CN105611947A - 用于中和半乳糖凝集素1(Gal1)的抗-Gal1单克隆抗体及其片段 - Google Patents

用于中和半乳糖凝集素1(Gal1)的抗-Gal1单克隆抗体及其片段 Download PDF

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Abstract

本发明部分基于以下发现：半乳糖凝集素1(Gal1)的表位，抗-Gal1试剂可针对所述表位中和Gal1的功能，以及可用于中和Gal1功能的抗-Gal1试剂和方法。

Description

用于中和半乳糖凝集素1(Gal1)的抗-Gal1单克隆抗体及其片段
发明背景
半乳糖凝集素1(Gal1)是高度保守的糖结合蛋白家族的成员，其通过特异性识别N-或O-连接的多糖分支上的N-乙酰乳糖胺(Gal-β1-4-NAcGlc)残基来调节免疫应答并促进肿瘤免疫逃逸(Juszczynski等人(2007)ProcNatlAcadSciUSA.104:13134-13139；Rabinovich和Croci(2012)Immunity36:322-335；Rabinovich和Toscano(2009)Nat.RevImmunol.9:338-352；Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251)。
Gal1通过与特异性唾液酸化的细胞表面糖蛋白(例如CD45、CD43和CD7)相互作用来选择性诱导细胞毒性T细胞以及T辅助(Th)1和Th17细胞的凋亡(Toscano等人(2007)Nat.Immunol.8:825-834)。由于Th2细胞和调节性T(Treg)细胞缺乏结合Gal1的糖蛋白基序，因此Gal1放过了这些细胞并且促进了免疫抑制性的Th2/Treg富集的肿瘤微环境(Toscano等人(2007)Nat.Immunol.8:825-834)。Gal1还促进调节性T(Treg)细胞的扩增(Juszczynski等人(2007)ProcNatlAcadSciUSA.104:13134-13139；Toscano等人(2007)Nat.Immunol.8:825-834)，并且Gal1-多糖的相互作用加强缺氧驱动的肿瘤血管生成(Croci等人(2012)J.Exp.Med.209:1985-2000)。
这些分子机制构成了Gal1促进经典霍奇金淋巴瘤(cHL)效应的基础。cHL是B细胞恶性肿瘤，在北美和欧洲每年约有20,000名新患者被诊断患有此病；这些患者中>90％是青壮年。cHL包括在广泛的Th2/Treg偏离的炎性浸润中的少数恶性霍奇金里德-斯特恩伯格(HRS)细胞(Küppers等人(2002)Ann.Oncol.13:11-18；Juszczynski等人(2007)ProcNatlAcadSciUSA.104:13134-13139；Küppers(2009)Nat.Rev.Cancer9:15-27)。HRS细胞过表达Gal1，且Gal1选择性杀死Th1和细胞毒性T细胞并且促进免疫抑制性的Th2/Treg为主的HL微环境(Juszczynski等人(2007)ProcNatlAcadSciUSA.104:13134-13139)。HRS细胞缺乏B细胞受体介导的信号并且依赖于由转录因子(例如NF-κB和激活蛋白1(AP1))激活的替代性存活和增殖通路(Küppers等人(2002)Ann.Oncol.13:11-18；Mathas等人(2002)EMBOJ.21:4104-4113；Schwering等人(2003)Mol.Med.9:85-95)。在cHL中，肿瘤细胞表现出组成性的AP1活化，表达高水平的AP1组分(cJun和JunB)，并且依赖于AP1介导的增殖信号(Mathas等人(2002)EMBOJ.21:4104-4113；Juszczynski等人(2007)ProcNatlAcadSciUSA.104:13134-13139；Rodig等人(2008)Clin.CancerRes.14:3338-3344)。虽然原发性cHL具有活跃的炎性浸润性，但存在极少的有效的宿主抗肿瘤免疫应答的证据。反应性T细胞群主要包括Th2型以及CD4+CD25hiFoxP3+调节性的T细胞，其直接抑制免疫应答并且保护HRS细胞免受免疫攻击(Re等人(2005)J.Clin.Oncol.23:6379-6386；Marshall等人(2004)Blood103:1755-1762；Gandhi等人(2006)Blood108:2280-2289)。Th1和自然杀伤细胞以及细胞毒性T细胞明显不足。
在对原发性cHL的免疫组化分析中升高的Gal1表达与较差的无事件生存率相关(Kamper等人(2011)Blood117:6638-6649)。特别地，在初诊患有cHL的患者中上升的血清Gal1水平与肿瘤负担和不良临床特征显著相关(Ouyang等人(2013)Blood121:3431-3433)。此外，Gal1的表达也与EBV相关的移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)(Gottschalk等人(2005)Annu.Rev.Med.56:29-44；Ouyang等人(2011)Blood117:4165-4166and4315-4322)、MLL重排的ALL(Juszczynski等人(2010)Clin.CancerRes.16:2122-2130)和卡波西肉瘤(Tang等人(2010)Oncol.Rep.24:495-500)相关。除了这些选择的淋巴恶性肿瘤和病毒诱导的癌症之外，许多实体肿瘤也表达Gal1，所述实体肿瘤包括乳腺癌(Croci等人(2012)J.Exp.Med.209:1985-2000)、前列腺癌(Dalotto-Moreno等人(2013)CancerRes.73:1107-1117)、肺癌(Laderach等人(2013)CancerRes.73:86-96)、胰腺癌(Chung等人(2012)Clin.CancerRes.18:4037-4047)、头颈部鳞状细胞癌(Chung等人(2008)ANZJ.Surg.78:245-251；Alves等人(2011)Pathol.Res.Pract.207:236-40)、肝细胞癌(Le等人(2005)J.Clin.Oncol.23:8932-41)、鼻咽癌(Wu等人(2012)J.Gastroenterol.Hepatol.27:1312-1319)和黑色素瘤(Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251；Mathieu等人(2012)J.Invest.Dermatol.132:2245-2254)。在上述实体肿瘤中，Gal1的表达已被鉴定为不良预后的标志物。此外，Gal1的沉默与乳腺癌(Croci等人(2012)J.Exp.Med.209:1985-2000)、前列腺癌(Dalotto-Moreno等人(2013)CancerRes.73:1107-1117)、肺癌(Laderach等人(2013)CancerRes.73:86-96)和黑色素瘤(Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251)中的抗肿瘤效应相关。
考虑到Gal1的广泛免疫抑制性的活性，这些结果表明，Gal1是由Gal1介导的许多癌症和其他病症的非常强大的治疗靶点。鉴于上述情况，很显然，本领域仍然需要组合物和方法来有效地中和不希望的Gal1活性。
发明概述
本发明一般涉及抗半乳糖凝集素1(Gal1)的试剂，其基于对特异性抗-Gal1表位的鉴定而中和Gal1的功能，所述特异性抗-Gal1表位出乎意料地有效产生中和性Gal1试剂。
一方面，提供了一种长度小于或等于约60个氨基酸的重组多肽，所述多肽包括与选自下组的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQIDNO:1-16的第102-115位残基。在一个实施方案中，所述多肽的长度等于14个氨基酸。在另一个实施方案中，所述氨基酸序列与SEQIDNO:1-16中任一的第102-115位残基的氨基酸序列相同。在另一个实施方案中，所述多肽进一步包括异源序列。在另一个实施方案中，所述多肽是分离的。在另一个实施方案中，所述多肽与可检测标签共价连接。在另一个实施方案中，所述多肽与运载体分子共价结合或者被固定在物体上(例如，选自下组的物体：细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠、凝胶、板、阵列和毛细管)。
另一方面，提供了一种重组的核酸分子，所述核酸分子具有在严格条件下与如下核酸的互补链杂交的序列，所述核酸编码本文所述的本发明的多肽、或者具有与编码本文所述的本发明的多肽的核酸具有至少约95％同源性的序列，其中所述核酸分子仅为编码所述多肽所需的长度。
另一方面，提供了一种包括本文所述的本发明的重组核酸的载体，其中任选地，所述载体是包括与所述核酸可操控地连接的启动子的表达载体。
另一方面，提供了一种表达本文所述的本发明的多肽的宿主细胞，所述宿主细胞包括本文所述的本发明的核酸，或者包括本文所述的本发明的载体。
另一方面，提供了一种免疫原性组合物，其包括本文所述的本发明的多肽、本文所述的本发明的核酸、本文所述的本发明的载体、或者本文所述的本发明的宿主细胞；和药学上可接受的运载体。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包括至少一种额外的免疫刺激剂(例如，佐剂和/或免疫检查点抑制剂)。在另一个实施方案中，所述免疫检查点选自下组：PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-1、CTLA-4、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-4、BTLA、SIRPalpha(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、A2aR、及其组合。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物能够在哺乳动物中引发中和性抗-Gal1抗体。
另一方面，提供了一种分离的中和性抗-Gal1抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合本文所述的本发明的多肽。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、抗体片段、合成的、鼠的、人的、或者被可检测化标记的。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是被可检测化标记的，包括效应域，包括Fc结构域，和/或选自下组：Fv、Fav、F(ab’)2)、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2、和双功能抗体片段。
另一方面，提供了一种鉴定中和性抗-Gal1抗体的方法，所述方法包括(a)向受试者施用有效量的选自下组的试剂：本文所述的本发明的多肽、本文所述的本发明的核酸、本文所述的本发明的载体、本文所述的本发明的宿主细胞、或者本文所述的本发明的免疫原性组合物，以产生中和Gal1的抗体；和(b)分离对所述施用的试剂具有特异性的抗-Gal1抗体。
另一方面，提供了一种鉴定中和性抗-Gal1抗体的方法，所述方法包括(a)在体外细胞培养系统中向B细胞施用有效量的选自下组的试剂：本文所述的本发明的多肽、本文所述的本发明的核酸、本文所述的本发明的载体、本文所述的本发明的宿主细胞、或者本文所述的本发明的免疫原性组合物，以产生中和Gal1的抗体；和(b)分离对所述施用的试剂具有特异性的抗-Gal1抗体。
另一方面，提供了一种制备分离的杂交瘤的方法，所述杂交瘤产生特异性结合Gal1的中和性抗-Gal1抗体，所述方法包括：a)用有效量的选自下组的试剂：本文所述的本发明的多肽、本文所述的本发明的核酸、本文所述的本发明的载体、本文所述的本发明的宿主细胞、或者本文所述的本发明的免疫原性组合物，来免疫哺乳动物或者接触B细胞；b)任选地从所述被免疫哺乳动物中分离脾细胞；c)将来自所述被免疫哺乳动物的脾细胞或者B细胞与永生化的细胞系融合，以形成杂交瘤；和d)筛选用于产生抗-Gal1抗体的个体杂交瘤，所述抗体特异性结合所述试剂。
另一方面，提供了一种抗体，所述抗体通过本文所述的本发明的方法产生。
另一方面，提供了一种在受试者中引发抗-Gal1免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的选自下组的试剂：本文所述的本发明的多肽、本文所述的本发明的核酸、本文所述的本发明的载体、本文所述的本发明的宿主细胞、本文所述的本发明的免疫原性组合物、或者本文所述的本发明的抗体，由此引发免疫应答。在一个实施方案中，以单剂量施用所述试剂、以多剂量施用所述试剂、或者将所述试剂作为异源性初次免疫-加强免疫方案的一部分进行施用。
另一方面，提供了一种在受试者中抑制Gal1活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的选自下组的试剂：本文所述的本发明的多肽、本文所述的本发明的核酸、本文所述的本发明的载体、本文所述的本发明的宿主细胞、本文所述的本发明的免疫原性组合物、或者本文所述的本发明的抗体，由此在所述受试者中抑制Gal1的活性。
另一方面，提供了一种用于在受试者中预防或延迟Gal1活性介导的疾病的发病、或者减缓Gal1活性介导的疾病的进程的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的选自下组的试剂：本文所述的本发明的多肽、本文所述的本发明的核酸、本文所述的本发明的载体、本文所述的本发明的宿主细胞、本文所述的本发明的免疫原性组合物、或者本文所述的本发明的抗体，由此在所述受试者中预防或延迟所述Gal1介导的疾病的发病、或者减缓所述Gal1介导的疾病的进程。
某些实施方案可以应用于本文所述的本发明的任意方法。例如，方法可以进一步包括施用至少一种额外的上调免疫应答的试剂。在另一个实施方案中，所述至少一种额外的试剂包括免疫检查点抑制剂。在另一个实施方案中，所述免疫检查点选自下组：PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-1、CTLA-4、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-4、BTLA、SIRPalpha(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、A2aR、及其组合。在另一个实施方案中，所述Gal1介导的疾病是Gal1-阳性癌症、Gal1介导的血管生成紊乱、AP1依赖性淋巴恶性瘤、MLL重排的ALL、EBV+的移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、鼻咽癌、卡波济氏肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌和黑色素瘤。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
附图简述
图1显示了Western印迹(WB)中抗-Gal1单克隆抗体8A12与内源性人和鼠Gal1的交叉反应性。对来源于人霍奇金淋巴瘤系L428和鼠黑色素瘤系B16-F10的细胞裂解物的WB分析。在不同滴度下用8A12探测裂解物，显示Gal1的特异性条带(～14kDa)。8A12在类似的滴度范围下识别内源性人和鼠Gal1。
图2显示了重组的GST-标记的或者HIS-标记的人Gal1(hGal1)及片段的示意图。
图3显示了用MOLSCRIPT制备的具有两个乳糖分子的同二聚体hGal1的带状示意图。字母-数字代码表示五链(F1-F5)和六链(S1-S6a/S6b)β片层中的β链。该图改编自Lopez-Lucendo等人(2004)J.Mol.Biol.343:957-970。
图4显示了对8F4mAb的精细表位定位的结果。
图5显示了总结8F4mAb的精细表位定位结果的示意图。
图6显示了对8F4mAb的BIAcore分析的结果。
图7显示了鼠Gal1(mGal1)和hGal1之间在围绕并包括8F4mAb所结合的表位的区域中的序列比较。
发明详述
本发明部分基于以下发现：半乳糖凝集素1(Gal1)的表位，抗-Gal1试剂可针对所述表位中和Gal1的功能，以及用于中和Gal1功能的抗-Gal1试剂和方法。
I.定义
本文中使用的冠词“一”和“一种”是指所述冠词指代的一个或者一个以上(即至少一个)的语法对象。举个例子，“一种元件”是指一个元件或者一个以上的元件。
术语“佐剂”是指任何适合用于增强抗原(例如蛋白质和核酸)的免疫原性的试剂。适合与基于蛋白质的免疫原一起使用的佐剂是本领域公知的，并且包括，但不限于，明矾、弗氏不完全佐剂(FIA)、皂甙、QuilA、QS21、RibiDetox、单磷酰脂质A(MPL)和非离子型嵌段共聚物(如L-121(Pluronic；SyntexSAF))。将佐剂与抗原组合的方法是本领域技术人员公知的。佐剂也可以是颗粒形式。可以将抗原掺入由聚乳酸-共-羟基乙酸(PLG)或类似的聚合物材料组成的可生物降解的颗粒中。已知这种可生物降解的颗粒能提供免疫原的持续释放，并由此刺激对免疫原的持久的免疫应答。其他颗粒佐剂，包括但不限于，被称为免疫刺激复合物(ISCOM)的QuilA和胆固醇的胶束混合物以及铝或铁的氧化物珠。本领域技术人员还已知，当基于蛋白质的免疫原与适当的佐剂(如ISCOM和微米级大小的聚合物颗粒或者金属氧化物颗粒)一起配制和施用时，会引发细胞毒性T淋巴细胞和其他细胞的免疫应答。用于基于核酸的疫苗的合适佐剂包括，但不限于，QuilA、以纯化的蛋白质或核酸形式递送的白介素12、短细菌免疫刺激性核苷酸序列(如含CpG的基序)、以纯化的蛋白质或核酸形式递送的白介素2/Ig的融合蛋白、水包油微乳液(如MF59)、聚合物微粒、阳离子脂质体、单磷酰脂质A(MPL)、免疫调节剂(如乌苯美司)、以及基因脱毒的毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素和来自弧菌的霍乱毒素)。这种佐剂以及将佐剂与抗原组合的方法是本领域技术人员公知的。另外，用于组合抗原和颗粒佐剂的方法是本领域技术人员公知的。
术语“Gal1介导的病症”是指任何以异常的或者在其他情况下不需要的Gal1的表达为特征的状况。示例性的Gal1介导的病症包括，但不限于，癌症、血管生成、缺氧相关的血管生成和移植后淋巴增殖性疾病。半乳糖凝集素1(Gal1)的蛋白表达和转录丰度是高度相关的(Juszczynski等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:13134-13139；Ouyang等人(2011)Blood117:4315-4322andaccompanyingeditorialinBlood(2011)4317:4165-4166)。Gal1由多种肿瘤类型表达，包括选择的淋巴恶性肿瘤、病毒诱导的癌症和许多实体肿瘤。
例如，淋巴恶性肿瘤包括，但不限于，AP1依赖的淋巴恶性肿瘤，如经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)和间变性大细胞淋巴瘤(Juszczynski等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:13134-13139；Rodig等人(2008)Clin.CancerRes.14:3338-3344)。Gal1是cHL的预后标志物(Kamper等人(2011)Blood117:6638-6649)。Gal1还介导MLL重排的ALL。在全面的研究中，不管易位伴侣(translocationpartner)如何，所有32个原发性MLL重排的ALL都为Gal1+，而只有2/81的种系MLLALL表达Gal1(Juszczynski等人(2010)Clin.CancerRes.16:2122-2130)。MLL重排的ALL是需要不同的治疗的预后不良的疾病(Juszczynski等人(2010)Clin.CancerRes.16:2122-2130)。
Gal1介导的病毒诱导的恶性肿瘤包括，但不限于，EBV+的移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)(Ouyang等人(2011)Blood117:4315-4322和随附的在Blood(2011)4317:4165-4166中的评论)、鼻咽癌(Tang等人(2010)Oncol.Rep.24:495-500)和卡波济氏肉瘤(Croci等人(2012)J.Exp.Med.209:1985-2000)。
Gal1介导的实体肿瘤包括，但不限于，乳腺癌(Dalotto-Moreno等人(2013)CancerRes.73:1107-1117)、前列腺癌(Laderach等人(2013)CancerRes.73:86-96)、肺癌(Chung等人(2012)Clin.CancerRes.18:4037-4047)、胰腺癌(Chung等人(2008)ANZJ.Surg.78:245-251)、头颈鳞状细胞癌(Alves等人(2011)Pathol.Res.Pract.207:236-240；Le等人(2005)J.Clin.Oncol.23:8932-8941)、肝细胞癌(Wu等人(2012)J.Gastroenterol.Hepatol.27:1312-1319)和黑色素瘤(Mathieu等人(2012)J.Invest.Dermatol.132:2245-2254；Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251)。Gal1的表达也是所有上述实体肿瘤的不良预后的标志物，并且Gal1的沉默与乳腺癌(Dalotto-Moreno等人(2013)CancerRes.73:1107-1117)、前列腺癌(Laderach等人(2013)CancerRes.73:86-96)以及肺癌(Chung等人(2012)Clin.CancerRes.18:4037-4047)和黑色素瘤(Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251)中的抗肿瘤效应相关。此外，Gal1的转录物在多种类型的癌症中增加。
术语“血管生成”或者“新血管形成”是指新血管从预先存在的血管产生的过程(Varner等人(1999)Angiogen.3:53-60；Mousa等人(2000)Angiogen.Stim.Inhib.35:42-44；Kim等人(2000)Amer.J.Path.156:1345-1362；Kim等人(2000)J.Biol.Chem.275:33920-33928；Kumar等人(2000)Angiogenesis:FromMoleculartoIntegrativePharm.169-180)。作为对生长因子或激素信号(hormonalcue)、或者缺氧或缺血状况的应答，来自预先存在血管的或者来自循环内皮干细胞的内皮细胞(Takahashi等人(1995)Nat.Med.5:434-438；Isner等人(1999)J.Clin.Invest.103:1231-1236)被激活，以迁移、增殖和分化成具有管腔的结构，从而形成新的血管。在缺血期间，例如在癌症中发生的缺血期间，对增加氧化作用和递送营养物质的需求会明显诱导受影响的组织分泌血管生成因子；这些因子刺激新血管的形成。数个附加的术语涉及血管生成。
例如，术语“表现出血管生成的组织”是指在所述组织中，新血管正在从预先存在的血管产生。
本文使用的术语“抑制血管生成”、“减弱血管生成”、“减少血管生成”及其语法等同物是指将组织中的血管生成水平减少到这样的量：所述量是至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或者低于相应的对照组织中的量，并且最优选与在对照组织中观察到的水平相同。降低的血管生成水平无需意指绝对不存在血管生成(尽管有此可能)。本发明并不要求，并且不限于，完全消除血管生成的方法。如本文和实施例中所讨论，可以使用本领域公知的方法确定血管生成的水平，所述方法包括，但不限于，计数血管数量和/或血管分支点的数量。预期的替代性体外测定法包括管状索形成测定法，所述测定法在细胞水平下显示新血管的生长[D.S.Grant等人,Cell,58:933-943(1989)]。本领域公认的体内测定法也是已知的，并且涉及使用各种试验动物，例如鸡、大鼠、小鼠、兔等。这些体内测定法包括鸡尿囊绒膜(CAM)测定法，所述测定法适于显示正常组织和肿瘤组织中的抗血管生成活性(Ausprunk(1975)Amer.J.Path.79:597-610，以及Ossonowski和Reich(1980)CancerRes.30:2300-2309)。其他体内测定法包括小鼠转移测定法，所述测定法显示化合物在某些小鼠中降低移植瘤的生长速率、或者在易患癌症的或者表达化学诱导的癌症的小鼠中抑制肿瘤或者癌前细胞的形成的能力(Humphries等人(1986)Science233:467-470以及Humphries等人(1988)J.Clin.Invest.81:782-790)。此外，在一些实施方案中，可以根据诸如本文进一步描述的周细胞成熟和血管重塑等属性来测量血管生成。
