CN105624158A

CN105624158A - 一种用于抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的基因序列

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Publication number: CN105624158A
Application number: CN201610051278.0A
Authority: CN
Inventors: 施朝龄; 于长海; 王金辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2016-06-01

Abstract

本发明公开了一种用于抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的基因序列，该基因序列为抑制MCP-1？基因表达的双链siRNA。所述siRNA分子的DNA模板由下述核苷酸序列的正义链的和反义链组成：正义链：5′-aaaGTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA-3′；反义链：3′-CAGTGGACGACAATATTGAAGTGGTTaaaa-5′。将双链siRNA分子的DNA模板连接到pFIV-H1/U6-siRNA载体上，与转染试剂混合后，再转染到PC-3M前列腺癌细胞中，从而实现抑制前列腺癌细胞侵袭和转移相关蛋白的高表达。

Description

一种用于抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的基因序列

技术领域

本发明涉及医用生物技术和癌症治疗领域，具体涉及一种用于抑制前列腺癌细胞侵袭和转移，促进前列腺癌细胞凋亡的基因序列。

背景技术

在美国，前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，并且成为因罹患肿瘤导致患者死亡第二位原因。在我国，随着社会人口的老龄化出现，前列腺癌的发病率也逐年增高。前列腺癌发生骨转移后目前无有效治疗方法。2009年美国新发前列腺癌病例约192280例，患者死亡约27360例。

在过去的10年间，前列腺癌的治疗出现了新的思路，由以往只注重肿瘤治疗本身而改变为既治疗肿瘤，同时又注重调节患者体内微环境。前列腺癌细胞和患者机体微环境内不同的细胞相互作用后，肿瘤细胞的生长得以增强，这一过程以破骨细胞的加入更为显著。这种肿瘤生长的过程是与患者自身产生的细胞因子类和炎症趋化因子类物质有关系的。

单核细胞趋化蛋白-1(MonocyteChemoattractantProtein-1，MCP-1)也称趋化因子配体2(Chemokineligand2，CCL2)，被认为是和骨转移发生有着最密切的关系，在促进肿瘤发生和转移方面具有独特的机制：1)直接方面，促进肿瘤细胞生长、存活、侵袭和迁移；2)间接方面，在肿瘤微环境下调节单核细胞系如巨噬细胞和破骨细胞。另外，MCP-1与其受体(CCR2)结合后可通过细胞的自分泌和旁分泌行为诱导前列腺癌细胞发生增殖、迁移和侵袭。MCP-1通过PI3K/AKT相关机制激活survivin基因，从而降低前列腺癌细胞的凋亡率。

双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。双链RNA经酶切后会形成很多小的片段，通常称为siRNA，这些小片段可以与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，能导致mRNA失去功能，使其不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。

目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果使病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达因“共抑制”现象也同时被阻断。

双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP(RNA-directedRNApolymerase，以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶)的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。siRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。另一方面结合的产物以siRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。

因此，如果能利用RNAi技术，涉及特异性针对MCP-1基因的siRNA，彻底研究清楚MCP-1和前列腺癌转移的组织间的关系，将会为前列腺癌癌相关的癌症的治疗提供一种有益的途径。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种抑制MCP-1基因表达的双链siRNA分子。所述的双链siRNA分子的DNA模板由下述核苷酸序列的正义链的和反义链组成：

正义链：5′-aaaGTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA-3′；(SEQIDNO:1)

反义链：3′-CAGTGGACGACAATATTGAAGTGGTTaaaa-5′。(SEQIDNO:2)

上述siRNA干扰的靶序列位于MCP-1基因的mRNA编码序列的位置为167-192，寡核苷酸序列为GTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA。

本发明还提供上述siRNA的siRNA重组表达载体，所述表达载体为pFIV-H1/U6-siRNA，表达载体与siRNA的DNA模板连接，构建得到重组表达载体pFIV-H1/U6-MCP-1siRNA。

将上述构建得到的pFIV-H1/U6-MCP-1siRNA重组表达载体与大肠杆菌JM109感受态细胞进行载体转化、提纯，然后进行PCR扩增，得到该重组载体，所述重组载体序列为SEQIDNO:3。

