CN105616504A - 桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法，包括以下步骤：取桑叶粉碎，得桑叶粉；桑叶粉中加入蒸馏水，震荡混匀，在75-100℃煎煮2-4h，过滤，取滤渣重复1-3次，合并滤液得粗提液；粗提液中加入乙醚萃取脱脂，完成后取上层水液并浓缩至1/2-1/4；加入无水乙醇浸提，离心，取上清液烘干，然后依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干；加入蒸馏水复溶，25000-35000分子量超滤膜超滤，收集滤过液，烘干，得到目的小分子活性组分。本发明提供了一种低成本、快速、简洁地提取桑叶中活性小分子组分的方法，该活性小分子组分被证明可作为抗糖尿药物的有效活性组分，且安全有效，毒性较低。

Description

桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术制药工程技术领域，尤其涉及一种桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法。
背景技术
桑叶，桑科中植物桑的干燥叶，味苦、甘，性寒。在古代，中医就以桑叶作中药治疗消渴症；现代桑叶也常配伍与中药复方应用于临床治疗。研究表明，桑叶是上好的功能产品，具有提高免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗肥胖、延缓衰老等功能。现阶段，已分别研究了桑叶中多糖、生物碱、黄酮等对降血糖起到较显著的作用，但桑叶中小分子物质对降血糖的作用却很少被报道。
大量研究表明PPARγ与2型糖尿病的发生相关性很大。PPARγ是核受体超家族成员，被激活后可以促进脂肪细胞的分化，通过相关调节使对胰岛素敏感的小脂肪细胞的数量增加，脂联素分泌增多，改善胰岛素抵抗，使机体对胰岛素的敏感性增强，是目前人们研究抗糖药物的一种有效途径。
发明内容
本发明针对以上现有技术，提供一种低成本、快速、简洁地从桑叶中提取具有降糖活性的小分子组分的方法。
为达到上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)取洗净并干燥的桑叶，粉碎，得到桑叶粉；
(2)放入干燥洁净的容器中，加入蒸馏水，震荡混匀，然后加热至75-100℃煎煮2-4h，过滤；
(3)取滤渣重复步骤(2)1-3次，合并所得滤液，得粗提液；
(4)在粗提液中加入乙醚进行萃取脱脂处理，萃取完成后取上层水液，浓缩至原体积的1/2-1/4；
(5)加入2-4倍体积的无水乙醇浸提，离心，所得上清液烘干，然后依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2-4次，烘干得粗提物；
(6)在粗提物中加入蒸馏水进行复溶，使用25000-35000分子量的超滤膜进行超滤，收集滤过液，烘干，得到目的小分子活性组分。
所述步骤(2)中桑叶粉或滤渣与蒸馏水的料液比为1:(20-40)(g/mL)。
所述步骤(4)中乙醚与粗提液的体积比为1:(10-20)。
所述步骤(6)中粗提物与蒸馏水的料液比为1:(10-20)(g/mL)。
所述步骤(6)中超滤的条件为：室温20-30℃，驱动压力0.25MPa。
本发明采用水提醇沉法，加上中间步骤的乙醚萃取脱脂，粗提桑叶中的有效活性成分；然后通过超滤技术分离上述初提物，进一步获取桑叶中的小分子活性组分。由于水提醇沉法得到的上清液含有较多的多糖、蛋白质等大分子复合物，具有较强的吸水性，故单凭烘干无法除去其中的水分，会使沉淀产物含有较多的水分，影响产物性状(呈胶状，而非粉末状固体)和纯度(无法进行精确的定量分析)。醇沉后用无水乙醇洗涤，除去一部分水分；再用可溶于水的丙酮洗涤，确保水分除净；最后用无水乙醚洗涤沉淀物，除去残存的乙醇、丙酮和溶于其中的水分，这样就可以有效除去醇沉上清中的水分，得到较纯的粉末状粗提活性组分，以利于工业化大规模进一步地分离纯化。采用超滤技术分离上述粗提活性组分得到的小分子活性组分，运用Hela高通量细胞筛选模型，检测其有效组分活性，结果显示其含有PPARγ配体的激活效应，能激活PPARγ信号通路，可作为PPARγ激活剂，且安全有效，毒性较低，不会引起并发症。