本文使用的术语“缺氧相关的血管生成”或者“缺氧诱导的血管生成”一般是指在非肿瘤性疾病状态下的病理性血管生成过程并且通常，虽然不是必需地，伴有向肿瘤状态的转变。缺氧诱导的转录因子(HIF)诱发血管生成因子(包括HIF-1zlpha、VEGF、一氧化氮合酶、PDGF、Ang2等)的表达。因此，缺氧相关的血管生成包含一组公知的以这种过程为特征的病理状况，Pugh等人(2003)NatMed9,677-684；Fraisl等人(2009)DevCell16,167-179；Ferrara等人(2005)Nature438,967-974；Ferrara(2010)CytokineGrowthFactorRev21,21-26]。在一些实施方案中，所述缺氧相关的血管生成病理组包括，但不限于，肿瘤和癌症、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病和牛皮癣。
除非此处内另有说明，否则术语“抗体”和“多种抗体”广泛包含天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体(如单链抗体、嵌合的和人源化的抗体以及多特异性抗体)，以及所有前述抗体的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有一个抗原结合位点。抗体衍生物可以包括与抗体缀合的蛋白质或化学部分。“抗体”是指包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链包括重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域(CH1、CH2和CH3)。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，所述高变区称为互补决定区(CDR)，并穿插在被称为框架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其以以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。“失活的抗体”是指不诱导补体系统的抗体。
本文使用的术语“抗体”还包括抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)。本文使用的术语“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个保留了特异性结合抗原(例如，Gal1多肽或其片段)的能力的片段。已经显示，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”所包含的结合片段的例子包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包括由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分别的基因编码，但是可以使用重组的方法，通过合成接头接合VL和VH，所述合成接头能够将VL和VH制成为单个蛋白链，在所述单个蛋白链中，VL和VH区配对以形成单价多肽(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；andHuston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883以及Osbourn等人1998,NatureBiotechnology16:778)。这种单链抗体也包含在术语抗体的“抗原结合部分”范围内。可将特定scFv的任意VH和VL序列连接到人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列上，以产生编码完整的IgG多肽或其他同种型的表达载体。也可以通过使用蛋白质化学或者重组DNA的技术将VH和VL用于产生Fab、Fv或者免疫球蛋白的其他片段。还包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但是使用的接头太短以致于在同一条链上两个结构域之间不能配对，由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger,P.,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.,等人(1994)Structure2:1121-1123)。
更进一步地说，抗体或其抗原结合部分可以是较大的免疫粘附多肽的一部分，所述免疫粘附多肽通过所述抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白或肽的共价或者非共价的缔合而形成。这种免疫粘附多肽的例子包括使用链霉亲和素核心区域制备四聚体scFv多肽(Kipriyanov,S.M.,等人(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101)和使用半胱氨酸残基、标志物肽和C-末端的多组氨酸标签来制备二价的生物素化的scFv多肽(Kipriyanov,S.M.,等人(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。可以使用常规技术，例如对完整的抗体分别进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，来从完整的抗体制备抗体部分，例如Fab和F(ab')2片段。此外，如本文所述，可以使用标准的重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附多肽。
抗体可以是多克隆或单克隆的；异种的、同种异基因的或者同系的；或其修饰形式的(例如，人源化的、嵌合的等)。抗体也可以是全人的。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性地或者基本上特异性地结合Gal1多肽或其片段。本文使用的术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”是指仅含有一种能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点的抗体多肽群，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体多肽群。单克隆抗体组合物通常对与其发生免疫反应的特定抗原呈现出单一的结合亲和力。
术语“体液”是指从机体排泄或分泌的液体以及通常不从机体排泄或分泌的液体(例如羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊液、耳屎和耳垢、考珀液或预射精液、乳糜、食糜、粪便、雌性喷射液、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、乳汁、黏液、胸膜液、脓、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿、阴道润滑液、玻璃体液、呕吐物)。
术语“癌症”或者“肿瘤”或者“过度增殖性疾病”是指存在具有致癌细胞的典型特征(例如增殖失控、永生、转移潜能、快速的生长和增殖速率)以及某些特征性的形态特征的细胞。癌细胞经常是肿瘤的形式，但这种细胞可单独存在于动物内，或者可以是非致瘤性癌细胞，例如白血病细胞。癌症包括，但不限于，B细胞癌症(例如多发性骨髓瘤)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病(如，例如，α链病、γ链病和μ链病)，良性单克隆丙种球蛋白病、以及免疫细胞性淀粉样变、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统的癌症、外周神经系统癌、食道癌、子宫颈癌、子宫癌或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。
术语“CDR”及其复数“CDRs”，是指互补决定区(CDR)，其中三个构成轻链可变区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的结合特性，三个构成重链可变区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的结合特性。CDR贡献了抗体分子的功能活性，并且由组成骨架或框架区的氨基酸序列分开。具体定义的CDR边界和长度取决于不同的分类和编号系统。因此，根据Kabat、Chothia，CDR可以指接触或者任何其他的边界定义。尽管边界不同，这些系统中每个都在可变序列内组成所谓的“高变区”的部分具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统定义的CDR会在长度和相对于相邻框架区的边界区域上有所不同。参见例如Kabat，Chothia和/或MacCallum等人，(Kabat等人,in“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,”第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1992；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196,901；和MacCallum等人,J.Mol.Biol.(1996)262,732，其中每个的整体内容通过引用并入本文)。
本文使用的术语“编码区”是指包括被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域，而术语“非编码区”是指不被翻译成氨基酸的核苷酸序列区域(例如，5'和3'非翻译区)。
“互补的”是指广义概念上的在两个核酸链的区域之间或者在同一核酸链的两个区域之间的序列互补性。已知的是，第一核酸区域上的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域上的残基形成特定的氢键(“碱基配对”)，其中如果所述残基是胸腺嘧啶或者尿嘧啶的话，则所述第二核酸区域与第一区域反向平行。同样地，已知的是，第一核酸链上的胞嘧啶残基能够与第二核酸链上的残基进行碱基配对，其中如果所述残基是鸟嘌呤碱基，则所述第二核酸链与第一链反向平行。如果当两个区域以反向平行的方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基进行碱基配对，那么核酸第一区域与相同或者不同核酸的第二区域互补。在一个实施方案中，第一区域包括第一部分并且第二区域包括第二部分，其中，当第一和第二部分以反向平行的方式排列时，第一部分的核苷酸残基中的至少约50％，并且优选至少约75％、至少约90％、或者至少约95％能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。在另一实施方案中，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。
本文使用的术语“复合抗体”是指这样的抗体：其具有包括来自两个或更多个不相关可变区的种系或非种系免疫球蛋白序列的可变区。此外，术语“复合的人抗体”是指这样的抗体：其具有来自人种系或非种系免疫球蛋白序列的恒定区和包括来自两个或更多个不相关人可变区的人种系或非种系序列的可变区。由于复合的人抗体在人体中的抗原性降低，所述复合的人抗体能用作根据本发明的治疗剂中的有效成分。
术语“有效量”是指足以达到所需结果的量。例如，“预防有效量”是指足以减少病症发生的可能性的量。此外，“治疗有效量”是指有效减缓、停止或者逆转病症的进展的量。
本文使用的术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，包括天然序列的Fc区和变异的Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能会变化，但人IgG重链Fc区通常定义成从Cys226位点的氨基酸残基，或者从Pro230，伸展至其羧基末端。用于本发明的抗体中的合适的天然序列的Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
本文使用的“Fc受体”或者“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，FcγRIIA和FcγRIIB具有相似的氨基酸序列，所述氨基酸序列主要区别在于其胞质结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods4:25-34(1994)；和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述了FcR。本文的术语“FcR”包含其他FcR，包括未来将被鉴定的FcR。
如果分子共价或非共价地与底物缔合，使得所述底物可以被流体冲洗(例如标准的柠檬酸盐水，pH7.4)而无大部分分子从底物分离，那么所述分子被“固定”或者“粘附”到所述底物。
本文使用的“框架”或者“FR”残基是那些除本文所定义的HVR残基之外的可变结构域的残基。
“功能保守的变体”是指这样的变体：其中蛋白质或酶中给定的氨基酸残基已被改变，而不改变多肽的总体构象和功能，所述变体包括，但不限于，氨基酸被一个具有类似性质(如，例如，极性、氢键势能、酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸取代。除去被视为保守的那些氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可以有所不同，使得任意两个具有相似功能的蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可能不同，并且可以是，例如，根据比对方案(例如通过聚类方法)确定的从70％到99％，其中相似度以MEGALIGN算法为基础。“功能保守变体”还包括这样的多肽：其具有如通过BLAST或FASTA算法所确定的至少60％的氨基酸同一性，优选至少75％，更优选至少85％，进一步优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且其具有和与之相比较的天然或亲本蛋白质相同的或者基本相似的性质或功能。
本文使用的术语“异源抗体”是通过与产生这种抗体的非人转基因生物体进行比较来定义的。此术语是指具有与存在于不包括非人转基因动物的生物体中的氨基酸序列或者编码性核酸序列相对应的氨基酸序列或者编码性核酸序列的抗体，并且所述抗体通常来自除了非人转基因动物之外的物种。
本文使用的“同源的”是指同一核酸链的两个区域之间的或者两条不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据时，则所述区域在该位置处是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基的位置被相同的残基占据，那么第一区域和第二区域同源。用两个区域的被相同核苷酸残基占据的核苷酸残基位置的比例的形式来表示两个区域之间的同源性。举例而言，具有5'-ATTGCC-3'核苷酸序列的区域和具有5'-TATGGC-3'核苷酸序列的区域共有50％的同源性。优选地，第一区域包括第一部分并且第二区域包括第二部分，由此，每个部分的核苷酸残基位置的至少约50％，且优选至少约75％、至少约90％，或者至少约95％被相同的核苷酸残基占据。更优选地，每个部分的所有核苷酸残基位置由相同的核苷酸残基占据。
本文使用的术语“宿主细胞”旨在指已经引入本发明的核酸(例如本发明的重组表达载体)的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用。应当理解，这些术语不仅指特定的受试细胞，还指该细胞的后代或者潜在的后代。由于某些修饰可能因为突变或环境而在随后的代中出现，因此这些后代可能实际上不等同于亲本细胞，但是其仍然包括在本文使用的术语的范围内。
本文使用的术语“人源化的抗体”旨在包括由非人细胞制备的抗体，所述抗体具有已经被改变成更类似于由人细胞制备的抗体的可变区和恒定区。例如，通过改变非人类抗体的氨基酸序列来掺入存在于人种系免疫球蛋白序列的氨基酸。本发明的人源化的抗体可以，例如在CDR中，包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机的或者位点特异性的体外诱变或者通过体内的体细胞突变而引入的突变)。本文使用的术语“人源化的抗体”也包括这样的抗体：其中来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已被移植到人框架序列上。
本文使用的术语“高变区”、“HVR”或者“HV”，是指在序列高度可变的和/或形成结构上定义的环的抗体可变结构域区域。通常，抗体包括六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。在天然抗体中，H3和L3显示六个HVR的最丰富的多样性，特别地，H3被认为在赋予抗体精密的特异性中起到独特的作用。参见，例如，Xu等人(2000)Immunity13,37-45；Johnson和Wu在MethodsinMolecularBiology248,1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2003))中。实际上，天然存在的仅由重链组成的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下是功能性的并且稳定的(参见，例如，Hamers-Casterman等人(1993)Nature363:446-448(1993)和Sheriff等人(1996)NatureStruct.Biol.3,733-736)。
本文使用的术语“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞是造血起源的，并且包括淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
本文使用的术语“免疫检查点”是指CD4+和CD8+T细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子通过下调或者抑制抗肿瘤的免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白是本领域公知的并且包括，但不限于，CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPalpha(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、LAG-3、BTLA和A2aR(参见，例如，WO2012/177624)。能充当用于本发明的方法中的免疫检查点抑制剂的免疫治疗剂，包括，但不限于，用于任何一个或多个免疫检查点的封闭抗体。
本文使用的术语“免疫病症”包括免疫疾病、病况以及倾向于患有，包括，但不限于，霍奇金淋巴瘤(包括，例如，淋巴细胞丰富的经典霍奇金淋巴瘤、混合细胞型经典霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞耗竭经典霍奇金淋巴瘤、结节性硬化症经典霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或者MLL+前B细胞ALL)、癌症、慢性炎性疾病和病症(包括，例如，克罗恩氏病、炎性肠病、反应性关节炎和莱姆病)、胰岛素依赖型糖尿病、器官特异性自身免疫症(包括，例如，多发性硬化症、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性葡萄膜炎和格雷夫斯病)、接触性皮炎、牛皮癣、移植排斥、移植物抗宿主病、结节病、特应性病况(包括，例如，哮喘和过敏包括，但不限于，过敏性鼻炎和胃肠过敏如食物过敏)、嗜酸细胞增多、结膜炎、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、对某些病原体的易感性例如肠虫(包括，例如，利什曼病)和某些病毒感染(包括，例如，HIV和细菌感染如结核病和瘤型麻风)。
本文使用的术语“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如，细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括间接地受到T细胞活化影响的免疫应答，例如，抗体的产生(体液应答)和细胞因子应答细胞(例如，巨噬细胞)的活化。
术语“免疫”是指在受试者中产生针对抗原的免疫应答。这可以例如通过以下实现：向受试者施用初次免疫剂量(primarydose)的免疫原，随后在适当的时间段后一次或多次后续施用所述免疫原，以在所述受试者中产生针对所述免疫原的免疫应答。免疫原施用之间的合适的时间段可由本领域技术人员容易地确定，并通常是大约数周至数月。
本文使用的术语“抑制”或者“中和”包括降低、限制或者阻断例如，特定的活性、功能或者相互作用。例如，如果以希望的方式调节Gal1介导的感染或疾病的至少一个症状，例如免疫功能，则“抑制”了所述疾病。如本文所使用的，如果减少、减缓、延迟或者防止了疾病症状的复发，则也“抑制”了Gal1介导的感染或疾病。例如，可以将Gal1介导的活性降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多。在一些实施方案中，可以将术语“促进”用于与“抑制”完全相反的情况。
当本文使用的术语“相互作用”是指两个分子之间的相互作用时，其是指分子彼此间的物理接触(例如，结合)。通常，这种相互作用导致所述分子中的一者或两者的活性(其产生生物效应)。活性可以是分子中的一者或两者的直接活性，(例如，信号转导)。或者，可以阻止相互作用中的一个或两个分子结合其配体，并且因此可以在配体结合活性(例如，结合其配体并触发或抑制免疫应答)方面保持其失活。抑制这种相互作用导致对参与所述相互作用的一个或多个分子的活性的破坏。增强这种相互作用即延长或增加所述物理接触的可能性，并且延长或增加所述活性的可能性。
本文使用的术语“分离的抗体”是指这样的抗体：其基本上不含其他的具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异性结合人Gal1的并且基本上不含不结合Gal1的抗体的分离的抗体)。然而，特异性结合人Gal1的表位的分离的抗体可能与来自不同物种的其他Gal1蛋白分别具有交叉反应性。然而，在一些实施方案中，抗体保持对人Gal1的较高的亲和力和选择性。此外，分离的抗体通常基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，在明确定义的组合物中组合对人Gal1具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体组合。
本文使用的“分离的蛋白质”是指这样的蛋白质：当其分离自细胞或者通过重组DNA技术产生时基本上不含其他蛋白质、细胞材料、分离介质和培养基，或者当其被化学合成时基本上不含化学前体或者其他化学物质。“分离的”或者“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含有来自衍生出所述抗体、多肽、肽或融合蛋白的细胞或组织来源的细胞材料或者其他污染蛋白，或者当其被化学合成时基本上不含化学前体或者其他化学物质。语言“基本上不含细胞物质”包括目标多肽(例如，免疫球蛋白)或其片段的制剂，其中从细胞(蛋白质从所述细胞分离或重组产生)的细胞组分中分离所述蛋白质。在一个实施方案中，语言“基本上不含细胞物质”包括目标蛋白或其片段的制剂，其具有少于约30％(以干重计算)的非目标蛋白(本文中也称为“污染蛋白质”)，更优选少于约20％的非目标蛋白，更优选少于约10％的非目标蛋白，并且最优选少于约5％的非目标蛋白。当重组地生产抗体、多肽、肽或融合蛋白或者其片段(例如，其生物活性片段)时，还优选其基本上不含培养基，即，培养基少于所述蛋白制剂体积的约20％，更优选少于约10％，并且最优选少于约5％。