本发明还提供上述siRNA在抑制MCP-1基因表达中的应用。

本发明还提供上述siRNA重组表达载体及重组载体在制备治疗前列腺癌药物中的应用。

本发明将上述siRNA重组载体与转染试剂混合后转染到宿主细胞，所述宿主细胞为PC-3M前列腺癌细胞，从而实现抑制前列腺癌细胞侵袭和转移相关蛋白的高表达。

本发明的有益效果：本发明使用RNA干扰技术，成功获得针对MCP-1基因的siRNA，所述siRNA与pFIV-H1/U6-siRNA载体连接，与转染试剂混合，再转染到PC-3M前列腺癌细胞中，能显著抑制前列腺癌细胞MMP-9和VEGF前列腺癌侵袭相关蛋白的表达，促进Caspase-3前列腺癌细胞凋亡相关蛋白的高表达。

附图说明

图1为pFIV-H1/U6-siRNA双启动子载体结构示意图。

图2为RT-PCR法检测各组细胞MCP-1、MMP-9、VEGF、Caspase-3mRNA表达。

图3为Westernblot检测各组细胞MMP-9、VEGF、Caspase-3蛋白表达量。

具体实施方式

一、主要实验材料和仪器

1、载体、菌株和细胞株

pFIV-H1/U6-siRNA载体；大肠杆菌JM109菌株、人前列腺癌PC-3M细胞株(吉林大学前列腺疾病研究中心)；其中，PC-3M细胞用添加了10％胎牛血清的IMDM培养液培养，培养条件：37℃和5％CO2。

2、主要仪器设备

-80℃低温冰箱MDF-U50V(日本SANYO公司)；超净工作台YZ-875(苏州净化设备厂)；恒温水浴箱(江苏常州国华仪器厂)；低温高速离心机GRX-220(日本TOMY公司)；全自动CO2恒温培养箱(日本SANYO公司)；去离子水装置WG270(日本YAMATO公司)；Tanon凝胶成像系统2500R(上海天能科技有限公司)；蛋白垂直电泳及转膜装置(美国Bio-Rad公司)；超声波细胞粉碎机VCX130PB/VCX105PB(美国Sonics公司)；低速水平摇床(江苏常州国华仪器厂)；恒温摇床(江苏常州国华仪器厂)；全自动高压蒸汽灭菌器MLS-3750(日本SANYO公司)；凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)；各规格细胞培养瓶及培养板(美国Corning公司)；台式低温高速离心机3300型(日本KUBOTA公司)。

3、试剂、酶与药品

EasyTaqPCRSuperMix、Trans2KDNAMarker、BluePlusIIProteinMarker(北京全式金生物技术有限公司)；BCIP、NBT、兔抗人Caspase-3抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；AMP(北京鼎国生物技术有限责任公司)；TRIZOLREAGENT、Lipofection2000(美国Invitrogen公司)；MCP-1、TEMED、DTT、PVDF膜、Tween-20、SDS(美国SIGMA公司)；去内毒素质粒提取试剂盒(美国OMEGA公司)；胎牛血清、IMDM、胰蛋白酶(美国GIBICO公司)；兔抗人β-Actin抗体、兔抗人MMP-9抗体、兔抗人VEGF抗体(美国Cellsignaling公司)；AP标记的山羊抗兔多克隆抗体(美国Santacruz公司)；dNTPMix、Oligo(dT)、M-MLV(美国Promega公司)；Tris碱、EDTA、β-巯基乙醇、甘油、溴酚蓝、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿等生化试剂和常规化学试剂购自北京化工厂试剂有限公司。

实施例中所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司完成。

二、具体操作步骤

1、pFIV-H1/U6-MCP-1siRNA载体的构建(简称pFIV-si-MCP-1)

1.1、MCP-1siRNA模板引物设计

根据genebank(NM_002982.3)人MCP-1基因mRNA已知序列，确定适合靶点的位置为167-192，寡核苷酸序列为GTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA，合成编码siRNA的DNA模板：

正义链：5′-aaaGTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA-3′

反义链：3′-CAGTGGACGACAATATTGAAGTGGTTaaaa-5′

用去离子水将寡核苷酸终浓度稀释为1μg/μl。

1.2、MCP-1siRNA模板寡核苷酸退火

反应体系如下：

反应条件：加热95℃，5min，冷却至室温，-20℃保存备用。

已退火的双链siRNA模板寡核苷酸浓度为100ng/μl。

1.3、siRNA模板磷酸化

反应体系如下：

反应条件：磷酸化反应37℃，孵育30min；加热至70℃，维持10min终止磷酸化反应。

1.4、连接

连接退火的MCP-1siRNA模板寡核苷酸到线性化的pFIV-H1/U6-siRNA表达载体。

建立连接反应体系如下：

反应条件：16℃，孵育2-4h。

2、制备JM109感受态细胞

取-80℃保存的大肠杆菌JM109，平铺于LB固体培养基，37℃恒温过夜；第二天，自LB固体培养基上挑取单克隆菌落，接种于3mlLB液态培养基中，37℃180rpm恒温振荡过夜。