本发明提供了一种低成本、快速、简洁地提取桑叶中活性小分子组分的方法，该活性小分子组分被证明可作为抗糖尿药物的有效活性组分，且安全有效，毒性较低。本发明适用于活性小分子抗糖尿药物的提取，可有效降低降糖活性小分子药物的成本，且方法简便，能够有效满足工业化大规模生产需求。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：桑叶中降糖小分子活性组分的提取
1.桑叶中有效成分的粗提
(1)称取洗净并干燥的桑叶50g，粉碎，得到桑叶粉；
(2)放入干燥洁净的锥形瓶中，加入1L蒸馏水，即料液比1:20(g/mL)，震荡均匀，将样品于100℃煎煮2h，过滤；
(3)取滤渣按步骤(2)重复提取2次，合并所得滤液，得粗提液；
(4)在粗提液中加入200mL乙醚进行脱脂处理，离心，留滤液，浓缩至原体积的1/4；
(5)加入3倍体积的无水乙醇浸提，静置过夜，离心，取上清液初步烘干，然后用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤3次，烘干，称重，初提物的得率为9.24％。
2.超滤技术提取初提物中的目的小分子有效成分
加适量水复溶初提物，粗提物与蒸馏水的料液比为1:10(g/mL)，使用30000分子量的超滤膜，在25℃的温度下，驱动压力为0.25MPa进行超滤，截留初提物中的多糖、蛋白质等大分子物质，取滤过液，烘干，为目的小分子组分，计算得率为60％。
实施例2：利用Hela细胞模型检测目的小分子组分活性
将得到的目的小分子组分用DMSO溶解，配成5g/L的样品，运用Hela高通量细胞筛选模型检测样品活性的高低。结果如表1所示。
表1提取样品与罗格列酮激活倍数的比较
实施例3：利用Hela细胞模型检测目的小分子组分活性
在得到的目的小分子组分中混入2％的壳寡糖，然后用DMSO溶解，配成5g/L的样品，运用Hela高通量细胞筛选模型检测样品活性的高低，活性并未见明显变化。结果如表2所示。
表2含壳寡糖样品与罗格列酮激活倍数的比较
由以上实施例可知，本发明可以简洁、快速地获取桑叶中PPARγ激活剂，并且安全有效，较罗格列酮毒性低，可应用于规模化生产抗糖尿药物中。接下去我们将大规模制备该抗糖尿小分子活性组分，并进一步分离纯化，以获得高纯度的抗糖尿小分子活性物质，并进一步研究其抗糖尿作用机理或作用途径，为人类的健康贡献微薄力量。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (5)

1.一种桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取洗净并干燥的桑叶，粉碎，得到桑叶粉；
(2)放入干燥洁净的容器中，加入蒸馏水，震荡混匀，然后加热至75-100℃煎煮2-4h，过滤；
(3)取滤渣重复步骤(2)1-3次，合并所得滤液，得粗提液；
(4)在粗提液中加入乙醚进行萃取脱脂处理，萃取完成后取上层水液，浓缩至原体积的1/2-1/4；
(5)加入2-4倍体积的无水乙醇浸提，离心，所得上清液烘干，然后依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2-4次，烘干得粗提物；
(6)在粗提物中加入蒸馏水进行复溶，使用25000-35000分子量的超滤膜进行超滤，收集滤过液，烘干，得到目的小分子活性组分。
2.根据权利要求1所述的桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中桑叶粉或滤渣与蒸馏水的料液比为1:(20-40)。
3.根据权利要求1所述的桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中乙醚与粗提液的体积比为1:(10-20)。
4.根据权利要求1所述的桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(6)中粗提物与蒸馏水的料液比为1:(10-20)。
5.根据权利要求1所述的桑叶中降糖小分子活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(6)中超滤的条件为：室温20-30℃，驱动压力0.25MPa。
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