本文使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或者IgG1)。
本文使用的术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。可以通过标准的抗体-抗原测定法，例如，竞争性测定法、饱和测定法，或者标准的免疫测定法(如ELISA或RIA)测量或者确定本发明的抗体的结合亲和力。
本文使用的“试剂盒”是指包括至少一种试剂(例如探针)的用于特异性检测或调节本发明的标记物的表达的任何产品(例如包装盒或容器)。所述试剂盒可以作为用于执行本发明的方法的单元(unit)进行促销、分发或者售卖。
术语“标记”或者“标记的”是指任选共价或非共价地将可检测标记物掺入或者附着至分子(例如多肽)中。标记多肽的各种方法是本领域已知的并且是可以使用的。多肽的标记物的例子包括，但不限于以下：放射性同位素、荧光标记物、重原子、酶标记物或者报告基因、化学发光基团、生物素基团、由次级报告子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。下面更详细地描述了这些标记物的例子和用途。在一些实施方案中，通过各种长度的间隔臂来附接标记物，以减少潜在的空间位阻。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指针对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性，并且具有来源于人种系的或者非种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从非人转基因动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞，所述B细胞具有包括人重链转基因和轻链转基因的基因组，并且与永生化细胞融合。
除非另有定义，否则术语“基本上没有改变”、“基本上不受调节”等是指测量属性相对于参考对照的最小偏差。可以根据定量或定性的方法来测量偏差。在一个实施方案中，属性相对于对照的改变少于30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、1％或者差异更低(例如，残基间的差异、接近角(angles-of-approach)、抗体结合亲和力等)。
“移植后淋巴增殖性疾病”、“PTLD”和/或“病毒相关的PTLD”各自指病症，其中淋巴细胞(其为在淋巴组织(例如，淋巴结、脾和/或胸腺)中产生的白血细胞)被过度产生或者作用异常，并且由病毒引起或者与病毒相关。淋巴细胞包括，例如，胸腺衍生淋巴细胞(T细胞)；骨髓衍生淋巴细胞(B细胞)和自然杀伤细胞(NK细胞)。淋巴细胞经历了多个不同的阶段，包括增殖、活化和成熟，并且在每个阶段可能发展出淋巴瘤或者异常的增殖。病症可以是恶性肿瘤(并且可以分为侵袭性的或者惰性的，或者分为低级、中级或高级)，所述恶性肿瘤包括与IFN-γ相关的恶性肿瘤，或者病症可以涉及淋巴细胞的非恶性异常扩增。LPD包括任何只有治疗才能解决的和/或涉及过度细胞增殖的单克隆或者多克隆LPD，例如扩增的、单克隆的、多克隆的或者寡克隆的淋巴肿瘤。细胞性增殖可以比正常的更快，并且可以在引发新的生长的刺激停止之后继续。肿瘤会显示为部分或完全地缺乏结构组织以及与正常组织的功能协调，并且可以形成可能是良性(良性肿瘤)或者恶性的(癌症)不同组织块。
这种病毒相关的PTLD可以由以下引起或者与以下相关：例如，Epstein-Barr病毒(EBV)、疱疹病毒、HHV-8、巨细胞病毒、C型逆转录病毒、人类T淋巴细胞病毒1型(C型逆转录病毒)和/或人免疫缺陷病毒(HIV、HIV-1、HIV-2)。HIV和/或AIDS相关的癌症包括HIV相关的LPD，例如卡波西肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(HTLV-1+)和AIDS相关的淋巴瘤。免疫缺陷，例如在AIDS患者、器官移植接受者和遗传免疫病症中的免疫缺陷，可以允许潜伏的EBV重新活化，从而例如引起异常淋巴细胞的增殖和发展出EBV相关的LPD的潜能。检测异常细胞(例如，PTLD中涉及的细胞)中病毒或病毒感染的存在的方法是本领域已知的。例如，可在细胞、组织或生物体(如异常细胞)中检测病毒的核酸或多肽。此外，检测特异性针对病毒的免疫应答的方法是已知的。例如，可以使用迟发型-超敏反应(DTH)测定法，例如体内转移性DTH测定法来检测调节性T细胞。在这种测定法中，可以将人或其他哺乳动物的外周血单核细胞(PBMC)与，例如，具有和不具有病毒抗原的运载体对照进行混合，并且注射进异源的初次接种的受体(例如初次接种的小鼠的耳廓或足垫)中。如果先前已使PBMC的供体对激发抗原(challengeantigen)敏感，那么会观察到DTH样的肿胀反应。
本文使用的术语“调节”包括上调和下调，例如，增强或者抑制应答。
标志物表达的“正常”水平是所述标志物在未患有病毒相关PTLD的受试者(例如，人类患者)的细胞中的表达水平。标志物的“过表达”或者“显著更高的表达水平”是指测试样本中的这样的表达水平：其比用来评估表达的测定法的标准误差更高，并且优选为标志物在对照样本(例如，来自没有所述标志物相关疾病的健康受试者的样本)中的表达水平(优选标志物在几个对照样本中的平均表达水平)的至少两倍，更优选三倍、四倍、五倍或者十倍。标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样本中的这样的表达水平：其比标志物在对照样本(例如，来自没有所述标志物相关疾病的健康受试者的样本)中的表达水平(优选标志物在几个对照样本中的平均表达水平)低至少两倍，并且更优选三倍、四倍、五倍或者十倍。
本文使用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。关于编码结合Gal1的抗体或抗体部分(例如，VH、VL、CDR3)的核酸的本文使用的术语“分离的核酸分子”旨在指这样的核酸分子：其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合除Gal1以外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，所述其他序列可以天然位于人类基因组DNA中的核酸的侧面。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，其是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或者增强子影响编码序列的转录，则认为其可操作地连接至所述序列。关于转录调节序列，可操作地连接是指所连接的DNA序列是连续的，并且当需要接合两个蛋白编码区时，所连接的DNA序列是连续的并且在阅读框内。对于开关序列，可操作地连接表示所述序列能够影响开关重组。
标志物的“过表达”或者“显著更高的表达水平”是指在测试样本中的这样的表达水平：其高于用来评估表达的测定法的标准误差，并且优选为所述标志物在对照样本(例如，来自不患有所述标志物相关疾病的健康受试者的样本)中的表达活性或水平(优选所述标志物在几个对照样本中的平均表达水平)的至少两倍，更优选1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或以上。标志物的“显著更低的表达水平”是指在测试样本中的这样的表达水平：其比所述标志物在对照样本(例如，来自不患有所述标志物相关疾病的健康受试者的样本)中的表达水平(优选所述标志物在几个对照样本中的平均表达水平)低至少两倍，并且更优选低1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或以上。
当相对于参照多肽使用术语“多肽片段”或者“片段”时，其是指这样的多肽：其中相较于参照多肽本身缺失了氨基酸残基，但是其中剩余的氨基酸序列通常与参照多肽中的相应位置相同。这种缺失可以发生在参照多肽的氨基末端或者羧基末端内部，或者兼而有之。片段通常是至少5、6、8或10个氨基酸的长度，至少14个氨基酸的长度，至少20、30、40或50个氨基酸的长度，至少75个氨基酸的长度，或者至少100、150、200、300、500或更多个氨基酸的长度。只要它们小于全长多肽的长度，它们可以是，例如，至少和/或包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、1020、1040、1060、1080、1100、1120、1140、1160、1180、1200、1220、1240、1260、1280、1300、1320、1340个或更多个氨基酸的长度，或者长度小于这些氨基酸，或者在这些数值之间(含这些数值)的任何范围。或者，只要它们小于全长多肽的长度，它们可以不长于和/或排除这样的范围。所述范围还可以包括目的多肽结构域，例如Gal1的F5β链结构域，其是本领域公知的，并且长度在55和59个氨基酸之间。
本文使用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因位点的构型，其中V区段以基本上编码完整的VH和VL结构域的构象分别位于紧邻D-J或者J区段的位置上。可以通过对比种系DNA来鉴定重排的免疫球蛋白基因位点；重排的位点将至少具有一个重组的七聚体/九聚体同源要素。
本文使用的术语“重组的”是指这样的生物材料(例如核酸、蛋白质、抗体、细胞等)：其通过人手的操纵或者改造以制成非天然存在的状态。例如，“重组的宿主细胞”(或者简称为“宿主细胞”)旨在指已经被引入了重组型表达载体的细胞。应当理解，这种术语不仅旨在指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代。由于某些修饰可能因为突变或者环境的影响而在随后的代中出现，因此这些后代可能实际上不等同于亲本细胞，但仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
本文使用的术语“重组的人抗体”包括所有通过重组的方法制备、表达、产生或者分离的人抗体，例如(a)从动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤(下面进一步描述)中分离的抗体，所述动物对于人免疫球蛋白基因是转基因的或者转有染色体的，(b)从宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，所述宿主细胞经转化以表达所述抗体，(c)从重组的、组合性人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或者分离的抗体。这种重组的人抗体具有来源于人种系和/或非种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这种重组的人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，进行体内的体细胞诱变)，因此所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：其虽然来源于人种系的VH和VL序列并且与之相关，但是在体内可以不天然存在于人抗体种系库中。
本发明中，“应答”一般涉及，例如，确定对临床干预的进展、疗效或者结果的效应。在一些实施方案中，应答与临床干预(例如，施用抗-Gal1单克隆抗体)开始后的肿瘤质量和/或体积的变化直接相关。例如，可以根据通过CT、PET、乳房X光检查、超声或者触诊测量的在全身性干预之后的肿瘤尺寸与初始尺寸及大小的比较，评估过度增殖性疾病的应答。也可以在活体检查或者在手术切除之后，通过对肿瘤的卡尺测量或者病理检查来评估应答。可以以定量的方式(如肿瘤体积的百分比变化)，或者以定性的方式(如“病理完全反应”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或者其他定性标准)来记录应答。可以在临床干预开始后的早期，例如，几小时、几天、几周之后或者优选几个月之后完成评估。应答评估的典型终点是在终止临床干预时或者在手术去除残留的肿瘤细胞和/或肿瘤床时。
本文使用的术语“特异性结合”是指抗体与预定抗原的结合。通常，当将人Gal1用作分析物以及将抗体用作配体，在测试仪器通过表面等离子共振(SPR)技术进行测定时，所述抗体以约小于10-7M，例如约小于10-8M、10-9M或者10-10M或者甚至更低的亲和力(KD)进行结合，并且以其结合除预定抗原或者密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或者10.0倍或者更多倍的亲和力结合预定抗原。本文中，短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”互换地与术语“特异性结合抗原的抗体”一起使用。
本文使用的“受试者”是指任何健康的动物、哺乳动物或人，或者任何患有Gal1介导的病症的动物、哺乳动物或人。可以互换使用术语“受试者”和“患者”。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
术语“基本上不含化学前体或其他化学物质”包括抗体、多肽、肽或者融合蛋白制剂，其中蛋白质分离自参与所述蛋白质的合成的化学前体或其他化学物质。在一个实施方案中，术语“基本上不含化学前体或其他化学物质”包括这样的抗体、多肽、肽或者融合蛋白制剂：其具有少于约30％(以干重计算)的化学前体或者非抗体、多肽、肽或者融合蛋白化学物质，更优选少于约20％的化学前体或者非抗体、多肽、肽或者融合蛋白化学物质，还更优选少于约10％的化学前体或者非抗体、多肽、肽或者融合蛋白化学物质，以及最优选少于约5％的化学前体或者非抗体、多肽、肽或者融合蛋白化学物质。
本文使用的术语“存活”包括以下所有：存活直至死亡，也称为总存活期(其中所述死亡可以是不论何种原因的或者是无关乎肿瘤的死亡)；“无复发存活期”(其中所述术语复发应当包括局部复发和远处复发)；无转移存活；无疾病存活期(其中所述术语疾病应当包括癌症和与之相关的疾病)。可通过参照定义的起点(例如诊断的时间或者治疗开始的时间)和终点(例如死亡、复发或者转移)计算所述存活的长度。此外，可以将治疗功效的标准扩展至包括对化疗的应答、存活概率、在给定时间段内的转移概率以及肿瘤复发的概率。
“转录的多核苷酸”或者“核苷酸转录物”是与成熟mRNA的全部或者其一部分互补或者同源的多核苷酸(例如，mRNA、hnRNA、cDNA、或者这种RNA或cDNA的类似物)，所述成熟mRNA通过以下制成：本发明的标志物的转录和(如果有的话)对RNA转录物的正常的转录后加工(例如剪接)，以及RNA转录物的反转录。
本文使用的术语“T细胞”包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞还包括T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞。术语“抗原递呈细胞”包括专职抗原递呈细胞(例如，B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞)以及其他抗原递呈细胞(例如，角质形成细胞、内皮细胞、星型胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)。
本文使用的关于V区段的术语“未重排的”或者“种系构型”是指这样的构型：其中V区段没有重组，以便紧邻D或者J区段。
本文使用的术语“载体”是指这样的核酸：其能够将另一核酸转运至其已连接的核酸处。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，另外的DNA区段可以连接至其中。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在被引入宿主细胞时被结合到所述宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组型表达载体”或者简称“表达载体”。通常，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒的形式。由于质粒是最常用的载体形式，因此在本说明书中可以互换使用“质粒”和“载体”。然而，本发明旨在包括发挥等效功能的这类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
对于核酸，术语“基本同源性”指两个核酸或者其指定的序列，当进行最佳比对和比较时，在具有适当的核苷酸插入或缺失的情况下，其至少约80％的核苷酸，通常至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、或者更多的核苷酸，以及更优选至少约97％、98％、99％或者更多的核苷酸是相同的。或者，当区段在选择性杂交条件下与链的互补链杂交时，存在基本同源性。
当考虑空位数和每个空位的长度(需要将其引入以用于两个序列的最佳比对)时，两个序列间的同一性百分比是所述序列所共有的相同位点数的函数(即，同一性百分比＝相同位点数/总位点数×100)。如以下非限制性实施例中所述，可以使用数学算法来完成序列的比对以及两个序列之间的同一性百分比的测定。
可以使用GCG软件包(可从GCG公司的互联网站上得到)中的GAP程序，采用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或者80的空位权重和1、2、3、4、5或者6的长度权重，来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。也可以使用已被并入ALIGN程序(2.0版本)的E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS,4:1117(1989))，采用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分和4的空位罚分，来确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已被并入GCG软件包(可从GCG公司的互联网站上得到)中GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444453(1970))的算法，采用Blosum62矩阵或者PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或者4的空位权重和1、2、3、4、5或者6的长度权重，来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库执行搜索以例如鉴定相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:40310的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)来执行这样的搜索。可以用NBLAST程序，分值(score)＝100，字长＝12，来执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，分值(score)＝50，字长＝3，来执行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于对比的空位比对(gappedalignments)，可以如Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25(17):33893402中所述利用GappedBLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)默认参数(可从NCBI的互联网站上得到)。
核酸可以存在于完整的细胞中、细胞裂解物中、或者以部分纯化或基本纯化的形式存在。当通过标准的技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域公知的技术(参见，F.Ausubel,等人,ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)))将核酸从其他细胞组分或者其他污染物(例如，其他细胞核酸或蛋白质)中纯化时，核酸是“分离的”或者“表现基本上纯化的”。
在进一步描述本发明之前，应当理解，已经在整个说明书中引用了具体的序列标识符(SEQIDNO)用于说明的目的，因此其不应被解释成是限制性的。本发明所述任何标志物，包括，但不限于，本说明书中所述的标志物，并且本文所述标志物在本领域中是公知的并且可以用于本发明所述的实施方案。
还应当理解，本发明不局限于所述的特定实施方案，因为这些当然可以有所不同。也应当理解，本文所使用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并且不意图进行限制。
当提供数值范围时，应当理解，本发明包括每个中间值(除非上下文另有明确说明，否则所述中间值低至下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间)，以及在指定范围之内的任何其他指定值或者中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且也包括在本发明内，只要不是指定范围内的任何特定排除的限值。当指定范围包括所述限值中的一者或两者时，排除那些包括的限值中的任一者或两者的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然也可以在本发明的实践或测试中使用任何与本文描述的方法和材料类似的或者等同的方法和材料，现在描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，以公开和描述与所述出版物的引用内容相联系的方法和/或材料。
必须指出，除非上下文清楚地另有规定，否则本文和所附权利要求书中使用的单数形式“一”、“和”和“所述”包括复数引用。因此，例如，对“多肽”的指代包括多个多肽，对“活性剂”的指代包括对本领域技术人员已知的一种或多种活性剂及其等同物的指代，等等。还进一步指出，可以将权利要求撰写成排除任何可选的要素。这样，本声明旨在充当与记载权利要求要素相关的这类排除性术语(如“仅”、“只”等)的使用或者“负”限制的使用的前提基础。
本文所讨论的出版物仅仅是由于其公开先于本申请的申请日而被提供。本文中没有任何地方可以被理解为承认本发明没有资格凭借先前的发明先于这些出版物。此外，所提供的出版物的日期可以与实际出版日期不同，所述实际出版日期可能需要单独确认。
II.多肽、抗体和免疫原性组合物
本发明部分涉及可用作用于中和Gal1活性的靶点的Gal1表位。这种表位可以用于针对Gal1并且中和Gal1活性的分离的试剂，例如抗体或其片段。基于下面的实施例中进一步描述的结构-功能关系，这些分子的特征在于其显示出中和Gal1蛋白的功能的意想不到的能力。
Gal1基因和基因产物的序列、结构、结构域、生物物理特性和功能在本领域中已有描述。参见，例如，Rabinovich等人(2002)TrendsImmunol.23:313-320；Liu和Rabinovich(2005)Nat.Rev.Cancer5:29-41；Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251；Le等人(2005)J.Clin.Oncol.23:8932-8941；Vasta等人(2004)CurrOpinStructBiol14:617-630；Toscano等人(2007)Cyt.GrowthFact.Rev.18:57-71；Camby等人(2006)Glycobiol.16:137R-157R；美国专利公开号2003-0004132、2003-0109464、2006-0189514、2009-0176223、2009-0191182、2012-0028825和2013-0011409，其每一个的全部内容在此均通过引用并入。公众可在GenBank数据库中的NM_002305.3和NP_002296.1编号下获得代表性的人Gal1生物标志物的核酸和氨基酸序列。在除人以外的生物体中的Gal1直向同源物的核酸和多肽序列是公知的，并且包括，例如，猴Gal1(NM_001168627.1和NP_001162098.1)、猩猩Gal1(XM_003953882.1和XP_003953931.1；XM_003953883.1和XP_003953932.1；XM_001162104.3和XP_001162104.1)、小鼠Gal1(NM_008495.1和NP_032521.1)、大鼠Gal1(NM_019904.1和NP_063969.1)、狗Gal1(NM_001201488.1和NP_001188417.1)、鸡Gal1(NM_206905.1和NP_996788.1)和牛Gal1(NM_175782.1和NP_786976.1)。例如，可用于检测的相关Gal1序列包括在下面表3中列出的那些：