次日，将此含菌培养液以1：50比例接种于100mlLB液态培养基中，37℃200rpm恒温振荡2-3h，OD600达到0.45-0.55时停止振荡；0℃冰浴含菌培养液10min，随后将此菌液转移至已预冷的离心管中，4℃下4000rpm离心10min，弃去上清液；以10mlCaCl₂(0.1mol/L)重新悬浮菌液，冰浴30min；再次4℃下4000rpm离心10min，弃去上清液；加入2ml预冷的CaCl₂(0.1mol/L)，置于4℃下16h；加入甘油至终浓度10-15％，-80℃保存备用。

3、载体转化

取25μl大肠杆菌JM109感受态细胞和3μl连接产物(pFIV-H1/U6-MCP-1siRNA载体)一并加入5ml离心管中，轻柔弹击离心管混合感受态细胞和连接产物；冰浴30min后，将离心管置于42℃下，45s达到热休克。

将离心管立即置于冰上2min，加入300μlS.O.C混匀，37℃恒温振荡1h，转速为250rpm；然后，将上述产物均匀平铺于已经预温至37℃含AMP(50μg/ml)的LB培养基平皿，倒置平皿37℃恒温培养过夜。

4、载体提取

挑取生长于LB培养基平皿中的单克隆菌落，接种于5ml含AMP(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃恒温振荡16h，转速为180rpm。

取1.5-5ml菌液置于Ep离心管中，室温下10000rpm离心1min，弃去上清液，加入250μlSolutionⅠ与RNaseA的混合液，以漩涡振荡器充分震荡、裂解菌体；待混匀后加入250μlSolutionⅡ，上下翻转Ep离心管4-6次，室温孵育2min，此时液体呈清亮；加入125μl冰预冷的BufferN3，轻柔混匀，上下翻转Ep离心管若干次直至出现白色絮状沉淀物，4℃下12000rpm离心10min。

小心的吸取、转移上清液至1.5ml洁净的Ep离心管中，加入0.1倍体积的ETRSolution上下翻转Ep离心管10次，冰上孵育10min(孵育过程中需要上下翻转Ep离心管若干次)；42℃水浴5min，25℃下12000rpm离心3min。

将最上层液体小心的吸取、转移至1.5ml洁净的Ep离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，上下翻转Ep离心管6-7次混匀；再将700μl混合液加入HiBind^TMDNAMini吸附柱，以2ml离心管套接吸附柱作为收集管，室温10000rpm离心1min，弃去收集液。重复上述步骤直至全部混合液离心完毕。

吸附柱中加入500μlBufferHB，室温10000rpm离心1min，弃去收集液；重新以2ml洁净的离心管套接吸附柱作为收集管，吸附柱中加入700μl由无水乙醇稀释的DNAWashBuffer，室温10000rpm离心1min，弃去收集液，重复一次。

将吸附柱室温下13000rpm离心2min尽量甩干去除乙醇；以1.5ml洁净的Ep离心管套接吸附柱作为收集管，吸附柱加入50μlEndotoxin-FreeElutionBuffer室温下13000rpm离心1min洗脱DNA，收集管中即为纯化载体。

5、载体扩增

PCR反应体系如下：

H1PCR引物：TCGCTATGTGTTCTGGGAAA

U6PCR引物：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA

反应条件如下：

用1×BamHⅠ缓冲液将BamHⅠ稀释为5U/μl；取15μlPCR产物加入1μl稀释后的BamHⅠ，37℃水浴30min。然后，将5μl酶切产物在2.5％琼脂糖凝胶中电泳。

重组载体的鉴定：阳性克隆载体经大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司ABIPRISMTM3730XLDNAAnalyzer自动测序仪进行cDNA测序鉴定。

6、细胞培养

人类激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞株为贴壁生长细胞，培养条件为5％CO₂，37℃恒温培养，培养液为含10％胎牛血清的IMDM。

