上清液(不要吸到中间层)移到另一离心管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶l)，摇匀，水平摇床摇15～20min；12000g离心10min；

(5)取上清液(不要吸到中间层)移到另一离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶l)；摇匀，水平摇床摇15～20min；12000g离心10min；

(6)取上清液移到另一离心管中，加lmL于-20℃预冷的异丙醇和0.1倍NaAc(3M，pH5.2)混匀，放入-20℃沉淀DNA30min左右；12000g离心10min；

(7)倒掉异丙醇(倒时小心不要把DNA倒掉)，直接加入1mL75％乙醇洗涤；8000g离心5min；倒掉乙醇(倒时小心不要把DNA倒掉)；

(8)室温自然风干，至无乙醇为止；加入50μLddH₂O溶解；检测DNA浓度和质量。

DNA提取液组成：100mMTris，100mMEDTA，200mMNaCl，2％PVPP，3％CTAB，pH9.0。

实施例2

以12个样本为例实施。

(1)将12个样本从1至12编号，从表1中1至48序列中选取12个复合标签与12个样本对应，本实施例中选取的是表1中的1到12号，交相关序列合成公司进行合成；再用无DNA酶的水稀释合成的序列至10μM；表1中所选的序列号关联给相应的样本编号，如表2。

表2样本与复合标签对应表。

(2)PCR扩增：取12个200μLPCR管，每管对应一个样本，并用上述样本编号对应的序列编号中的序列1和序列2为PCR扩增的引物。PCR扩增的50μL体系中含：1μL样本总DNA，25μL2×Buffer，10μLdNTP，1μLKODFX酶，浓度为10μM引物各1.5μL，补水至50μL。

PCR扩增程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，45℃退火30s，68℃延伸30s，31个循环；68℃10min；产物4℃保存。

(3)吸取5μL上述PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳(1.5％，预加荧光显色剂)。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入紫外观测仪上观察电泳结果，成功的PCR反应经电泳检测可获得分子量分布在230bp至260bp间的扩增产物。

实施例3

利用通用的Beckman的AgencourtAMPureXP试剂盒纯化PCR扩增产物，步骤如下：

(1)在1倍体积的PCR反应物中加入1.8倍体积的AgencourtAMPureXP，用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

(2)将上述混合液放在磁力架上，吸附2min(或更长时间)使磁珠与液体分开至液相清澈透明；去除液体，注意不要碰到磁珠(可留5μL液体)；

(3)吸取200μL70％的新鲜酒精清洗离心管(如果上步骤中液体总体积超过200μL，加入的酒精量至少等于总体积)，30秒后吸出酒精。此步骤重复三次；

(4)等酒精风干后，从磁力架上取下离心管，加入60～100μLElutionBuffer或ddH₂O，用移液器吹打10次使液体均匀，室温放置2min或更长时间。

(5)将离心管放回磁力架，吸附1min，所得液体即为高纯度DNA。

将纯化后的PCR扩增产物用Lifetechnologiesinvitrogen的dsDNAHSAssay试剂盒精确定量，并用水调整至体积为70μL的溶液内DNA总量为50ng；

用IonProton第二代超高通测序仪对应的IonXpress^TMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation试剂盒进行建库；

用IonProton第二代超高通测序仪对应的IonPI^TMTemplateOT2200KitV3试剂盒和IonPI^TMSequencing200KitV3试剂盒进行序列扩增和PI芯片进行测序，并将12个复合标签序列信息输入高通量测序仪所用的测序方法中，高通量测序仪就会依据输入的序列信息，归类相应的样本数据。按照上述测序方法获得的测序结果表明，高通量测序仪能依据各样本对应的复合标签序列，将混合在一起的测序数据有效地能归类出12个样本各自的测序结果，达到了复合标签应用的目的。

对于其他任意样本数量的测序方法同实施例2和实施例3。

实施例4

对48个样本同时进行测序，将表1中48个复合标签全部使用，其余方法同实施例1到实施例3。

成功的PCR反应经电泳检测可获得分子量分布在230bp至260bp间的扩增产物，电泳结果如图1和图2所示，48个样本的PCR反应全部成功。

表3超高通量测序结果分析。

高通量测序仪能依据各样本对应的复合标签序列，将混合在一起的测序数据有效地能归类出48个样本各自的测序结果，达到了复合标签应用的目的(表3)。

Claims (4)

1.一种用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签，其特征在于，其碱基序列如以下序列编号NO.1～NO.48所示：

。

2.一种利用权利要求1所述复合标签进行超高通量基因测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取每一个样本的总DNA；

(2)对每一个样本，从权利要求1中所示48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；

(3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；

(4)对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量；

(5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库；

(6)对所建测序文库进行高通量测序。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述样本为含有节肢动物的环境样本。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，对对应样本的总DNA进行扩增的PCR扩增体系为：

1μL样本总DNA，25μL2×Buffer，10μLdNTP，1μLKODFX酶，浓度为10μM上下游引物各5μL，补水至50μL。