表3
SEQIDNO.1：人Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.2：人Gal1的氨基酸序列
SEQIDNO.3：小鼠Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.4：小鼠Gal1的氨基酸序列
SEQIDNO.5：猴Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.6：猴Gal1的氨基酸序列
SEQIDNO.7：猩猩Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.8：猩猩Gal1的氨基酸序列
SEQIDNO.9：大鼠Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.10：大鼠Gal1的氨基酸序列
SEQIDNO.11：狗Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.12：狗Gal1的氨基酸序列
SEQIDNO.13：鸡Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.14：鸡Gal1的氨基酸序列
SEQIDNO.15：牛Gal1的cDNA序列
SEQIDNO.16：牛Gal1的氨基酸序列
然而，迄今为止还没有公开过与Gal1表位的中和相关联的Gal1表位。因此，本发明提供了重组的和/或分离的Gal1肽或其片段，包括Gal1表位，针对所述Gal1表位的抗-Gal1试剂能结合并中和Gal1的活性。一方面，这种Gal1多肽可以包括包含整个F5β片层序列或其一部分的全长Gal1的片段，基本上由所述片段组成，或者由所述片段组成。另一方面，Gal1多肽可以包括少于或者等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、或者其间任何范围的序列或其直系同源物，基本上由所述序列或其直系同源物组成，或者由所述序列或其直系同源物组成，所述序列包括SEQIDNO:1-16中任一者的第102-115位残基。在本发明的Gal1多肽的一个实施方案中，所述多肽可以包括至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、或者100％等同于SEQIDNO:1-16中任一者的第102-115位残基的序列或其直系同源物。在本发明的Gal1多肽的另一实施方案中，所述多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20或者更多个保守的氨基酸取代。在另一实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包括本文所述的重组多肽以及少于约25％、或者15％、或者5％的污染性生物大分子或者多肽。
在某些实施方案中，本发明的多肽可以进一步包括异源序列。例如，提供了含有结构域的融合蛋白，所述结构域提升了多肽溶解性和生物利用度和/或有助于其纯化、鉴定、检测和/或结构表征。在这样的实施方案中，异源部分不应显著改变Gal1中和表位的免疫原活性和/或构象。示例性的结构域，包括，例如，谷胱甘肽S-转移酶(GST)、蛋白A、蛋白G、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、HA、myc、聚精氨酸、聚His、聚His-Asp或者FLAG融合蛋白和标签。另外的示例性结构域包括改变蛋白质体内定位的结构域，例如信号肽、III型分泌系统靶向肽、胞转结构域、核定位信号等。在各种实施方案中，本发明的多肽可以包括一个或多个异源融合。多肽可以包含相同融合结构域的多个拷贝，或者可以包含与两个或更多个不同结构域的融合。融合可以作为框内插入在多肽内发生，在多肽的N末端发生，在多肽的C末端发生，或者在多肽的N-和C-末端两者发生。在本发明范围内还包括在本发明的多肽和融合结构域之间的连接序列，以促进融合蛋白的构建或者优化融合蛋白的蛋白表达或结构约束。在另一实施方案中，可以构建多肽以在融合多肽和本发明的多肽之间含有蛋白酶切位点，从而在蛋白表达之后或者随后除去标签。合适的内切蛋白酶的例子包括，例如，因子Xa和TEV蛋白酶。
在一些实施方案中，将目的多肽或其片段融合至抗体片段(例如，Fc多肽)。用于制备这些融合蛋白的技术是已知的，并且描述于，例如，WO99/31241和Cosman等人,2001Immunity14:123133中。与Fc多肽的融合提供这样的额外优势：其促进了通过在蛋白A或者蛋白G柱上的亲和层析法而进行的纯化。
在另一实施方案中，可以将目的多肽或其片段连接至可检测物质。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或者乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或者3H。用于检测本发明的多肽的体内技术包括向受试者引入针对蛋白的标记抗体。例如，可以用放射性标记物标记抗体，所述放射性标记物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术进行检测。
在具体的实施方案中，可以用荧光标记物标记目的多肽或其片段，以促进对其的检测、纯化或者结构表征。在示例性实施方案中，可以将目的多肽或其片段与产生可检测的荧光信号的异源多肽序列融合，所述异源多肽序列包括，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、海肾绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、来自珊瑚的柠檬黄和红色荧光蛋白(dsRED)。
还提供了本文所述的包含Gal1中和性表位的多肽的片段。例如，预期某些序列(例如，蛋白水解切割位点、信号序列等)的缺失或者替换不显著影响Gal1中和性表位的免疫原活性和/或构象。
可以通过重组DNA技术来产生本文所述目的多肽或其片段。例如，将编码蛋白的核酸分子克隆进表达载体(如下所述)，将表达载体引入宿主细胞(如下文所述)以及将蛋白在宿主细胞中表达。随后可以使用标准的蛋白质纯化技术，通过适当的纯化方案而从细胞中分离目的蛋白。作为重组表达的替代，可以使用标准的肽合成技术化学合成目的蛋白或其片段。此外，例如，可以通过使用抗体从细胞(例如，淋巴瘤细胞)中分离天然蛋白(如下所述)。
另一方面，可以使用用于多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将本发明的多肽用作免疫原来产生结合Gal1中和性表位的中和剂(例如，抗体、适体等)。可以通过用本文进一步描述的免疫原免疫合适的受试者(例如，人、猴、兔、山羊、小鼠或者其他哺乳动物)，使用多肽或者编码或产生所述多肽的试剂(例如，核酸、载体、宿主细胞等)来制备抗体。合适的免疫原制剂可以含有，例如，重组表达的蛋白质或者化学合成的蛋白质。所述制剂可以进一步包括佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或者类似的免疫刺激剂。
用本文所述的免疫原试剂免疫受试者诱导多克隆抗-Gal1中和性抗体的应答。可以通过标准技术，例如用使用固定化靶蛋白的酶联免疫吸附测定法(ELISA)，随时间监测被免疫的受试者中的多克隆抗体滴度。如果需要的话，可以从哺乳动物(例如，从血液)中分离针对Gal1中和性表位的抗体分子，并且通过公知的技术(例如蛋白A层析法)进一步纯化以获得IgG组分。在免疫接种后的适当时间，即当目的抗体滴度最高时，产生抗体的细胞可以获自受试者并且用于制备单克隆抗体。
本文使用的术语“单克隆抗体”或者“单克隆抗体组合物”是指抗体分子群，所述抗体分子群仅含有一种能够与Gal1的特定中和性表位发生免疫反应的抗原结合位点。因此，单克隆抗体组合物通常对于与其发生免疫反应的特定蛋白显示出单一的结合亲和力。这些可以通过使用标准技术制得，例如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature256:495-497)描述的杂交瘤技术(还可以参阅，Brown等人(1981)J.Immunol.127:539-46；Brown等人(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh等人(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:2927-31；和Yeh等人(1982)Int.J.Cancer29:269-75)、更为新近的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人(1983)Immunol.Today4:72)、EBV-杂交瘤技术(Cole等人(1985),MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,第77-96页)或者三源杂交瘤技术。用于生产单克隆抗体杂交瘤的技术是公知的(一般参见R.H.Kenneth,inMonoclonalAntibodies:ANewDimensionInBiologicalAnalyses,PlenumPublishingCorp.,NewYork,NewYork(1980)；E.A.Lerner(1981)YaleJ.Biol.Med.,54:387-402；M.L.Gefter等人(1977)SomaticCellGenet.3:231-36)。简单地说，将永生细胞系(通常是骨髓瘤)和来自如上所述的用免疫原试剂免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常是脾细胞)融合，并且筛选所得杂交瘤细胞的培养物上清液，以鉴定产生结合Gal1的中和性表位的单克隆抗体的杂交瘤。
可将用于融合淋巴细胞和永生化细胞系的许多公知方法中的任一种应用于产生抗-Gal1中和性单克隆抗体的目的(参见，即，G.Galfre等人(1977)Nature266:550-52；Gefter等人SomaticCellGenet.，上文中已有引用；Lerner,YaleJ.Biol.Med.，上文中已有引用；Kenneth,MonoclonalAntibodies，上文中已有引用)。此外，普通技术人员应当理解，这样的方法有许多变化，这些变化也将会是有用的。通常，永生化细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)来源于与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，可以通过将来自用本发明的免疫原制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与永生化小鼠细胞系融合来制备鼠杂交瘤。优选的永生化细胞系是对含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。按照标准技术，多个骨髓瘤细胞系中的任一种可以用作融合伙伴(fusionpartner)，即P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或者Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系可从ATCC获得。通常，使用聚乙二醇(“PEG”)将HAT敏感性小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。随后使用HAT培养基选择从融合得到的杂交瘤细胞，所述HAT培养基会杀死未融合的和非生产性融合的(unproductivelyfused)骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞由于未经转化而会在数天后死亡)。通过筛选杂交瘤培养物上清液中是否含有结合Gal1的中和性表位的抗体，即，通过使用标准的ELISA测定法，来检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
III.核酸、载体和重组型宿主细胞
本发明的另一目的涉及编码本发明的与中和Gal1活性相关的Gal1表位、抗体(例如，单克隆抗体)及其片段、免疫球蛋白和多肽的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了具有编码本发明的肽或者抗体的序列的核酸分子。本文使用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(即，cDNA或者基因组DNA)和RNA分子(即，mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或者双链的，但优选是双链DNA。“分离的”核酸分子是分离自存在于核酸的天然来源中的其他核酸分子的核酸分子。优选地，“分离的”核酸不含这样的序列：其天然位于所述核酸所来源的生物体的基因组DNA中的核酸的侧面(即，位于核酸的5'和3'端的序列)。例如，在各种实施方式中，重组的和/或分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或者0.1kb的天然位于病毒DNA中的核酸分子的侧面的核苷酸序列。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可以基本上不含其他细胞物质，或者当其通过重组技术生产时其基本上不含培养基，或者当其被化学合成时其基本上不含化学前体或其他化学物质。
本发明的核酸分子(例如，在表3中所公开的核酸分子或其直向同源物或者编码本文所述的多肽的核酸分子)也可以是核苷酸序列，所述核苷酸序列至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，还更优选至少约90％，并且最优选至少约95％，96％，97％，98％，99％或更高地与这种核苷酸序列相同，可以使用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息对其进行改造和分离(即，如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中所述)。此外，这样的核酸可以通过聚合酶链反应，使用基于本文所述序列或其直系同源物而设计的寡核苷酸引物而进行分离。例如，可从含有核酸模板的相关来源分离RNA或DNA(即，通过Chirgwin等人(1979)Biochemistry18:5294-5299所述的硫氰酸胍提取法)，可以使用逆转录酶来制备cDNA(即，莫洛尼MLV逆转录酶，可购自Gibco/BRL，Bethesda,MD；或者AMV逆转录酶，可购自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL)。可以设计用于PCR扩增的合成性寡核苷酸引物。可以根据标准的PCR扩增技术，使用cDNA或者基因组DNA作为模板，以及合适的寡核苷酸引物来扩增本发明的核酸。如此扩增的核酸可被克隆进合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，可以通过标准的合成技术，即，使用自动化DNA合成仪来制备对应于本发明的核酸序列的寡核苷酸。
在另一实施方案中，核酸编码与本文所述Gal1表位序列具有至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性的蛋白质或其片段。
本领域技术人员应当理解，在种群(例如，哺乳动物和/或人种群)内可以存在导致多肽的氨基酸序列发生变化的DNA序列多态性。由于天然的等位基因变异，基因内的这种基因多态性可以存在于种群的个体中。本文使用的术语“基因”和“重组基因”指包括编码本发明的多肽(优选哺乳动物多肽)的开放阅读框的核酸分子。这种天然的等位基因变异通常会导致基因的核苷酸序列的1-5％的差异。本发明范围旨在包括任何的以及所有的这种核苷酸变异，以及多肽中的源于天然的等位基因变异且不改变多肽的功能活性的所得氨基酸多态性。可以分离对应于天然等位基因变体和目的同源物的核酸分子。
除了存在于种群中的序列的天然存在的等位基因变体，本领域技术人员应当进一步理解，可以通过突变成表3所示的相关Gal1表位核酸序列或其直向同源物的核苷酸序列来引入变化，从而导致被编码的蛋白质的氨基酸序列发生变化，而不改变蛋白的功能性能力(例如，中和表位)。例如，可以在序列中制备导致在“非必需”氨基酸残基处发生氨基酸取代的核苷酸取代。“非必需”氨基酸残基是这样的残基：其可以改变自野生型序列而不显著改变免疫原性或构象，而“必需”氨基酸残基是影响免疫原性或者构象的残基。然而，其他氨基酸残基(例如，在小鼠和人之间不保守的或者仅半保守的氨基酸残基)可能对于活性不是必需的，并且因此可能易发生变化而不改变多肽活性。
术语“序列同一性或者同源性”是指两个多肽分子之间或者两个核酸分子之间的序列相似性。当两个被比序列两者中的某个位置被相同的碱基或者氨基酸单体亚单位占据时，例如，如果两个DNA分子每个中的某个位置由腺嘌呤占据时，则所述分子在该位置是同源的或者序列同一的。两个序列之间的同源性或者序列同一性的百分比是所述两个序列共有的匹配的或者同源的相同位置数除以被比较的位置数x100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个相同，那么所述两个序列为60％同源的或者具有60％的序列同一性。举例而言，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性或者序列同一性。通常，当比对两个序列时，进行比较以给出最大同源性。除非另指出，否则“环出区(loopoutregions)”(例如那些来自序列之一内的缺失或者插入的那些)都被视为错配。
可以使用数学算法来完成序列的对比以及确定两个序列之间的同源性百分比。优选地，可以使用Clustal方法进行比对。多重比对参数包括空位罚分＝10，空位长度罚分＝10。对于DNA比对，配对比对参数可以是Htuple＝2，空位罚分＝5，窗(Window)＝4，以及对角线保存(Diagonalsaved)＝4。对于蛋白质比对，配对比对参数可以是Ktuple＝1，空位罚分＝3，窗(Window)＝5，以及对角线保存(DiagonalsSaved)＝5。
在优选的实施方案中，使用已被并入GCG软件包(可在线获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法，采用Blossom62矩阵或者PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或者4的空位权重和1、2、3、4、5或者6的长度权重，确定两个氨基酸序列间的同一性百分比。在另一优选的实施方案中，使用GCG软件包(可在线获得)中的GAP程序，采用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或者80的空位权重和1、2、3、4、5或者6的长度权重，确定两个核苷酸序列间的同一性百分比。在另一实施方案中，使用已被并入ALIGN程序(2.0版本)(可在线获得)的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))算法，采用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和缺口罚分4，确定两个氨基酸或者核苷酸序列间的同一性百分比。
可以通过在模板的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，来产生编码Gal1中和性表位的分离的核酸分子，或其直系同源物或片段。可以通过标准技术，例如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入突变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是这样的取代：其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自同一侧链家族的另一氨基酸残基取代预测的非必需氨基酸残基。或者，在另一实施方案中，可以例如通过饱和诱变沿着靶编码序列的全部或者部分随机引入突变，并且对所得到的突变体进行筛选以找到本文所述的靶多肽活性，以鉴定保留多肽活性的突变体。在诱变后，可以重组表达(如本文所述)所编码的蛋白质，并且可以使用，例如，本文所述的测定法来确定蛋白质的活性。
可通过各种公知的用于检测被转录分子或蛋白的表达的方法中的任一种来评估目的蛋白(例如，含有Gal1中和性表位的肽或者目标Gal1多肽)的水平。这种方法的非限制性例子包括用于检测蛋白质的免疫学方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸反转录法和核酸扩增法。
在一些实施方案中，通过测量基因转录物(例如，mRNA)、通过测量翻译的蛋白的量，或者通过测量基因产物活性，来确定这种蛋白质表达水平。可以通过各种方式监测表达水平，包括通过检测mRNA水平、蛋白水平或者蛋白活性，其中任何一种都可以通过使用标准技术来测量。检测可以涉及基因表达水平的量化(例如，基因组DNA、cDNA、mRNA、蛋白质、或者酶活性)，或者可以是基因表达水平的定性评估，尤其是与对照水平进行比较。上下文将清楚地显示所检测的水平的类型。
在其他实施方案中，可以使用本领域已知的方法在生物样本中通过原位方式和通过体外的方式来确定mRNA表达水平。术语“生物样本”旨在包括分离自受试者的组织、细胞、生物体液及其分离物，以及存在于受试者体内的组织、细胞和体液。许多检测表达的方法使用分离的RNA。对于体外方法，任何不排斥(selectagainst)分离mRNA的RNA分离技术都可用于从细胞中纯化RNA(参见，例如，Ausubel等人,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork1987-1999)。此外，可以使用本领域技术人员公知的技术，例如Chomczynski的RNA一步分离法(1989，美国专利号4,843,155)，来便利地处理大量的组织样本。
分离的mRNA可以用于杂交或者扩增测定法，所述杂交或者扩增测定法包括，但不限于，Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。
作为对基于绝对表达水平进行测定的替代，测定可以基于标准化表达水平。通过将器表达与非靶基因(例如，管家基因或者其他组成型表达的参考基因)的表达进行比较来校正绝对表达水平，从而标准化表达水平。用于标准化的合适的基因包括管家基因如肌动蛋白基因，或者上皮细胞特异性基因。此标准化允许将一个样本(例如，受试者样本)中的表达水平与另一样本(例如，标准的样本)中的表达水平作比较，或者在来自不同来源的样本之间作比较。
还可以通过检测或定量所表达的多肽来检测和/或定量多肽的水平或者活性。可以通过一系列本领域技术人员公知的方法中的任一种检测和定量所需多肽。这些可以包括分析生化法(如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法等)，或者各种免疫学方法(如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫荧光测定法、Western印迹法等)。熟练的技术人员可以很容易地运用已知的蛋白质/抗体检测方法来用于确定细胞是否表达目的多肽。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以被包括于任何合适的载体中，例如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或者病毒载体。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指这样的媒介物：通过所述媒介物可以将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入宿主细胞中，以转化宿主并促进被引入的序列的表达(例如，转录和翻译)。因此，本发明的另一目的涉及包括本发明的核酸的载体。