6.1、细胞复苏

将液氮中冻存的PC-3M细胞株取出，立即置于37℃水浴锅中，轻柔摇晃，确保温度传导均匀，待冻存液溶化后，将细胞转移至超净台内，小心抽取至已经预温达37℃的IMDM中，用吸管将细胞团轻轻吹打分散，混合均匀，900rpm，离心5min；弃去上清液，少量PBS清洗细胞团块1遍，用含10％胎牛血清的IMDM再次将细胞团块吹打分散，然后转移至细胞培养瓶中，置入5％CO₂、37℃的恒温培养箱中。

6.2、细胞传代

当培养瓶内PC-3M细胞达到80-85％融合时，弃去培养液，加入少量PBS清洗2遍，去除残留的血清蛋白质，加入1ml0.25％胰蛋白酶溶液，并使胰蛋白酶充分均匀接触细胞层，倒置显微镜下观察，待细胞变圆时，加入2ml含10％胎牛血清的IMDM终止胰蛋白酶的消化作用，反复应用吸管吹打细胞使其均匀悬浮，取出置于离心管中，900rpm，离心5min；少量PBS清洗细胞团块1遍，用含10％胎牛血清的IMDM再次将细胞团块吹打分散，然后分份转移至细胞培养瓶中，放入恒温培养箱。传代比率为1:2或1:3。

6.3、细胞分组

5％CO₂、37℃恒温培养，待细胞融合度达到80％时，分为control组，si-scramble组，MCP-1组和si-MCP-1组。

control组将培养基更换为无血清IMDM；si-scramble组和si-MCP-1组分别依据表1所示剂量进行细胞转染；MCP-1组在5ml含10％FBS的IMDM中加入250ngMCP-1。

表1各孔板转染试剂剂量

7、细胞转染

96孔板每孔内加入1×10⁴个PC-3M细胞，放入CO₂恒温培养箱培养，待细胞达到80％融合度时候，进行如下转染流程：

取重组载体DNA0.2μg以无血清IMDM稀释至25μl，轻柔混匀；将Lipofectamine^TM2000轻柔混匀后，取0.5μlLipofectamine^TM2000μl以无血清IMDM稀释至25μl，混匀，室温孵育5min。然后，将稀释后的Lipofectamine^TM2000加入载体DNA中，总体积为50μl，混匀，室温孵育20min，得到DNA-Lipofectamine^TM2000复合物。

将96孔板中细胞培养液弃去，PBS清洗2次，确保去除血清蛋白质。将50μl制备的DNA-Lipofectamine^TM2000复合物加入待转染的细胞孔板中，均匀平铺，置入5％CO₂、37℃的恒温培养箱4小时；弃去含DNA-Lipofectamine^TM2000复合物的培养基，更换为100μl含10％FBS的IMDM培养基继续培养。

6孔板及培养瓶转染参照步骤6.3所述剂量及步骤7具体操作步骤进行转染。8、RT-PCR

8.1、总RNA提取(Trizol法)

取对数生长期的PC-3M细胞传代接种至6孔板(2.5×10⁵个/孔)，37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养，待细胞融合度达到80％时，分为control组，si-scramble组，MCP-1组和si-MCP-1组。

37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养48小时后，弃去培养液，2mlPBS清洗2次，去除残留的血清蛋白质；加入1mlTrizol，应用加样器反复吹打将贴壁细胞完全悬浮，并充分混匀，无细胞团块，室温孵育5分钟，彻底清除核酸蛋白质；加入0.2ml氯仿，轻柔振荡15s，室温孵育3分钟；4℃下12000×g离心15min，转移上层液相至Ep管(不能接触中层液体)；加入0.5ml异丙醇，轻柔混匀，室温孵育10min；4℃，12000×g离心10min，弃上清液体，白色的RNA团块沉降于Ep管底；加入1ml75％乙醇，轻柔振荡，将RNA团块悬浮；4℃，7500×g离心5min，尽量去除上清液，室温干燥5min；加入20μlDEPC-H₂O溶解RNA，-20℃保存备用。

8.2、紫外分光光度计调零；

取1μlRNA样本加入99μlDEPC-H₂O中混匀，用紫外分光光度计分别测定260nm和280nm的吸光度值(A)，1.6<A_260/280<2.0为较理想RNA样本，可进一步行逆转录。

RNA(μg/μl)＝稀释倍数×A₂₆₀×4/100

8.3、总RNA逆转录合成cDNA

取2μg总RNA加入0.5μg/μl的oligo-dT(0.5μg/μgmRNA)，加入DEPC-H₂O稀释至15μl，70℃，水浴5min，立即放置冰上；加入如下试剂(25μl体系)：42℃，水浴1h，70℃，水浴10min，立即放置冰上；-20℃保存备用。