这种载体可以包括调控元件，例如启动子、增强子、终止子等，以在施用给受试者时引发或指导所述多肽的表达。在用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的例子包括SV40早期启动子和增强子(MizukamiT.等人1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR启动子和增强子(KuwanaY等人1987)、免疫球蛋白H链的启动子(MasonJO等人1985)和增强子(GilliesSD等人1983)等。
可以使用任何用于动物细胞的表达载体。合适的载体的例子包括pAGE107(MiyajiH等人1990)、pAGE103(MizukamiT等人1987)、pHSG274(BradyG等人1984)、pKCR(O'HareK等人1981)、pSG1betad2-4-(MiyajiH等人1990)等。质粒的其他代表性例子包括包含复制起点的复制型质粒，或者整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的代表性例子包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这种重组病毒可以通过本领域已知的技术(例如通过转染包装细胞或者通过用辅助质粒或病毒进行瞬时转染)而产生。病毒包装细胞的典型例子包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv阳性细胞、293细胞等。用于生产这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可在，例如，WO95/14785、WO96/22378、美国专利号5,882,877、美国专利号6,013,516、美国专利号4,861,719、美国专利号5,278,056和WO94/19478中找到。
根据本发明，本发明的另一目的涉及已被根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或者转化的细胞。术语“转化”是指向宿主细胞引入“外来的”(即外源性的或者细胞外的)基因、DNA或者RNA序列，使得宿主细胞表达所引入的基因或序列以产生所需物质(通常为由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶)。接收并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞是已经“被转化了的”。
本发明的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的重组多肽。术语“表达系统”是指在合适的条件下的宿主细胞和相容性载体，例如用于表达由载体携带并被引入宿主细胞的外源DNA所编码的蛋白质。
常用的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体，昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他例子包括，但不限于，原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体的例子包括大肠杆菌、克鲁维酵母或者酿酒酵母、哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代的或者建立的哺乳动物细胞培养物(例如，从淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生的细胞培养物)。例子还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCCCRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCCCRL1580)、CHO细胞(其中二氢叶酸还原酶基因(下文中称为“DHFR基因”)是有缺陷的)(UrlaubG等人；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCCCRL1662，下文中称为“YB2/0细胞”)等。优选YB2/0细胞，这是因为当在该细胞中表达时，嵌合的或者人源化的抗体的ADCC活性被增强。
根据本发明，本发明还涉及产生表达本发明的抗体或者多肽的重组宿主细胞，所述方法包括以下步骤(i)在体外或离体条件下将上述重组的核酸或载体引入感受态宿主细胞，(ii)在体外或离体条件下培养获得的重组宿主细胞，以及(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体或者多肽的细胞。这种重组宿主细胞可用于生产本发明的抗体和多肽。细胞培养物包括宿主细胞，培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适的培养基是本领域公知的。可以从细胞和含有目的多肽的培养基的混合物中分泌并分离目的多肽或其片段。或者，可以将多肽或其片段保留成胞质的形式，并且收获、裂解细胞，并分离蛋白或蛋白复合物。可以使用本领域已知的用于纯化蛋白的技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤法、电泳以及免疫亲和纯化法(其使用特异性针对目的多肽或其片段的特定表位的抗体)，从细胞培养基、宿主细胞或者上述两者中分离目的多肽或其片段。在其他实施方案中，根据本领域已知的标准方法，异源的标签可用于纯化目的(例如，表位标签和FC融合标签)。
另一方面，本发明提供了分离的核酸，其在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交。因此，本实施方案的多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包括这种多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于鉴定、分离或者扩增储存库中部分的或者全长的克隆。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的基因组或cDNA序列，或者与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补。优选地，cDNA文库包含至少80％的全长序列，优选至少85％或者90％的全长序列，并且更优选至少95％的全长序列。可以将所述cDNA文库标准化以提升对稀有序列的代表性(representation)。低等或中等严格的杂交条件通常，但不仅仅，用于相对于互补序列具有降低的序列同一性的序列。中等和高等严格的条件可以任选地用于具有更高同一性的序列。低等严格的条件允许具有约70％序列同一性的序列进行选择性杂交，并且可以用来鉴定直向同源序列或者共生同源序列。任选地，本发明的多核苷酸会编码由本文所述多核苷酸编码的抗体的至少一部分。本发明的多核苷酸包括这样的核酸序列：其可被用来与编码本发明的抗体的多核苷酸选择性杂交。参见，例如，Ausubel，见上文；Colligan，见上文，每个的全部内容通过引用并入本文。
IV.生产多肽和抗体的方法
可以通过单独地或者组合地使用任何本领域已知的或者本文描述的技术，例如，但不限于，任何化学技术、生物技术、遗传或酶技术，来生产本发明的多肽和抗体及其片段、免疫球蛋白和多肽。
例如，可以将宿主细胞培养成表达目的多肽或抗体。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适的培养基是本领域公知的。目的多肽或其片段可以从细胞和含有多肽的培养基的混合物中分泌并分离。或者，可以将目的多肽或其片段保留成胞质的形式，并且收获、裂解细胞，并分离蛋白或蛋白复合物。可以使用本领域已知的用于纯化蛋白的技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤法、电泳以及免疫亲和纯化法(其使用特异性针对目的多肽或其片段的特定表位的抗体)，从细胞培养基、宿主细胞或者两者中分离目的多肽或其片段。在其他实施方案中，根据本领域已知的标准方法，异源的标签可用于纯化目的(例如，表位标签和FC融合标签)。
因此，可用编码目的多肽的全部或选定部分的核苷酸序列，通过微生物或真核细胞过程产生重组形式的蛋白质。标准程序是将序列连接至多核苷酸构建体(例如表达载体)中，并且转化或转染至真核的(酵母、禽类、昆虫或者哺乳动物)或者原核的(细菌细胞)宿主中。可以采用类似的步骤，或其改进形式，通过根据本发明的微生物方法或者组织培养技术来制备重组的目的多肽或其片段。
在另一变化中，可以使用体外翻译系统来实现蛋白质的生产。体外翻译系统通常是这样的翻译系统：其是至少含有将RNA分子翻译成蛋白质所需的最少的要素的无细胞提取物。体外翻译系统通常至少包括核糖体、tRNA、起始甲硫氨酰-tRNAMet、参与翻译的蛋白质或复合物(例如，eIF2、eIF3)、包括帽结合蛋白(CBP)和真核起始因子4F(eIF4F)的帽结合(CB)复合物。多种体外翻译系统是本领域公知的，并且包括市售的试剂盒。体外翻译系统的例子包括真核裂解物，例如兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物、人细胞裂解物、昆虫细胞裂解物和小麦胚芽提取物。裂解物可以购自例如PromegaCorp.,Madison,Wis.；Stratagene,LaJolla,Calif.；Amersham,ArlingtonHeights,Ill.；和GIBCO/BRL,GrandIsland,N.Y.的生产商。体外翻译系统通常包括大分子，例如酶，翻译、起始和延伸因子，化学试剂和核糖体。此外，可以使用体外转录系统。这种系统通常至少包括RNA聚合酶全酶，核糖核苷酸和任何必要的转录起始、延伸和终止因子。体外转录和翻译可以结合在一锅反应中，以从一个或多个分离的DNA生成蛋白质。
在某些实施方案中，目的多肽或其片段可以在无细胞系统中通过核糖体化学合成，或者在细胞内通过核糖体合成。可以使用各种本领域认可的方法进行化学合成，包括逐步固相合成法、通过构象辅助的肽片段再连接半合成、克隆的或者合成的肽区段的酶促连接法、以及化学连接法。天然化学连接采用两个未受保护的肽区段的化学选择性反应来产生瞬态的硫酯连接中间体。所述瞬态的硫酯连接中间体随后自发地发生重排，以提供在连接位点具有天然肽键的全长连接产物。全长连接产物在化学上等同于由无细胞合成产生的蛋白质。全长连接产物可以是重折叠的和/或氧化的(如果允许)，以形成天然的含有二硫键的蛋白质分子。(参见例如，美国专利号6,184,344和6,174,530；以及T.W.Muir等人,Curr.Opin.Biotech.(1993):vol.4,第420页；M.Miller,等人,Science(1989):vol.246,第1149页；A.Wlodawer,等人,Science(1989):vol.245,第616页；L.H.Huang,等人,Biochemistry(1991):vol.30,第7402页；M.Sclmolzer,等人,Int.J.Pept.Prot.Res.(1992):vol.40,第180-193页；K.Rajarathnam,等人,Science(1994):vol.264,第90页；R.E.Offord,“ChemicalApproachestoProteinEngineering”,inProteinDesignandtheDevelopmentofNewtherapeuticsandVaccines,J.B.Hook,G.Poste,Eds.,(PlenumPress,NewYork,1990)第253-282页；C.J.A.Wallace,等人,J.Biol.Chem.(1992):vol.267,第3852页；L.Abrahmsen,等人,Biochemistry(1991):vol.30,第4151页；T.K.Chang,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91:12544-12548；M.Schnlzer,等人,Science(1992):vol.,3256,p221；和K.Akaji,等人,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)(1985)33:184)。
特别地，本发明还涉及一种生产本发明的抗体或多肽的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：(i)在适于允许所述抗体或多肽的表达的条件下培养根据本发明的经转化的宿主细胞；和(ii)回收表达的抗体或多肽。
通过常规的免疫球蛋白纯化流程如，例如，蛋白A-琼脂糖凝胶法、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析、亲和层析、硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、羟基磷灰石层析法和凝集素层析法，从培养基适当地分离本发明的抗体和其他多肽。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。参见，例如，Colligan,CurrentProtocolsinImmunology,或者CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),例如，第1、4、6、8、9、10章，每个的全部内容通过引用并入本文。
可通过以下方式产生本发明的嵌合抗体(例如，鼠-人嵌合体)：如先前所述获得编码VL和VH结构域的核酸序列，通过将其插入用于动物细胞(所述动物细胞具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因)的表达载体来构建人嵌合抗体表达载体，以及通过将表达载体引入动物细胞来表达编码序列。人嵌合抗体的CH结构域可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，例如IgG类或其子类，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。类似地，人嵌合抗体的CL可以是属于Ig的任何区域，例如κ类或者λ类。可以使用标准重组DNA技术制备的包括人和非人部分的嵌合的和人源化的单克隆抗体在本发明范围之内。这种嵌合的和人源化的单克隆抗体可以例如使用以下文献中描述的方法通过本领域已知的重组DNA技术产生：Robinson等人的国际专利公开PCT/US86/02269；Akira等人的欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.的欧洲专利申请171,496；Morrison等人的欧洲专利申请173,494；Neuberger等人的PCT申请WO86/01533；Cabilly等人的美国专利号4,816,567；Cabilly等人的欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science240:1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.84:214-218；Nishimura等人(1987)CancerRes.47:999-1005；Wood等人(1985)Nature314:446-449；Shaw等人(1988)J.Natl.CancerInst.80:1553-1559)；Morrison,S.L.(1985)Science229:1202-1207；Oi等人(1986)Biotechniques4:214；Winter美国专利5,225,539；Jones等人(1986)Nature321:552-525；Verhoeyan等人(1988)Science239:1534；和Beidler等人(1988)J.Immunol.141:4053-4060。
此外，可以根据标准方法(例如在美国专利5,565,332中公开的那些)制备人源化抗体。在另一实施方案中，可以使用本领域已知的技术(例如，如美国专利5,565,332、5,871,907或者5,733,743中所述)通过在以下两种载体之间进行重组而产生抗体链或者特异性结合对成员：一种载体包括核酸分子，所述核酸分子编码特异性结合对成员的多肽链与可复制通用显示包(replicablegenericdisplaypackage)的组分的融合体，另一种载体含有编码单个结合对成员的第二多肽链的核酸分子。可通过以下方式产生本发明的人源化抗体：如先前所述获得编码CDR结构域的核酸序列，通过将其插入用于动物细胞的表达载体而构建人源化抗体表达载体(所述动物细胞具有编码以下的基因：(i)等同于人抗体重链恒定区的重链恒定区和(ii)等同于人抗体轻链恒定区的轻链恒定区)，以及通过将表达载体引入动物细胞来表达基因。人源化抗体表达载体可以是其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于分开的载体上的类型，或者是其中两个基因都存在于同一载体上的类型(串联型)。
在常规的重组DNA和基因转染技术基础上生产人源化抗体的方法是本领域公知的(参见，例如，RiechmannL.等人1988；NeubergerMS.等人1985)。可以使用本领域已知的各种技术将抗体人源化，所述技术包括，例如，CDR-移植技术(EP239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)、饰面技术或者表面置换技术(veneeringorresurfacing)(EP592,106；EP519,596；PadlanEA(1991)；StudnickaGM等人(1994)；RoguskaMA.等人(1994))和链替换技术(美国专利号5,565,332)。用于制备这种抗体的一般重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP125023和国际专利申请WO96/02576)。
类似地，可以根据标准工序制备本文所述双特异性或多特异性抗体。例如，三源杂交瘤和杂交杂交瘤(hybridhybridomas)是能够分泌双特异性或多特异性抗体的细胞系的两个例子。美国专利4,474,893中公开了由杂交杂交瘤或三源杂交瘤产生的双特异性和多特异性抗体的例子。此类抗体还可以通过化学手段(Staerz等人(1985)Nature314:628，和Perez等人(1985)Nature316:354)和杂交瘤技术(StaerzandBevan(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:1453，和StaerzandBevan(1986)Immunol.Today7:241)构建。或者，还可以通过以下方式生成这种抗体：通过融合杂交瘤或者其他制备不同抗体的细胞来制备异源杂交瘤，随后鉴定生产和共组装所需抗体的克隆。其也可以通过完整免疫球蛋白链或其部分(例如Fab和Fv序列)的化学或基因偶联而生成。抗体组分可以结合本发明的一种或多种生物标志物的多肽或其片段，包括本文所述的一种或多种免疫抑制性生物标志物。
此外，用于生产抗体片段的方法是公知的。例如，可以通过用蛋白酶，木瓜蛋白酶(papaine)处理与人GAL1特异性反应的抗体来获得本发明的Fab片段。此外，可以通过以下方式生产Fab：将编码抗体Fab的DNA插入用于原核表达系统或者用于真核表达系统的载体，并且将所述载体引入原核生物或者真核生物(视情况而定)以表达Fab。
类似地，可以通过用蛋白酶，胃蛋白酶处理与GAL1特异性反应的抗体来获得本发明的F(ab')2片段。此外，可以通过经由硫醚键或二硫键结合下文所述的Fab'来生产F(ab')2片段。
可以通过用还原剂二硫苏糖醇处理与hGAL1特异性反应的F(ab')2来获得本发明的Fab'片段。此外，可以通过以下方式生产Fab'片段：将编码抗体的Fab'片段的DNA插入用于原核生物的表达载体，或者用于真核生物的表达载体，并且将所述载体引入原核生物或者真核生物(视情况而定)以执行其表达。
此外，可以通过以下方式生产本发明的scFv：如前所述获得编码VH和VL结构域的cDNA，构建编码scFv的DNA，将DNA插入用于原核生物的表达载体，或者用于真核生物的表达载体，然后将所述表达载体引入原核生物或者真核生物(视情况而定)以表达scFv。可以使用被称为CDR移植的公知技术来产生人源化的scFv片段，所述技术涉及从供体的scFv片段选择互补决定区(CDR)，并将所述互补决定区移植到已知三维结构的人scFv片段框架上(参见，例如，WO98/45322；WO87/02671；美国专利号5,859,205；美国专利号5,585,089；美国专利号4,816,567；EP0173494)。
V.对多肽和抗体的修饰
预期对本文所述多肽和抗体进行氨基酸序列修饰。例如，可能需要提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。已知的是，当简单地通过仅将来源于非人动物的抗体的VH和VL中的CDR移植至人抗体的VH和VL的FR中来生成人源化抗体时，抗原的结合活性相较于来源于非人动物的原始抗体是降低的。认为非人抗体的VH和VL的数个氨基酸残基(所述氨基酸残基不仅在CDR中，还在FR中)直接或间接地与抗原结合活性相关。因此，用来源于人抗体VH和VL的FR的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基会降低结合活性，并且可以通过用来源于非人动物的原始抗体的氨基酸残基取代氨基酸来进行校正。
可以对本发明的多肽或抗体的结构以及编码其的DNA序列进行修饰和改变，并且仍然获得编码具有所需特性的抗体和多肽的功能分子。例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可以被其他氨基酸取代而无活性的明显损失。由于蛋白质的相互作用能力和性质定义蛋白质的生物功能活性，可以在蛋白质序列，并且毫无疑问在其DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，并同时仍然获得具有类似性质的蛋白质。因此可以预期的是，可以在本发明的抗体序列，或者对应的编码所述多肽的DNA序列中进行各种改变，而无其生物学活性的明显损失。
在一个实施方案中，可以通过基于遗传密码的保守性来改变DNA序列中的密码子以编码保守取代，从而实现氨基酸的变化。具体地，如由遗传密码(如下所示)所定义的，在特定蛋白质的氨基酸序列和能编码所述蛋白质的核苷酸序列之间存在已知的和明确的对应关系。同样地，如遗传密码所定义的，在特定核酸的核苷酸序列和由该核酸编码的氨基酸序列之间存在已知的和明确的对应关系。
遗传密码
遗传密码的重要的和公知的特征是其冗余性，由此，对于大多数用于制造蛋白质的氨基酸而言，可能会采用超过一个编码性核苷酸三联体(示于上文中)。因此，多种不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。由于这样的核苷酸序列导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体翻译一些序列比翻译其他序列更有效)，因此其被认为是功能等价的。此外，偶尔地，嘌呤或嘧啶的甲基化变体可存在于给定的核苷酸序列中。这种甲基化不影响三核苷酸密码子和对应的氨基酸之间的编码关系。
鉴于前述内容，通过使用遗传密码将DNA或RNA翻译成氨基酸序列，可以使用用编码本发明的融合蛋白或多肽(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列来得到融合蛋白或多肽的氨基酸序列。同样地，对于融合蛋白或多肽的氨基酸序列，可以从遗传密码(由于其冗余性，对于任意给定的氨基酸序列，其会产生多个核酸序列)推导出能够编码融合蛋白或多肽的对应的核苷酸序列。因此，应当考虑到本文对编码融合蛋白或多肽的核苷酸序列的描述和/或公开也包括对由核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，应当考虑到本文对融合蛋白或多肽的氨基酸序列的描述和/或公开也包括对能够编码氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或公开。
在改变多肽的氨基序列的过程中，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域通常了解氨基酸亲水指数在赋予蛋白质交互生物学功能中的重要性。普遍认为，氨基酸的相对亲水特性对所得蛋白质的二级结构有贡献，这反过来限定了蛋白质与其他分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，每个氨基酸均被分配了亲水指数，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天门冬氨酸(<RTI3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域已知某些氨基酸可以被其他具有相似亲水指数或评分的氨基酸取代，并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物学功能等同的蛋白质。