8.4、检测目的mRNA的表达

根据PCR引物设计原则，分别依照GeneBank人类MMP-9、MCP-1、VEGF、Caspase-3、GAPDHmRNA序列设计引物(见表2)。

表2RT-PCR引物设计及反应条件

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度见表1；72℃延伸30s，30个反应循环，72℃延伸5min，得PCR扩增产物。

PCR扩增体系(25μl体系)如下：

PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶，100V恒压恒流电泳30min，1×TAE作为电泳缓冲液。电泳结束后应用天能凝胶成像系统拍照，通过GIS影像分析系统测定电泳条带净光密度值，目的基因与GAPDH的比值确定其相对含量，结果见图2。

结果分析：与control组和si-scramble组比较，MCP-1组MCP-1mRNA表达增强(P<0.05)；与control组和si-scramble组比较，si-MCP-1组MCP-1mRNA表达减弱(P<0.05)；与MCP-1组比较，si-MCP-1组MCP-1mRNA表达明显减弱(P<0.01)。与control组和si-scramble组比较，MCP-1组MMP-9和VEGFmRNA表达增强(P<0.05)；与control组和si-scramble组比较，si-MCP-1组MMP-9和VEGFmRNA表达减弱(P<0.05)；与MCP-1组比较，si-MCP-1组MMP-9和VEGFmRNA表达明显减弱(P<0.01)。与control组和si-scramble组比较，MCP-1组Caspase-3mRNA表达减弱(P<0.05)；与control组和si-scramble组比较，si-MCP-1组Caspase-3mRNA表达增强(P<0.05)；与MCP-1组比较，si-MCP-1组Caspase-3mRNA表达明显增强(P<0.01)。

9、Westernblot

9.1、总蛋白提取

取对数生长期的PC-3M细胞，接种于20CM²培养瓶中(6×10⁵个/瓶)；5％CO₂、37℃恒温培养，待细胞融合度达到80％时，分为control组，si-scramble组，MCP-1组和si-MCP-1组。

control组将培养基更换为无血清IMDM；si-scramble组和si-MCP-1组分别依据表1所示剂量进行细胞转染；MCP-1组在5ml含10％FBS的IMDM中加入250ngMCP-1；

37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养48小时后，弃去培养液，2mlPBS清洗2次，去除残留的血清蛋白质；1ml1×EDTA将培养瓶内贴壁生长细胞消化下来，将吹打均匀的细胞悬液转移至Ep管中；室温，5000rpm，离心5min；弃去上清液体，少量PBS清洗离心沉淀物；弃去PBS，加入200μl蛋白裂解液，将沉淀物吹打分散，室温孵育30min；-80℃反复冻融3次；超声匀浆器破裂细胞3次(此步骤在冰上完成，减少超声处理时高温对蛋白产生降解作用)；室温，4000rpm离心5min，收集上清液体(此上清液体为蛋白提取液)。

9.2、蛋白浓度测定(Bio-Rad法)

取1μl蛋白提取液+99μl1×Bio-Rad液加入96孔板，设双复孔，另一孔添加100μl1xBio-Rad液为对照孔，低速振荡器振荡5min混匀后，利用酶标测量仪测量595nm波长OD值，以如下公式计算蛋白浓度。

蛋白浓度(μg/μl)＝(OD_目的-OD_对照)×19.858-1.363

9.3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE凝胶)配制

正确组装玻璃平板夹层，确保平板夹层的胶条无渗漏，玻璃底边处于同一水平；依照目的蛋白的分子量选择适合的分离胶浓度(12％)，配制积层胶和分离胶；先灌注下层的分离胶，灌注结束后用去离子水作为水封层，待分离胶完全形成后弃去水封层，灌注积层胶并插入梳齿，室温竖直放置30min，待凝胶形成后可将玻璃平板连同凝胶一并浸入去离子水中，4℃备用。

9.4、蛋白样本制备

根据上述测定所得的蛋白提取液中蛋白浓度，计算出30μg蛋白质的体积；微量加样器吸取相应的蛋白提取液，转移至洁净的微量Ep管中；加入去离子水定容至18μl；1体积2M的DTT加入4体积的5×SDS上样缓冲液配制成4×SDS上样缓冲液；蛋白中加入6μl4×SDS上样缓冲液，配制成24μl的蛋白上样缓冲液体系；充分混匀；100℃水浴15min，使蛋白质充分变性。