如上概述，因此氨基酸的取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。已经多方面考虑了上述特性的示例性取代是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明的多肽或抗体的另一类型的氨基酸修饰可用于改变抗体的原始糖基化模式来，例如，增加稳定性。“改变”是指删除存在于抗体中的一个或多个糖部分，和/或添加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的。“N-连接”是指糖部分附着在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是用于将糖部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在产生了潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列使得其含有上述三肽序列(针对N-连接的糖基化位点)中的一种或多种，从而便利地实现将糖基化位点添加至抗体。另一类型的共价修饰涉及将糖苷化学或酶促偶联至抗体。这些步骤的优点在于其不需要在具有用于糖基化N-或者O-连接的糖基化能力的宿主细胞中生产抗体。取决于所使用的偶联模式，可以将糖附着至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基基团，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基基团，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基，或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。例如，这样的方法描述于WO87/05330中。
类似地，可以以化学或酶促的方式实现对存在于抗体上的任何糖部分的去除。化学去糖基化需要将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或者等同的化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺)以外的大部分或全部的糖的裂解，并同时留下完整的抗体。化学去糖基化由SojahrH.等人(1987)和Edge,AS.等人(1981)描述。如Thotakura,NR.等人(1987)所述，可以通过使用多种内切和外切糖苷酶实现抗体上的糖部分的酶促裂解。
其他的修饰可以涉及免疫缀合物的形成。例如，在一类共价修饰中，抗体或蛋白以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或者4,179,337中所述的方式与多种非蛋白质聚合物中的一种(例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)共价连接。
本发明的抗体或其他蛋白质与异源试剂的缀合可以通过使用多种双官能蛋白质偶联剂来实现，所述偶联剂包括但不限于，N-琥珀酰亚胺(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二甲基己二亚酰胺HCL)，活性酯(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)，醛类(例如戊二醛)，双叠氮化合物(例如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(例如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(例如甲苯2,6二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，碳标记的甲基二亚乙基三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于缀合放射性核苷酸与抗体的示例性螯合剂(WO94/11026)。
另一方面，本发明的特征是与治疗性部分(例如细胞毒素、药物和/或放射性同位素)缀合的抗-Gal1抗体。当与细胞毒素缀合时，这些抗体缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性剂包括任何对细胞有害(例如，杀死细胞)的试剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、以及嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括，但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、塞替派瘤可宁、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(旧称道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(旧称放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。本发明的抗体可以与放射性同位素(例如，放射性碘)缀合，以产生用于治疗相关病症(例如癌症)的细胞毒性放射性药物。
可以将缀合的抗-Gal1抗体作为治疗方案的一部分治疗性地用于组织。在一些实施方案中，检测是有用的，并且可以通过将抗体与可检测物质偶联(即，物理连接)来促进检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、或者乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或者藻红蛋白(PE)；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或者3H。本文关于抗体使用的术语“标记的”旨在包括通过偶联(即，物理连接)可检测物质(例如放射性试剂或者荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)或者藻红蛋白(PE)或者靛青(Cy5)))与抗体来直接标记抗体，以及通过与可检测物质的反应性来间接标记抗体。
本发明的抗体缀合物可用于修饰给定的生物反应。治疗性部分并不被理解为限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或者多肽。这种蛋白质可以包括，例如，酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、或者白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或者干扰素-γ；或者，生物反应调节物，如，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或者其他细胞因子或生长因子。
用于缀合这种治疗性部分与抗体的技术是公知的，参见，例如，Arnon等人,“MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy”,inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(eds.),pp.24356(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“AntibodiesForDrugDelivery”,inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等人(eds.),pp.62353(MarcelDekker,Inc.1987)；Thorpe,“AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview”,inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(eds.),pp.475506(1985)；“Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy”,inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(eds.),pp.30316(AcademicPress1985)，和Thorpe等人,“ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates”,Immunol.Rev.,62:11958(1982)。
在一些实施方案中，可以使用“可裂解接头”进行缀合，所述可裂解接头促进细胞中细胞毒性剂或者生长抑制剂的释放。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或者含二硫键的接头(参见例如美国专利号5,208,020)。或者，通过重组技术或者肽合成，可以制备包括抗体和细胞毒性剂或者生长抑制剂的融合蛋白。DNA的长度可以包括编码缀合物的两个部分的各自区域，所述两个部分彼此毗邻或者由编码接头肽的区域分开，所述的编码接头肽的区域不破坏缀合物的所需特性。
VI.本发明的用途和方法
本文所述的抗-Gal1中和性表位剂(例如，核酸、多肽、载体、宿主细胞等)可用来设计抗-Gal1中和剂。特别地，本文描述了可用于设计抗-Gal1治疗剂的信息，包括，例如，用于本发明的多肽的蛋白质结构域、结构信息等。
a.筛选测定法
在某些示例性实施方案中，提供了用于鉴定调节物的筛选测定法，所述调节物即对Gal1活性具有抑制效应的候选或测试化合物或试剂(例如，抗体、肽、环肽、肽模拟物、小分子、有机小分子、或其他药物)。
如本文所述，使用本领域技术人员已知的技术和方法来鉴定和开发这种调节物。本发明的调节物可用于抑制Gal1活性和/或预防或治疗Gal1介导的病症。许多用于鉴定这种调节物的方法是本领域已知的。例如，在一种这样的方法中，使Gal1核酸或多肽接触测试剂，并且在存在测试化合物的情况下确定Gal1介导的多糖结合活性，其中和在不存在该化合物的情况下(或者在存在对照化合物的情况下)的活性相比，在存在该化合物的情况下的活性的降低表明测试剂调节(例如，抑制或者中和)Gal1的活性。
可以，例如，由细菌、酵母或者其他生物体(例如天然产物)产生、化学地产生(例如小分子，包括肽模拟物)，或者重组地产生待测试充当Gal1活性的调节剂(例如，抑制剂或者中和剂)的能力的试剂。用于上述方法的化合物可以选自由以下组成的化合物的组：脂质、糖类、多肽、肽模拟物、肽核酸(PNA)、小分子、天然产物、适体和多核苷酸。在某些实施方案中，所述化合物是多核苷酸。
多种测定形式可足够满足需要，并且根据本公开，本领域普通技术人员基于本文的教导仍然可以理解本文中未明确描述的测定形式。测定形式可以以许多不同的形式产生，并且包括基于无细胞系统的测定法(例如纯化的蛋白质或细胞裂解物)，以及利用完整细胞的基于细胞的测定法。也可以使用简单的结合测定法来检测例如通过抑制Gal1-多糖复合物的形成或者抑制相互作用来调节Gal1活性的试剂。可用于鉴定Gal1活性的抑制剂的测定法的另一例子是竞争性测定法，其在用于竞争性抑制测定法的适当的条件下，将一个或多个Gal1多肽与潜在的调节剂(如，例如，多肽、核酸、天然底物或配体、抗体、或者底物或配体的模拟物)组合。测定法可以采用使用各种技术的动力学或热力学方法，所述技术包括，但不限于，微量热技术、圆二色性、毛细管区带电泳、核磁共振光谱法、荧光光谱法、及其组合。
可以通过多种方法检测Gal1和底物(例如乳糖胺(lactoasamine)序列(Galβ1,4GlcNAc或者N-多糖和/或O-多糖上的聚LacNAc残基，例如复合的N-多糖或者核心2O-多糖))之间的相互作用。可以使用，例如，可检测标记的蛋白质(例如放射性标记的多肽、荧光标记的多肽、或者酶促标记的多肽)，或者结合伙伴，通过免疫测定法或者通过色谱检测来定量对复合物形成的调节。
在某些实施方案中，可能需要固定测试试剂以促进对所需反应物或产物的分离，以及适应测定法的自动化。例如，可以将本发明的多肽结合至运载体分子或者固定在物体上。在一个实施方案中，所述物体选自下组：细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠、凝胶、板、阵列和毛细管。可以在适于容纳反应物的任何容器中完成测定。例子包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供添加了允许蛋白与基质结合的结构域的融合蛋白。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶/多肽(GST/多肽)融合蛋白吸附在谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(SigmaChemical,St.Louis,Mo.)上或者吸附在谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后将所述谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠或谷胱甘肽衍生的微量滴定板与结合伙伴(例如35S标记的结合伙伴)和测试化合物组合，并且在有利于复合物形成的条件下(例如在盐和pH的生理性条件下，但是可以预期稍微更为严格的条件)培育该混合物。孵育后，洗涤珠以除去任何未结合的标记，并且固定基质，直接(将珠置于闪烁体中)测定放射性标记或者在随后解离复合物之后在上清液中测定放射性标记。或者，可以从基质解离复合物，通过SDS-PAGE分离，并且使用标准电泳技术(例如所附实施例中所述)从凝胶中定量存在于珠部分中的靶多肽水平。
也可获得其他用于在基质上固定蛋白质的技术以用于所述测定法。例如，可以利用生物素和链霉亲和素的缀合来固定蛋白质。例如，可以使用本领域公知的技术(例如，生物素化试剂盒，PierceChemicals,Rockford,Ill.)由生物素NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)制备生物素化的多肽分子，并将其固定在链霉亲和素包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。或者，可以将与本文所述多肽反应的抗-Gal1中和性抗体导入(derivatized)到板的孔中，并且通过抗体缀合将多肽截留在孔中。如上所述，在板的多肽递呈孔中孵育结合伙伴和测试化合物的制剂，并且可以定量被截留在孔中的复合物的量。除了上述用于GST-固定化的复合物的方法，用于检测这种复合物的示例性方法包括复合物的免疫检测(其使用与结合伙伴反应的抗体，或者与多肽反应并且与结合伙伴竞争的抗体)；以及酶联测定法(其依赖于检测与结合伙伴相关的酶活性(内在的或者外在的活性))。在后者实例中，所述酶可以与结合伙伴化学缀合，或者作为与结合伙伴的融合蛋白而提供。
在本测定法的某些体外实施方案中，参与蛋白质-蛋白质、蛋白质-底物、或者蛋白质-核酸相互作用的蛋白质或蛋白组包括至少半纯化的蛋白的重构蛋白质混合物。半纯化的是指重构混合物中使用的蛋白质已经在先前从其他细胞或病毒蛋白质中分离出来。例如，不同于细胞裂解物，参与蛋白质-底物、蛋白质-蛋白质或者核酸-蛋白质相互作用的蛋白质以相对于混合物中的所有其他蛋白质至少50％的纯度存在于混合物中，并且更优选以90-95％的纯度存在。在所述方法的某些实施方案中，通过混合高度纯化的蛋白得到重构蛋白质混合物，使得重构混合物基本上没有其他蛋白质(例如细胞或病毒来源的蛋白质)，所述其他蛋白质可能干扰或者以其他方式改变测量源于给定的蛋白质-底物、蛋白质-蛋白质相互作用，或者核酸-蛋白质相互作用的活性的能力。
在一个实施方案中，使用重构蛋白质混合物允许更仔细地调控蛋白质-底物、蛋白质-蛋白质、或者核酸-蛋白质相互作用的条件。此外，系统可以派生为有利于发现蛋白质-蛋白质相互作用的特定中间状态的调节物。例如，可以在存在和不存在候选试剂的情况下进行重构蛋白质测定，从而允许检测给定的蛋白质-底物、蛋白质-蛋白质、或者核酸-蛋白质的相互作用的调节物。
在进一步的实施方案中，通过利用细胞培养技术来支持所述测定法，可以在全细胞中产生表达中和性的Gal1表位的Gal1试剂。例如，可以在原核或真核细胞培养系统中形成该试剂。这允许环境更近似于调节物的治疗性用途所需要的环境，包括试剂进入或者接触细胞的能力。此外，所述测定法的某些体内实施方案适合于候选药物的高通量分析。
组分中的一些或全部可以来自外部来源。例如，可以通过重组技术(例如通过使用表达载体)，以及通过显微注射融合蛋白本身或者编码融合蛋白的mRNA，从而将融合蛋白引入细胞。此外，在所述测定法的全细胞实施方案中，报告基因构建体在表达时可以提供可选择的标志物。
可以使用任何本领域技术人员认为合适的方法测量报告基因的转录的量。例如，可以使用Northern印迹检测特异性mRNA的表达，或者可以通过特征性的染色、Western印迹或者固有活性来鉴定特定的蛋白质产物。在某些实施方案中，报告基因的产物可以通过与该产物的相关的固有活性来检测。例如，报告基因可以编码这样的基因产物：其通过酶活性而产生基于彩色、荧光或者发光的检测信号。
在测定化合物文库(例如，噬菌体展示库)和天然提取物的许多药物筛选方案中，需要高通量测定法以在给定的时间内将鉴定的化合物数量最大化。在无细胞系统(例如可以用纯化的或者半纯化的蛋白质或者用裂解物获得的无细胞系统)中进行本发明的测定法作为“初步”筛选(“primary”screens)通常是优选的，这是因为可产生所述测定法以允许快速开发并且允许对由测试化合物介导的分子靶点的变化的相对容易的检测。此外，在体外系统中通常可以忽略测试化合物的细胞毒性效应和/或生物利用度，相反，测定法主要集中在药物对分子靶点的效应上，所述效应可以呈现为对其他蛋白质的结合亲和力的变化或者分子靶点的酶特性的变化。
如上所述，可以使用本领域技术人员熟知的各种方法鉴定和/或测定Gal1的活性。例如，可以测定由Gal1对N-多糖分支的阻断或者阻止作用所造成的对Gal1-多糖相互作用的靶向破坏。这种测定法是本领域公知的(参见，例如，美国专利公开号2013/0011409和PCT专利公开号WO2011/060272)。
b.使用免疫原的方法
如上所述，本发明提供了可用作免疫原的组合物(例如，本文所述的多肽、核酸、载体、宿主细胞、免疫原性组合物等)。可以以本领域已知的多种途径中的任一种(例如，与诱导强劲的抗体应答兼容的途径)施用这种免疫原。可以通过注射、输注、气雾、口服、经皮、经粘膜、胸膜内、鞘内、或者其他合适的途径进行施用。优选地，通过静脉内、皮下、皮内、或者肌内途径、或其任意组合施用所述组合物。免疫方案可以包括至少一个初次免疫剂量，随后随时间施用一个或多个加强剂量。本发明的免疫原性多肽的免疫原有效量的示例性范围为约5到约500μg/kg体重。优选的范围是约10-100μg/kg。
在一个实施方案中，在一个、两个或三个时间点给予一个或多个单位剂量的免疫原。可以容易地使用常规实验来确定免疫加强的最佳数量和时间。示例性的“初次免疫-加强免疫”方案描述于美国专利号6,210,663和WO00/44410中。根据本发明的一种方法涉及通过施用初次免疫组合物来“初次免疫”哺乳动物受试者。本文使用的“初次免疫”是指任何这样的方法：用抗原进行的初次免疫允许在用相同抗原进行二次免疫时产生针对该抗原的免疫应答，其中二次免疫应答比在没有提供初次免疫时所达到的免疫应答更强劲。
优选地，在向哺乳动物受试者施用初次免疫组合物后的约2到27周时施用免疫加强组合物。使用有效量的免疫加强组合物完成对免疫加强组合物的施用，所述免疫加强组合物含有或者能够递送与通过初次免疫组合物施用的抗原相同的抗原。如一个实施方案所述，本文使用的术语“免疫加强组合物”包括这样的组合物：其含有与初次免疫组合物中相同的抗原或其前体，但是形式不同，其中免疫加强组合物在宿主中诱导免疫应答。在一个特定的实施方案中，免疫加强组合物包括重组的可溶性蛋白。
在一个实施方案中，免疫加强组合物是含有编码蛋白质抗原的DNA序列的可复制的或者复制缺陷的重组型病毒。免疫加强组合物的例子是含有编码抗原的DNA序列的细菌重组载体，所述DNA序列可操作地与引导抗原在哺乳动物组织中的表达的调节序列相关联。一个例子是重组型BCG载体。除此之外，其他例子包括基于沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌等的重组细菌载体。免疫加强组合物的另一个例子是编码抗原的裸DNA序列，其可操作地与引导抗原在哺乳动物组织中的表达的调节序列相关联，但是不包含额外的载体序列。这些疫苗可以进一步包含药学上合适的或者生理学上可接受的运载体。在进一步的实施方案中，免疫加强组合物可以包括负载即时蛋白的或者编码相同蛋白的核酸分子感染/转染的蛋白质或肽(完整的和变性的)、热灭活重组疫苗、灭活的全微生物、抗原递呈细胞等，前述所有都可以有或者没有佐剂、趋化因子和/或细胞因子。
抗原性免疫原的代表形式包括“裸”DNA质粒、“裸”RNA分子、被包装进复制型或者非复制型病毒载体中的DNA分子、被包装进复制型或者非复制型病毒载体中的RNA分子、被包装进细菌载体中的DNA分子、或者单独存在的或存在于病毒样颗粒中的蛋白质形式的抗原、或其组合。
在一个实施方案中，可以向受试者施用目的免疫原性剂。在一些实施方案中，可以构建和施用具有增强的生物学特性的融合蛋白。此外，可以根据本领域公知的药理学方法(例如，聚乙二醇化、糖基化、低聚化等)修饰多肽，以进一步增强所需的生物学活性，例如增加的免疫原性、生物利用度和/或减少的蛋白质水解降解。
在一个实施方案中，可以使用“病毒样颗粒”或者“VLP”，其在任何宿主中都是非感染性的颗粒，并且不包含活病毒颗粒的所有蛋白质成分。在一个实施方案中，VLP包含本文所述的多肽，并且形成膜包裹的(membrane-enveloped)病毒样颗粒。使用VLP的优势包括(1)它们的免疫刺激性的颗粒性和多价性，和(2)它们以接近天然的、膜相关的形式递呈经二硫键稳定的包裹糖蛋白的能力。VLP通过在同一细胞中共表达病毒蛋白(例如，本文所述的多肽)而产生。这可以通过本领域技术人员公知的几种异源基因表达方式中的任一种而实现，例如转染编码病毒蛋白的合适的表达载体，用一种或多种编码VLP蛋白的重组病毒(例如，牛痘)感染细胞，或者用逆转录病毒转导细胞。也可以使用这些方法的组合。可以在体外或者在体内产生VLP。可以通过本领域技术人员公知的方法(包括例如在蔗糖或其他分层物质上的离心法，以及通过色谱法)产生纯化形式的VLP。
对于使用即时核酸递送的实施方案，任何用于将多核苷酸引入受试者(例如人或非人哺乳动物)或其细胞的方法可适应本发明的实践以用于将本发明的各种构建体递送进预期的受体中。在本发明的一个实施方案中，通过转染将DNA构建体递送给细胞，即，通过递送“裸”DNA或者采用胶体分散系统在复合物中递送。胶体系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。本发明优选的胶体系统是脂质络合的或者脂质体配制的DNA。在前者方法中，在例如用脂质配制DNA之前，可以首先通过实验优化含有包括所需DNA构建体的转基因的质粒的表达(例如，在5'非翻译区中加入内含子以及消除不必要的序列(Felgner等人,AnnNYAcadSci126-139,1995)。然后可以使用已知的方法和材料获得DNA配方(例如具有各种脂质或脂质体材料)，并将其递送给哺乳动物受体。参见，例如，Canonico等人,AmJRespirCellMolBiol10:24-29,1994；Tsan等人,AmJPhysiol268；Alton等人,NatGenet.5:135-142,1993和Carson等的美国专利号5,679,647。
可以基于解剖学和机械学因素对脂质体的靶向进行分类。解剖学分类以选择性水平为基础，例如，器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。机械学靶向可以根据其是被动或者主动加以区分。被动靶向利用脂质体在器官中分布至含有正弦毛细管的网状内皮系统(RES)的细胞的自然倾向。另一方面，主动靶向涉及通过如下方式改变脂质体：通过将脂质体偶联到特定的配体(例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质)上，或者通过改变脂质体的组成或尺寸来实现对除天然存在的定位位点以外的器官和细胞类型的靶向。
可以以各种方式修饰靶向递送系统的表面。在脂质体靶向递送系统的情况中，可以将脂质基团掺入脂质体的脂质双层中，以保持靶向配体与脂质体双层的稳定关联。可使用各种连接基团将脂质链连接到靶向配体。可在受试者的几个位点处施用与递送媒介物(例如，脂质体)相关的裸DNA或者DNA(见下文)。
可以在任何所需的载体中递送核酸。这些包括病毒的或非病毒的载体，包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体。示例性病毒的类型包括HSV(单纯疱疹病毒)、AAV(腺相关病毒)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、BIV(牛免疫缺陷病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。可以以任何提供充分有效的递送水平的所需形式施用核酸，包括在病毒颗粒中、在脂质体中、在纳米颗粒中、以及与聚合物络合的形式。
编码蛋白质的核酸或者目的核酸可以在质粒或病毒载体、或者其他本领域已知的载体中。这样的载体是公知的，并且可以被选择用于特定的应用。在本发明的一个实施方案中，基因递送载体包括启动子和脱甲基酶编码序列。优选的启动子是组织特异性启动子和由细胞增殖激活的启动子，例如胸苷激酶启动子和胸苷酸合成酶启动子。其他优选的启动子包括通过病毒感染而激活的启动子(例如α和β干扰素启动子)，以及可由激素(例如雌激素)激活的启动子。其他可用的启动子包括莫洛尼病毒LTR、CMV启动子和小鼠白蛋白启动子。启动子可以是组成型的或者诱导型的。
在另一实施方案中，如WO90/11092和美国专利5,580,859中所述，裸多核苷酸分子被用作基因递送媒介物。这种基因递送媒介物可以是生长因子DNA或RNA，并且在某些实施方案中，与灭活的腺病毒相连。Curiel等人,Hum.Gene.Ther.3:147-154,1992。其他可以任选使用的媒介物包括DNA-配体(Wu等人,J.Biol.Chem.264:16985-16987,1989)、脂质-DNA组合物(Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:74137417,1989)、脂质体(Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.84:7851-7855,1987)和微弹(Williams等人,Proc.Natl.Acad.Sci.88:2726-2730,1991)。
基因递送媒介物可以任选地包括病毒序列，例如病毒复制起点或包装信号。这些病毒序列可以选自以下病毒：例如星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、逆转录病毒、披膜病毒和腺病毒。在优选的实施方案中，生长因子基因递送媒介物是重组型逆转录病毒载体。重组型逆转录病毒及其各种用途已经在许多文献中有所描述，包括，例如，Mann等人,Cell33:153,1983，CaneandMulligan,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA81:6349,1984，Miller等人,HumanGeneTherapy1:5-14,1990，美国专利号4,405,712,4,861,719和4,980,289，以及PCT申请号WO89/02,468、WO89/05,349和WO90/02,806。本发明可以利用许多逆转录病毒基因递送媒介物，包括例如以下描述的那些：EP0,415,731；WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；美国专利号5,219,740；WO9311230；WO9310218；VileandHart,CancerRes.53:3860-3864,1993；VileandHart,CancerRes.53:962-967,1993；Ram等人,CancerRes.53:83-88,1993；Takamiya等人,J.Neurosci.Res.33:493-503,1992；Baba等人,J.Neurosurg.79:729-735,1993(美国专利号4,777,127、GB2,200,651、EP0,345,242和WO91/02805)。
其他可用于递送本发明的多核苷酸的病毒载体系统来源于疱疹病毒，例如，单纯疱疹病毒(颁发于1997年Can20的Woo等的美国专利号5,631,236，和Neurovex的WO00/08191)、牛痘病毒(Ridgeway(1988)Ridgeway,“Mammalianexpressionvectors,”In:RodriguezRL,DenhardtDT,ed.Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses.Stoneham:Butterworth,；BaichwalandSugden(1986)“VectorsforgenetransferderivedfromanimalDNAviruses:Transientandstableexpressionoftransferredgenes,”In:KucherlapatiR,ed.Genetransfer.NewYork:PlenumPress；Coupar等人(1988)Gene,68:1-10)和一些RNA病毒。优选的病毒包括甲病毒、痘病毒、沙粒病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒等。他们针对各种哺乳动物细胞提供一些引人注目的特点(Friedmann(1989)Science,244:1275-1281；Ridgeway,1988,见上文；BaichwalandSugden,1986,见上文；Coupar等人,1988；Horwich等人(1990)J.Virol.,64:642-650)。
免疫原可以与佐剂或其他免疫刺激剂一起施用。因此，免疫原可以进一步包括优选添加到用于加强免疫应答的融合蛋白免疫原中的一种或多种佐剂或免疫刺激剂。佐剂是任何可被加入到免疫原或者加入到疫苗制剂中以增强免疫原部分的免疫刺激性质的物质，例如蛋白质或多肽。脂质体也被认为是佐剂。参见，例如，Gregoriades,G.等人,ImmunologicalAdjuvantsandVaccines,PlenumPress,NewYork,1989；Michalek,S.M.等人,LiposomesasOralAdjuvants,Curr.Top.Microbiol.Immunol.146:51-58(1989)。能增强免疫原的效力的佐剂或者试剂的例子包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、二氧化硅、高岭土、碳、油包水乳剂和水包油乳剂。其他佐剂是胞壁酰二肽(MDP)以及各种MDP衍生物和制剂，例如，N-乙酰基-D-葡萄糖胺基-(β,1-4)-N-乙酰胞壁-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(N-acetyl-D-glucosaminyl-(β,1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutami-ne)(GMDP)(Hornung,RL等人,TherImmunol19952:7-14)或者ISAF-1(5％角鲨烯，2.5％普朗尼克L121，含有0.4mg苏氨酰-胞壁酰二肽的0.2％吐温80的磷酸盐缓冲溶液；参见Kwak,LW等人,(1992)N.Engl.J.Med.,327:1209-1238)和溶解于0.02％三乙醇胺中的单磷酸脂质A佐剂。其他有用的佐剂是，或者基于，细菌内毒素、脂质X、细菌痤疮丙酸杆菌(Propionobacteriumacnes)或百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的整个生物体或者亚细胞级分、多核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂甙和皂苷衍生物(如QS21(White,A.C.等人(1991)Adv.Exp.Med.Biol.,303:207-210)，其现在用于临床(Helling,F等人(1995)CancerRes.,55:2783-2788；Davis,TA等人(1997)Blood,90:509A(摘要)))、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或者其他合成的佐剂。市售佐剂的例子包括(a)其是由溶于油的脱油卵磷脂制成的水包油佐剂(参见例如，美国专利号5,084,269和美国专利公开号20050058667A1)和(b)其是氢氧化铝凝胶。铝被批准用于人。佐剂可商购自各种来源，例如，MerckAdjuvant(MerckandCompany,Inc.,Rahway,N.J.)。免疫原性物质可以吸附或者缀合于珠(如胶乳珠或金珠、ISCOM等)。有证据表明，传统的制剂，例如弗氏佐剂(包括完全的和不完全的)和明矾凝胶至少部分地使抗原变性，导致构象表位的损坏或者不足(under-representation)。属于含单磷酰脂质A(MPL)佐剂的Ribi佐剂系统(RAS)可用于克服这个问题。几项研究的结果表明，用含MPL的佐剂配制的抗原诱导优先结合天然抗原而非变性抗原的抗体(Earl,P.L.,等人,J.Virol68:3015-3026(1994)；VanCottT.C.,等人,J.Virol71:4319-4330(1997))。
也可以用免疫刺激性细胞因子、淋巴因子或者趋化因子补充免疫原。示例性的细胞因子包括，但不限于，GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、白介素1、白介素2、白介素12、白介素18或者干扰素γ。
用于制备免疫原性药物组合物和疫苗的一般方法是本领域公知的(参见，例如，Remington'sPharmaceuticalScience；MackPublishingCompanyEaston,Pa.)。
一方面，本发明提供了免疫原，通过本领域普通技术人员已知的方法，可将所述免疫原用于生成抗-Gal1中和剂(例如，抗体和适体)。随后可以将生成的抗体施用给患有Gal1介导的病症的受试者或者用来预防Gal1介导的病症。在一个涉及杂交瘤生产的实施方案中，可以通过多种技术来筛选样本以表征与本文所述免疫原的结合。一种方法涉及与本发明的免疫原的ELISA结合。具有与一个或多个免疫原结合测试为阳性的血清样本的动物是用于MAb生产的候选者。对用于MAb生产的动物的选择标准是基于在动物的血清中存在中和性抗体，或者在不存在中和作用的情况下针对所需免疫原具有适当的结合模式。
可以对来源于MAb生产的杂交瘤上清液进行筛选以用于ELISA、裂解物和表面免疫沉淀测定法，以与所需免疫原结合。如上所述，可以筛选在任何结合测定法中显示为阳性的样本以确认这些样本中和Gal1活性的能力。对于本文所述的任何测定法，可以将来自测试试剂的结果与滴定或阳性对照(例如，已知的广谱中和性抗体)进行比较以用于标准化的目的。
c.治疗方法
一方面，本发明提供了一种预防受试者罹患Gal1介导的病症的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的本文所述的Gal1中和剂，从而预防受试者罹患Gal1介导的病症。
另一方面，本发明提供了一种降低受试者感染Gal1介导的病症的可能性的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的本文所述的Gal1中和剂，从而降低受试者罹患Gal1介导的病症的可能性。
在又一个方面，本发明提供了一种用于在受试者中预防或延迟Gal1介导的病症的发病，或者减缓其发展速度的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的Gal1中和剂，从而预防或延迟Gal1介导的病症在受试者中的发病，或者减缓其在受试者中的发展速度。
因此，在一些实施方案中，可用本文所述的免疫原来免疫受试者，使得Gal1的不良活性在受试者中降低。在其他实施方案中，可以使用本文所述的免疫原来免疫不患有Gal1介导的病症的受试者。
应该理解，个别剂量可以取决于在主治医生的判断下的受试者的要求、所治疗病况的严重程度和所采用的特定化合物而不同。在确定治疗有效量或剂量时，主治医生可以考虑许多附加的因素，包括，但不限于：特定试剂的药效学特性及其施用方式和途径；所需的治疗时期；哺乳动物的物种；其大小、年龄和一般健康状况；所涉及的具体的疾病；疾病的程度或者复杂情况或者严重程度；个体受试者的应答；施用的特定化合物；施用方式；所施用的制剂的生物利用度特性；所选择的剂量方案；并行治疗的种类；以及其他相关情况。
治疗剂量可以是至少约0.01μg/kg体重、至少约0.05μg/kg体重、至少约0.1μg/kg体重、至少约0.5μg/kg体重、至少约1μg/kg体重、至少约2.5μg/kg体重、至少约5μg/kg体重、且不高于约100μg/kg体重。本领域技术人员应当理解，这样的准则将针对活性剂的分子量例如在使用抗体片段的过程中，或者在使用抗体缀合物的过程中进行调整。对于局部施用(例如鼻内施用、吸入施用等)或者对于全身施用(例如i.m.、i.p.、i.v.等)，剂量也可能不同。可以以低于化合物的有效剂量的较小剂量开始治疗。此后，在一个实施方案中，应以较小的增量增加剂量直至在该情况下达到最佳效应。为方便起见，如果需要的话，可以在一天内拆分并且一份一份地施用总的日剂量。
抗病毒疗法治疗的时程和/或剂量可以根据特定的试剂或其组合而变化。本领域技术人员应当理解用于特定的抗病毒治疗剂的适当的治疗时间。本发明设想对每个抗病毒治疗剂持续评估最佳治疗方案，其中由本发明的方法确定的受试者的Gal1介导的病症的表型是确定最佳治疗剂量和方案的因素。
可以通过任何合适的方式，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内的方式，施用本文所述的组合物。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或者皮下施用。此外，组合物可以适当地通过脉冲输注来施用，特别是与渐降剂量的抗体一起施用时。
通常，优选在开始治疗前从受试者获得第一样本以及在治疗过程中获得一个或多个样本。在这样的用法中，确定了来自患有Gal1介导病症的受试者的细胞在治疗前的表达基线，并且随后在治疗期间监测来自患有Gal1介导病症的受试者的细胞表达基线状态的变化。或者，可以使用在治疗期间获得的两个或更多个连续样本而无需治疗前的基线样本。在这样的用法中，将从受试者获得的第一样本用作基线，以用于确定来自患有Gal1介导病症的受试者的细胞的表达是否增加或降低。
此外，可能有利的是，将本文公开的免疫原性组合物与其他试剂，例如蛋白质、肽、抗体和其他抗-Gal1剂一起施用。例如，据信当处理表达Gal1和另一免疫抑制分子(例如PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-1、CTLA-4、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-4、BTLA、SIRPalpha(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、A2aR、及其组合物)的细胞时，会表现出治疗协同性。在某些实施方案中，将免疫原性组合物依次与其他治疗剂一起施用，例如在其他试剂之前或者之后施用。本领域普通技术人员将知晓，依次施用可以指紧随其后或者在适当的时间段之后，例如数小时、数天、数周、数月、或者甚至数年以后。
在某些实施方案中，治疗是治疗哺乳动物，例如人。
另一方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包括治疗有效量的本文所述的组合物，所述组合物与一种或多种药学上可接受的运载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制，并且含有或者不含有额外的抗病毒剂和/或免疫原。如下面所详细描述的，可以专门配制本发明的药物组合物以用于固体或液体形式的施用，所述使用包括适于以下的那些：(1)口服给药，例如，灌服剂(水性或非水性的溶液或悬浮液)、片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液通过皮下、肌内或者静脉内注射；(3)局部施用，例如，作为乳膏、软膏或者喷雾剂施用到皮肤上；(4)阴道内或者直肠内施用，例如，作为阴道栓剂、乳剂或者泡沫；或者(5)气雾剂，例如，作为含有化合物的水性气雾剂、脂质体制剂或者固体颗粒。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人和动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其他问题或并发症的、与合理的利益/风险比相称的那些试剂、材料、组合物和/或剂型。
本文使用的短语“药学上可接受的运载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或者包封材料，其参与将对象化学物质从一个器官或者机体的一个部分运载或者运送到另一个器官或者机体的另一个部分。每个运载体必须在与制剂的其他成分可相容和对受试者没有损害性的意义上是“可接受的”。可用作药学上可接受的运载体的材料的一些例子包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；以及(21)其他在药物制剂中使用的非毒性相容物质。
术语“药学上可接受的盐”是指试剂的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐，其调节(例如，中和)Gal1的表达和/或活性，或者本发明所包含的复合物的表达和/或活性。这些盐可以在试剂的最后分离和纯化期间原位制得，或者通过使纯化的试剂以其游离碱形式与合适的有机或无机酸单独反应，并且分离由此形成的盐而制得。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂酰磺酸盐等(参见，例如，Berge等人(1977)“PharmaceuticalSalts”,J.Pharm.Sci.66:1-19)。
在其他情况下，可用于本发明的方法中的试剂可以含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指试剂的相对无毒的无机和有机碱加成盐，其调节(例如，中和)Gal1的表达和/或活性，或者复合物的表达和/或活性。同样地，这些盐可以在试剂的最后分离和纯化期间原位制得，或者通过使纯化的试剂以其游离酸的形式与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或者碳酸氢盐)、与氨、或者与药学上可接受的有机伯胺，仲胺或叔胺单独反应而制得。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见，例如，Berge等人，见上文)。
润湿剂、乳化剂和润滑剂(例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明的方法中的制剂包括适合于口服给药、经鼻施用、局部(包括口腔和舌下)施用、直肠施用、阴道施用、气雾和/或胃肠外施用的那些制剂。所述制剂可以方便地以单位剂量的形式存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。能够与运载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于正在接受治疗的宿主、施用的具体模式而变化。能够与运载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效应的化合物的量。通常，以100％计，所述量为约1％至约99％的活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
制备这些制剂或组合物的方法包括如下步骤：使调节(例如，中和)Gal1的表达和/或活性的试剂与运载体以及任选的一种或多种辅助成分形成关联。通常，通过以下方式制备制剂：使试剂与液体运载体或细分的固体运载体或上述两者均匀紧密地形成关联，然后，如果需要的话，使所述产物成形。
适于口服给药的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或者作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或者作为水包油或油包水液体乳剂，或者作为酏剂或糖浆，或者作为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口液等，每种都含有预定量的试剂作为活性成分。也可以将化合物作为丸剂、膏剂或者糊剂施用。
在用于口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的运载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下任意者混合：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、以及碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)湿润剂，如，例如，乙酰基醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂，例如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包括缓冲剂。还可以通过使用诸如乳糖或牛奶糖的这类赋形剂以及高分子量的聚乙二醇等，将相似类型的固体组合物用作软填充和硬填充的明胶胶囊中的填充剂。
可以通过压制或模制来制成片剂(任选地具有一种或多种辅助成分)。压制片剂可以通过使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或者分散剂来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制经惰性液体稀释剂润湿的粉状肽和拟肽的混合物来制备。
片剂和其他固体剂型(例如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可以任选地被刻痕或制备为具有包衣和壳(例如肠溶包衣和药物配制领域公知的其他包衣)。还可以将片剂和其他固体剂型配制为通过使用例如用以提供所需释放曲线的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球，从而提供其中的活性成分的缓释或控释。可以通过，例如，通过细菌截留滤器进行过滤，或者通过在使用前立即掺入可溶于无菌水的无菌固体组合物形式的灭菌剂或一些其他的无菌可注射介质，从而将片剂和其他固体剂型灭菌。这些组合物也可以任选地含有遮光剂，并且可以具有使得它们仅仅或者优先在胃肠道的某个部分任选地以延迟的方式释放活性成分的组成。可用的包埋组合物的例子包括聚合物物质和蜡。活性成分也可以是微囊剂形式，在适当情况下具有上述赋形剂中的一种或多种。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，如，例如，水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙基醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油(特别是棉籽油，花生油，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，及其混合物。
除了惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除了活性剂之外，悬浮液还可以包含悬浮剂，如，例如，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、金属铝氢氧化物、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶、及其混合物。
用于直肠或阴道施用的制剂可以呈现为栓剂，所述栓剂可以通过将一种或多种试剂和一种或多种合适的非刺激性赋形剂或运载体(包括例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或者水杨酸盐)混合而制成，并且所述栓剂在室温下是固体，但在体温下是液体，因此在直肠或阴道腔中将融化并释放活性剂。