9.5、蛋白上样与电泳

取出SDS-PAGE凝胶，小心拔除梳齿，用去离子水冲洗凝胶泳道孔内多余的凝胶；将凝胶正确放置在垂直电泳槽内(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外)；电泳槽的内、外槽中加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/lTris+250mmol/l甘氨酸+0.1％SDS)，内槽中的电泳缓冲液需与玻璃最上端平齐，外槽中缓冲液应超过玻璃的底边，并且排除凝胶底部残留的气泡；用专用加样器头小心的将等浓度等体积的蛋白样本加入到泳道孔中，蛋白样本前一孔中加入5μl的蛋白Marker，两侧空白孔中加入等体积的1×SDS上样缓冲液，防止蛋白样本向相邻的空白泳道扩散；连接电源，设定恒压75V，电泳30min；然后恒压120V，电泳60min；溴酚蓝到达分离胶底部，垂直电泳结束。

9.6、免疫印迹杂交

转膜(液相转膜法-湿转法)

从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶；依照各泳道及蛋白Marker将凝胶裁剪成适宜大小，少量切除凝胶右上角作为方向标记；将凝胶浸入转移缓冲液中15–30min；滤纸在转移缓冲液中至少浸泡30s；PVDF膜在甲醇中润湿膜15s，保证膜由不透明变成半透明；小心将PVDF膜放入转移缓冲液中平衡至少5min。

将夹子打开，使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵泡沫垫，用玻棒棒擀走里面的气泡；在泡沫上垫3层已经处理过的滤纸，用玻璃棒擀去其中的气泡；小心的将凝胶盖于滤纸上，调整使凝胶与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒擀去气泡；将PVDF膜盖于胶上，并去除气泡；在PVDF膜上盖3张滤纸并去除气泡；最后盖上另一块海绵泡沫垫，用玻璃棒擀去其中的气泡，合起夹子。

将夹子放入转移槽中，夹子的黑色面对转移槽的黑色面，夹子的白色面对转移槽的红色面；在槽的一侧放如冰盒来降温，转膜槽装置整体置于冰水中；连接电源，恒流200mA/夹，转移120min。

9.7、封闭

将PVDF膜转移至TBST中，水平摇床上漂洗5min，去除含有SDS的转移缓冲液；将PVDF膜转移至5％脱脂牛奶的TBST溶液中，水平摇床上缓慢摇动，室温下封闭2h。

9.8、一抗杂交

封闭后的PVDF膜转移至TBST中，水平摇床上漂洗5min，去除牛奶；根据目的蛋白分子量，参考蛋白Marker条带指示，裁剪相应的PVDF膜区域，铅笔在膜右上角标记方向；按照一抗试剂说明书应用TBST将一抗试剂稀释为1：300浓度；将稀释好的一抗试剂加入自封袋中，放入PVDF膜，排出气泡，使一抗试剂与PVDF膜充分接触；4℃暗室中过夜。

9.9、二抗杂交

取出一抗试剂中的PVDF膜，转移至TBST中，水平摇床上缓慢摇动，室温漂洗5min，共3次，彻底去除一抗；依照二抗试剂说明书应用TBST将二抗试剂稀释为1：1000浓度；将稀释好的二抗试剂加入自封袋中，放入PVDF膜，排出气泡，使二抗试剂与PVDF膜充分接触；室温，水平摇床上缓慢摇动2h。

9.10、显色

取出二抗试剂中的PVDF膜，转移至TBST中，水平摇床上缓慢摇动，室温漂洗5min，共3次，彻底去除二抗；玻璃平皿配制显色液：3mlAPbuffer加入20μlNBT和10μlBCIP充分混匀；将PVDF膜放入显色液中，室温下轻柔晃动平皿，使显色液与PVDF膜充分接触，观察颜色变化；待目的条带颜色达到要求，将PVDF膜置入去离子水中终止显色反应。

9.11、图像分析

晾干PVDF膜，应用天能成像系统拍照，通过GIS影像分析系统测定电泳条带净光密度值，目的蛋白与β-actin的比值确定其相对含量，结果见图3。

结果分析：与control组和si-scramble组比较，MCP-1组VEGF蛋白表达增强(P<0.05)；与control组和si-scramble组比较，si-MCP-1组VEGF蛋白表达减弱(P<0.05)；与MCP-1组比较，si-MCP-1组VEGF蛋白表达明显减弱(P<0.01)。与control组和si-scramble组比较，MCP-1组MMP-9蛋白表达增强(P<0.05)；与control组和si-scramble组比较，si-MCP-1组MMP-9蛋白表达减弱(P<0.05)；与MCP-1组比较，si-MCP-1组MMP-9蛋白表达明显减弱(P<0.01)。与control组和si-scramble组比较，MCP-1组Caspase-3蛋白表达减弱(P<0.05)；与control组和si-scramble组比较，si-MCP-1组Caspase-3蛋白表达增强(P<0.05)；与MCP-1组比较，si-MCP-1组Caspase-3蛋白表达明显增强(P<0.01)。

序列表

<110>施朝龄

<120>一种用于抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的基因序列

<160>3

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<221>正义链序列SEQIDNO.1

<400>1

aaaGTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA29

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<221>反义链序列SEQIDNO.2

<400>2

CAGTGGACGACAATATTGAAGTGGTTaaaa30

<210>3

<211>6330

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgcc60

aacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagc120

tgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgc180

gagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggt240

ttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatt300

tttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttca360

ataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctt420

ttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaaga480

tgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaa540

gatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttct600

gctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat660

acactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacgga720

tggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggc780

caacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacat840

gggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaa900

cgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaac960

tggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataa1020

agttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatc1080

tggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagcc1140

ctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatag1200

acagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagttta1260

ctcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaa1320

gatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagc1380

gtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaat1440

ctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaaga1500

gctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgt1560

ccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacata1620

cctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttac1680

cgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggggg1740

ttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcg1800

tgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaag1860

cggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatct1920

ttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc1980

aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctt2040

ttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccg2100

tattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcga2160

gtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttg2220

gccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcg2280

caacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgct2340

tccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagcta2400

tgaccatgattacgaatttgggccgtctctgcaaaagtctaggcctccaaaaaagcctcc2460

tcactacttctggaatagctcagaggccgaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaa2520

aattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatagc2580

tagagccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagt2640

gaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataa2700

gctgcaataaacaagttcgcggtacaatgagctcgctgcgaagttctcggcccggattcc2760

gagacctcacaggtaaaaaagattacacagatactcgacagggttcaatctcaaatattt2820

attgtatctgtgggagcctcaagggagaactcaaaagtcctcaacaaagagactcctcga2880

agtttcacaaagcactggaagctatcgatgggcaggaagagggcctatttcccatgattc2940

cttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactg3000

taaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagt3060

ttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagt3120

atttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagtcacctgctgttataacttcacca3180

atttttagagtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgt3240

ttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaatatgaattctagcgtccataagc3300

attctttctatttcttcagggttccagtactcatcccagtccacccttttttctttttta3360

ggaggttcatcttcaggtaccaggcggggaggcggcccaaagggagatccgactcgtctg3420

agggcgaaggcggagacgcggaagaggccgcagagccggcagcaggccgcgggaaggaag3480

gtccgctggattgagggccgaagggacgtagcagaaggacgtcccgcgcagaatccaggt3540

ggcaacacaggcgagcagccatggaaaggacgtcagcttccccgacaacaccacggaatt3600

gtcagtgcccaacagccgagcccctgtccagcagcgggcaaggcaggcggcgatgagttc3660

cgccgtggcaatagggagggggaaagcgaaagtcccggaaaggagctgacaggtggtggc3720

aatgccccaaccagtgggggttgcgtcagcaaacacagtgcacaccacgccacgttgcct3780

gacaacgggccacaactcctcataaagagacagcaaccaggatttatacaaggaggagaa3840

aatgaaagccatacgggaagcaatagcatgatacaaaggcattaaagcagcgtatccaca3900

tagcgtaaaaggagcaacatagttaagaataccagtcaatctttcacaaattttgtaatc3960

cagaggttgattgtcgactcaggcaccgggcttgcgggtcatgcaccaggtgcgcggtcc4020

ttcgggcacctcgacgtcggcggtgacggtgaagccgagccgctcgtagaaggggaggtt4080

gcggggcgcggaggtctccaggaaggcgggcaccccggcgcgctcggccgcctccactcc4140

ggggagcacgacggcgctgcccagacccttgccctggtggtcgggcgagacgccgacggt4200

ggccaggaaccacgcgggctccttgggccggtgcggcgccaggaggccttccatctgttg4260

ctgcgcggccagccgggaaccgctcaactcggccatgcgcgggccgatctcggcgaacac4320

cgcccccgcttcgacgctctccggcgtggtccagaccgccaccgcggcgccgtcgtccgc4380

gacccacaccttgccgatgtcgagcccgacgcgcgtgaggaagagttcttgcagctcggt4440

gacccgctcgatgtggcggtccggatcgacggtgtggcgcgtggcggggtagtcggcgaa4500

cgcggcggcgagggtgcgtacggccctggggacgtcgtcgcgggtggcgaggcgcaccgt4560

gggcttgtactcggtcattctagaatcttctatggaggtcaaaacagcgtggatggcgtc4620

tccaggcgatctgacggttcactaaacgagctctgcttatatagacctcccaccgtacac4680

gcctaccgcccatttgcgtcaatggggcggagttgttacgacattttggaaagtcccgtt4740

gattttggtgccaaaacaaactcccattgacgtcaatggggtggagacttggaaatcccc4800

gtgagtcaaaccgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcaccatggtaa4860

tagcgatgactaatacgtagatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtact4920

gggcataatactagtatcgattataagaaaatatcccttctcttcatcctttaataatac4980

tgatccctgtccccagtattctactctcattggtcctttccatttcttatctttttgatc5040

tttataataaatccactgtgcttgcaatttttgtggtattgcagaaaaataatcttgtat5100

tcttaaggattcttgttgtgctaataattcataaggggccatccctcctatcctacctct5160

tcttttaaaattgagactatgtctaggatatgacataccttcctcaaagggaagaactca5220

gcacagtatctcccttataaaataagtctgagatacttcatcattcctcctctttttcag5280

acatgccacattgcctaccatttctcctcaatgcaggaattgccatatcaatttctttgc5340

tagatccaaatttttctcttctttcttgtaaatcgcaaataaccaaccttagttgatcta5400

aagtctctggtatatcaccaggttctcgtcctgtagatacattagccattctaatggccc5460

atctgaaattcccttctccaaattttttactcttcccccctactcctacagcaacattac5520

tacatctcttaatggccattttccaatctcgcccctgtccattccccatgttgctgtaga5580

atctctcctaccttgttgactgtccctcggcgaatctcctggcttgaaggtccgcgaaga5640

gtcaccagatgtaatttatctgggcctttaaacaatgacttgattatgagctcgagtctg5700

cttcactagagatactcactgttagcagcgtctgctactgcttccctatttaggtcagca5760

ggagttctgcttaacagctttctattgctctagcttcacttcctcaatcactctcaatca5820

agtccctgttcgggcgccaactgcgaagttctcggcccggattccgagacctcacaggta5880

aaaaagattacacagatactcgacagggttcaatctcaaatatttattgtatctgtggga5940

gcctcaagggagaactcaaaagtcctcaacaaagagactcctcgaagtttcacaagctct6000

gcttatatagacctcccaccgtacacgcctaccgcccatttgcgtcaatggggcggagtt6060

gttacgacattttggaaagtcccgttgattttggtgccaaaacaaactcccattgacgtc6120

aatggggtggagacttggaaatccccgtgagtcaaaccgctatccacgcccattgatgta6180

ctgccaaaaccgcatcaccatggtaatagcgatgactaatacgtagatgtactgccaagt6240

aggaaagtcccataaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccgtcatt6300

gacgtcaatagggggcgtacttggcatatg6330

Claims

1.一种用于抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的基因序列，其特征在于：所述基因序列为抑制MCP-1基因表达的双链siRNA分子，所述siRNA分子DNA模板由下述核苷酸序列的正义链的和反义链组成：

正义链：5′-aaaGTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA-3′；

反义链：3′-CAGTGGACGACAATATTGAAGTGGTTaaaa-5′。

2.根据权利要求1所述的一种用于抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的基因序列，其特征在于：所述siRNA干扰的靶序列位于MCP-1基因的mRNA编码序列的位置为167-192，寡核苷酸序列为GTCACCTGCTGTTATAACTTCACCAA。

3.一种含有权利要求1所述的siRNA的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pFIV-H1/U6-MCP-1siRNA。

5.一种含有权利要求3所述的siRNA的重组表达载体的重组载体，其特征在于：所述重组载体序列为SEQIDNO:3。

6.权利要求1所述的siRNA在抑制MCP-1基因表达中的应用。

7.权利要求3所述的重组表达载体在制备治疗前列腺癌药物中的应用。

8.权利要求5所述的重组载体在制备治疗前列腺癌药物中的应用。