适合于阴道施用的制剂还包括含有本领域已知合适的这些运载体的阴道栓剂、棉条、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或者喷雾制。
用于局部或经皮施用调节(例如，中和)Gal1的表达和/或活性的试剂的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、乳液、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。可在无菌条件下将活性成分与药学上可接受的运载体，并且与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂、或者推进剂混合。
除了试剂之外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌、或其混合物。
除了调节(例如，中和)Gal1的表达和/或活性的试剂之外，粉剂和喷雾剂可以含有赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或者这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常规的推进剂(例如氯氟代烃)和挥发性的未取代烃(例如丁烷和丙烷)。
或者，可以以气雾剂的形式施用调节(例如，中和)Gal1的表达和/或活性的试剂。这通过制备含有化合物的水气雾剂、脂质体制剂或者固体颗粒来完成。可以使用非水性的(例如氟碳推进剂)悬浮液。优选超声波雾化器，因为其使试剂暴露于导致化合物降解的剪切达到最小。
通常，通过将试剂的水溶液或悬浮液与常规的药学上可接受的运载体和稳定剂一起配制来制备水气雾剂。所述运载体和稳定剂依特定化合物的要求而变化，但通常包括非离子表面活性剂(吐温、普流罗尼类或者聚乙二醇)、无害的蛋白质(如血清白蛋白)、脱水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(例如甘氨酸)、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气雾剂通常由等渗溶液制备。
透皮贴剂具有将试剂受控地递送至机体的附加优点。这种剂型可以通过在合适的介质中溶解或者分散试剂而制成。也可以使用吸收增强剂来增加肽模拟物通过皮肤的通量。可以通过提供控制速率的膜或者在聚合物基质或凝胶中分散肽模拟物来控制这种通量的速率。
眼用制剂、眼膏、粉剂、溶液等也都被认为包含在本发明的范围之内。
适于肠胃外施用的本发明的药物组合物包括一种或多种试剂，所述试剂与一种或多种药学上可接受的无菌等渗的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液组合，或者与可在临使用前重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末组合，所述无菌粉末可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得所述制剂与预期受体的血液等渗的溶质或者悬浮剂或增稠剂。
可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性运载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。可以，例如，通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、通过维持所需的颗粒尺寸(在分散体情况下)，以及通过使用表面活性剂，从而保持适当的流动性。
这些组合物也可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)而确保对微生物作用的预防。将等渗剂(例如糖、氯化钠等)包括进组合物中也是可取的。此外，也可通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
在一些情况下，为了延长药物的效应，期望减慢对来自皮下或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的液体悬浮液来实现。对药物的吸收速率则取决于其溶解速率，所述溶解速率反过来可以取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，通过在油媒介物中溶解或悬浮药物来实现对胃肠外施用药物形式的延迟吸收。
可注射的储库形式(depotforms)通过在可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成调节(例如，中和)Gal1的表达和/或活性的试剂的微胶囊化矩阵基质而制成。取决于药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚原酸酯和聚酸酐。还通过将药物包埋在与机体组织可相容的脂质体或者微乳中来制备储库型可注射制剂。
可以通过本发明的方法确定本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得活性成分的量，对于特定的受试者、组合物和施用方式，所述活性成分的量能有效实现所期望的治疗应答而对受试者没有毒性。
本文所述的核酸分子可以插入到载体中并用作基因治疗载体。可以通过例如，静脉注射、局部施用(参见美国专利号5,328,470)或者通过立体定向注射(参见例如，Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:30543057)，将基因治疗载体递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括包埋有基因递送媒介物的缓释基质。或者，在完整基因递送载体(例如，逆转录病毒载体)可以从重组细胞完好无损地产生的情况下，药物制剂可以包括产生基因递送系统的一个或多个细胞。
VII.试剂盒
此外，本发明还包含包括本文所述的抗Gal1试剂的试剂盒。例如，所述试剂盒可在有或者没有额外的治疗剂(例如免疫检验点抑制剂)的情况下包括中和性的抗Gal1抗体。可以将所述试剂包装在合适的容器中。例如，本发明提供了包括至少一种免疫原性肽和/或一种本文所述的抗体的试剂盒。本发明的试剂盒可以含有免疫原性肽和/或与固体支持物(例如，组织培养板或者珠(例如，琼脂糖凝胶珠))偶联的抗体。
试剂盒可以包括额外的组件来促进试剂盒的设计所针对的特定应用。试剂盒可以包含的示例性试剂包括对照所需的试剂(例如，对照生物样本或者Gal1蛋白标准)。试剂盒还可以额外包括缓冲液和其他被认为能用于本发明所公开方法的试剂。非限制性例子包括用于减少非特异性结合的试剂，例如运载体蛋白或洗涤剂。本发明的试剂盒还可以包括说明材料，所述说明材料公开或描述试剂盒或者所公开本发明的抗体在如本文所提供的所公开本发明的方法中的使用。
通过以下实施例对本发明做进一步说明，所述实施例不应被解释成是限制性的。贯穿本申请而引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及图，通过引用并入本文。
实施例
实施例1：可用于治疗应用的中和性抗-Gal1单克隆抗体
生成了中和性抗-Gal1单克隆抗体，并且在生化分析以及在原发性肿瘤的免疫组化分析中使中和性抗-Gal1单克隆抗体与人重组的Gal1和内源性Gal1反应。此外，Gal1单克隆抗体中的数个也与来自食蟹猴和小鼠的内源性Gal1具有良好的交叉反应(图1)。表位定位表明，Gal1单克隆抗体8B5、8F4和8G3都识别位于前述糖类结合结构域的远端的结构域(图2和表1)。
随后对这些抗体(即，8B5、8F4和8G3)进行测序，并确定每个具有相同的序列，并且轻链是λ。简单地说，从每个杂交瘤中提取总RNA，并进行使用恒定区特异性的3'引物和简并信号序列特异性的5'引物池的RT-PCR。对扩增产物进行克隆和测序。对于重链，一共测序了36个克隆；对于轻链，一共测序了19个克隆。在所有三种抗体中，对于所有克隆的序列比对都产生了相同的重链和轻链序列。这些序列示于下面的表1中，对获自杂交瘤的序列分析总结于下面的表2中。另外，将杂交瘤细胞系8F4.F8.G7保藏在美国典型培养物保藏中心，并按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款以保藏号PTA-10535接收于2009年12月17日。美国专利公开2013/0011409和PCT专利公开WO2011/060272公开了8F4抗体，并且各自的全部内容通过本引用并入本文。
表1：抗-人Gal1单克隆抗体的表位定位和序列
8B5、8F4和8G3的重链可变区(vH)的DNA和氨基酸序列*
8B5、8F4和8G3(包括8F4F8G7)的轻链可变区(vL)的DNA和氨基酸序列*
8B5、8F4和8G3(包括8F4F8G7)的重链可变区(vH)的DNA序列*
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGTTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAAACACCTATATACACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAAGATTG ATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGTCCCGGAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCGGACACATCCTCCAACACAGTCTACCTGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATCTATTACTGTGTCGATGGTTACTACGGCTG GTATTTCGCTGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
8B5、8F4和8G3(包括8F4F8G7)的轻链可变区(vK)的DNA序列*
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGCAC TGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTG CTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGTCCTCACCATCACAGGGGCACAAACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGAAACCATTTTATTTTCGGCAGTGGAACCAAGGTCACTGTCCTC
8B5、8F4和8G3(包括8F4F8G7)的重链可变区(vH)的氨基酸序列*
EVQLQQSVAEFVRPGASVRLSCTASGFNIKNTYIHWVRQRPEQGLEWIGKIDPANGNTKYVPEFQGKATMTADTSSNTVYLHLSSLTSEDTAIYYCVDGYYGWYFAVWGTGTTVTVSS
8B5、8F4和8G3(包括8F4F8G7)的轻链可变区(vK)的氨基酸序列*
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGATNNRAPGVPARFSGSLIGDKAVLTITGAQTEDEAIYFCALWYRNHFIFGSGTKVTVL
*根据Kabat进行CDR的定义和蛋白质序列编号。以CDR1，CDR2和CDR3的顺序，分别以红色或下划线突出显示CDR核苷酸和蛋白质序列。
表2：抗-人Gal1单克隆抗体的序列总结
抗体序列分析 a
a根据Kabat进行CDR的定义和序列编号。
b种系ID指示后跟同源性百分比
实施例2：可用于治疗应用的中和性抗-Gal1单克隆抗体的精细表位定位
对在图1中确定与人Gal1和小鼠Gal1均具有良好交叉反应的，并且在表2中确定为识别Gal1的后CBD结构域的8F4mAb进一步进行了精细表位定位分析。除了在图2中示出的并且产生于大肠杆菌的七个GST-标记的人Gal1构建体外，还在大肠杆菌中产生了五个额外的6×HIS-标记的人Gal1构建体(其横跨人Gal1多肽的各个部分)用于表位定位分析(图2)。图2进一步显示了被每个GST-标记的和His-标记的构建体所包含的氨基酸如何相对于折叠的人Gal-1多肽的五链β片层(F1-F5)和六链β片层(S1-S6a/S6b)中的β链进行定位(图3)。通过Western印迹分析确定了Gal1中和性8F4mAb识别重组型HIS-F7、HIS-F5和HIS-F9，而抗-Gal1的非中和性8A12mAb经Western印迹分析确定识别重组型HIS-F7和HIS-F5(图3)。这些结果表明，8F4mAb在第102-115位氨基酸残基内与Gal1结合，而8A12mAb在第116-135位氨基酸残基内与Gal1结合(图5)。另外，由于人Gal1中和性8F4mAb识别β片层F5，从而在空间上干扰和阻碍人Gal1与多糖结合，因此这种精细的表位定位数据明确了对Gal1的中和作用的结构基础(图3)。相反，非中和性8A12mAb与在空间上远离糖结合结构域的β-片层S2/F1结合。
实施例3：可用于治疗应用的中和性抗-Gal1单克隆抗体的生物物理性质
还进行了表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance)(SPR)分析(也称为生物分子相互作用分析(BiomolecularInteractionAnalysis)，BIAcore)以进一步明确Gal1与8F4mAb的相互作用的生物物理性质(例如，kon、koff、koff/kon(KD)。在25℃下在标准BIAcore运行缓冲液HBS-EP中，于BIAcore3000仪器(来自BIACORE公司)上进行了SPR实验。简单地说，首先在CM-5传感器芯片(来自GEHealthcare公司)上捕获抗-小鼠抗体。随后，固定约250个响应单位(RU)的抗-Gal1mAb8F4(对于rmGal1测定法则例外地使用～350RU)，并随后对重组型半乳糖凝集素(人半乳糖凝集素-1、2、3、4、7、8、9或者鼠半乳糖凝集素-1(mGal1)，来自R&DSystems公司)进行各种稀释来评估半乳糖凝集素与8F4的结合。所有数据显示为减去仅载有缓冲液的通道的数据后的值。使用BIAevaluation3.1(来自BIAcore公司)通过将数据全局拟合至简单的1:1(Langmuir)结合模型而进行数据分析，以获得示出的结合曲线和平衡解离常数(KD)。8F4mAb对重组型hGal1和重组型mGal1均显示出了纳摩尔(nM)水平的亲和力，但是与rhGal1具有更高的亲和力(相较于对rmGal1的38.5nM，对rhGal1的KD为13nM)(图6)。另外，8F4mAb对更高浓度的其他重组型半乳糖凝集素(包括Gal2、Gal3、Gal4、Gal7、Gal8和Gal9)没有显示出结合或者显示出非特异性结合。
实施例4：可用于治疗应用的中和性抗-Gal1单克隆抗体的选择性
相较于结合rmGal1，8F4mAb对结合rhGal1的显著偏好为以下观察提供了另外的解释：在体内鼠肿瘤模型中，8F4mAb在阻断mGal1方面的效率相对较低。此外，mGal1和hGal1之间在邻近8F4mAb所结合的表位的CBD中的C61-F80区域的二十个氨基酸中，有六个(35％)是不同的。据信这些氨基酸差异改变了CBD的构象，并且限制了8F4介导的对mGal1的阻断效率。进一步认为以下事实使得这种效应变得复杂：在8F4mAb所结合的鼠和人表位内存在两个氨基酸差异。因此，将临床前鼠肿瘤模型用于评估8F4mAb用于人临床开发的适用性时应当同以下事实进行平衡：8F4mAb对hGal1的亲和力比其对mGal1的亲和力更高。
考虑了这种用途与额外的试剂(例如免疫检验点抑制剂的抑制剂)组合或者不组合的情况。例如，程序性细胞死亡配体1(PD-L1，也被称为B7-H1/CD274)是属于共刺激分子B7家族的细胞表面糖蛋白，所述家族主要由抗原呈递细胞表达，并且用于调节细胞免疫应答(Zou等人(2008)Nat.Rev.Immunol.8:467-477；Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.26:677-704)。PD-L1与其同源受体PD-1的结合抑制外周组织中活化的T细胞的增殖，从而导致“T细胞衰竭”，所述T细胞衰竭是可以由PD-1阻断而逆转的功能性表型(Barber等人(2006)Nature439:682-687；Freeman等人(2000)JExpMed.192:1027-1034；Dong等人(1999)Nat.Med.5:1365-1369)。根据免疫组织化学，许多人恶性肿瘤(包括肺癌、卵巢癌和结肠癌；黑色素瘤；间变性大细胞淋巴瘤；成人T细胞淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤)表达PD-L1，而除了单核细胞、巨噬细胞和胎盘合体滋养细胞之外的正常人体组织不表达可检测水平的PD-L1(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.26:677-704；Dong等人(2002)Nat.Med.8:793-800；Konishi等人(2004)Clin.CancerRes.10:5094-5100；Kozako等人(2009)Leukemia23:375-382；Andorsky等人(2011)Clin.CancerRes.17:4232-4244；Kantekure等人(2012)Am.J.Dermatopathol.34:126-128；Wilcox等人(2009)Blood114:2149-2158；Wilcox等人(2012)Eur.J.Haematol.88:465-475)。体外和临床前研究已经显示，对PD-1/PD-L1相互作用的破坏会加强免疫应答并促进抗肿瘤活性(Iwai等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99:12293-12297)。最近，使用人源化抗-PD-1和抗-PD-L1抗体进行的I期临床试验已经在一部分患有实体器官恶性肿瘤的患者中产生了持久的临床反应，其中黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌最为显著，这表明有前途的基于靶定PD-1/PD-L1轴的治疗线(Brahmer等人(2010)J.Clin.Oncol.28:3167-3175；Brahmer等人(2012)N.Engl.J.Med.366:2455-2465；Topalian等人(2012)N.Engl.J.Med.366:2443-2454)。
如本文所述，Gal1是另一种免疫调节分子。已经显示，Gal1由多种实体肿瘤和淋巴增殖性疾病表达，包括胃肠癌、甲状腺乳头状癌、喉鳞状细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、MLL重排的B-淋巴母细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤的斯腾伯格细胞(cHL)(Cedeno-Laurent等人(2012)Blood119:3534-3538；Juszczynski等人(2010)Clin.Cancer.Res.16:2122-2130；Saussez等人(2007)InternationalJournalofOncology.30:1109；Danguy等人(2002)Biochim.Biophys.Acta.1572:28528-28529；Yamamoto等人(2008)Blood111:3220-3224；Gandhi等人(2007)Blood110:1326-1329；Juszczynski等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.104:13134-13139；Green等人(2010)Blood116:3268-3277；Green等人(2012)Clin.CancerRes.18:1611-1618；Ouyang等人(2011)Blood117:4315-4322；Rodig等人(2008)Clin.CancerRes.14:3338-3344)。用功能拮抗性抗体下调或阻断Gal1在黑色素瘤和卡波西肉瘤(KS)的临床前模型中导致以T细胞依赖方式的肿瘤排斥(Rabinovich(2005)Br.J.Cancer.92:1188-1192；Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251；Croci等人(2012)J.Exp.Med.209:1985-2000)，并防止在PTLD模型中靶向EBV感染的人B细胞的CD8+T细胞的Gal1介导的凋亡(Ouyang等人(2011)Blood117:4315-4322)。
用于癌症治疗的多模型和组合的方法越来越针对肿瘤发病涉及的多种机制。免疫逃避是癌症的新兴标志，随着近期的一些进展其成为引人注目的靶点，包括使用针对免疫检查点分子(例如CTLA4和PD-1)的人源化抗体的临床试验(Hanahan等人(2011)Cell144:646-674和Pardoll(2012)Nat.Rev.Cancer12:252-264)。最近在实体肿瘤患者中使用抗-PD-1和抗-PD-L1抗体进行的I期临床试验表明需要鉴定表达高水平PD-L1的那些肿瘤的可靠方法来提高治疗功效(Brahmer等人(2010)J.Clin.Oncol.28:3167-3175；Brahmer等人(2012)N.Engl.J.Med.366:2455-2465；和Topalian等人(2012)N.Engl.J.Med.366:2443-2454)。在使用抗-PD-1进行的试验中，通过免疫组化，在25个表达任何可检测的肿瘤相关PD-L1的病例中有9个显示出持久的临床反应，而在缺乏可检测的PD-L1的那些肿瘤患者中没有观察到临床效应(Topalian等人(2012)N.Engl.J.Med.366:2443-2454)。本文描述的数据表明在大多数的老年人以及免疫力低下的EBV阳性的DLBCL、NPC和ENKTCL的病例中，存在强劲的膜质PD-L1的染色。少数EBV阴性的PTLD、EBV阴性的DLBCL、PBL和PEL病例为PD-L1阳性。
Gal1也是新兴的导致T细胞凋亡的免疫调节分子，并且在小鼠模型中Gal1基因表达的阻断促进肿瘤排斥(Liu等人(2005)Nat.Rev.Cancer5:29-41和Rubinstein等人(2004)CancerCell5:241-251)。已经确定在大多数EBV阳性的DLBCL、NKTCL和PBL，以及HHV8相关肿瘤KS和PEL中存在Gal1的染色。这些数据表明病毒驱动的恶性肿瘤类别会受益于针对PD-L1和Gal1的靶向治疗，并且提供了鉴定可能对这种治疗有特异性应答的那些病例的可靠方法。
与检查EBV阳性的PTLD和cHL中PD-L1和Gal1的AP-1和EBV依赖性表达的先前研究一致(Juszczynski等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.104:13134-13139,Green等人(2012)Clin.CancerRes.18:1611-1618,Ouyang等人(2011)Blood117:4315-4322,Rodig等人(2008)Clin.CancerRes.14:3338-3344)，在EBV阳性的DLBCL和ENKTCL中，Gal1和PD-L1的表达与p-cJun和JunB的表达相关。大部分EBV阴性的PTLD病例显示JunB和p-cJun的表达(尽管通过先前的EBER分析这些病例显示为EBV阴性)，并且这些病例中的一部分显示出膜质PD-L1染色。这些病例中的一些还显示出细胞质PD-L1染色，其意义尚不明确，因为有可能只有PD-L1的膜表达会有助于肿瘤免疫逃避。与EBV阳性的PTLD(Ouyang等人(2011)Blood117:4315-4322)相反，这些肿瘤对于Gal1也一致为阴性。类似地，大多数NPC病例具有激活的AP-1信号和强劲的PD-L1染色，但是对于Gal1为阴性。对于PBL和PEL，AP-1组分的表达与Gal1的表达具有较好的相关性，但数个病例对于PD-L1为阴性。总之，这些数据表明了PD-L1和Gal1的上调的替代机制，且AP-1的活化或者EBV-阳性不足以驱动Gal1的表达。
如对cHL所示(Green等人(2010)Blood116:3268-3277)，9p24位点的扩增可能是在过表达PD-L1但对EBV或者激活的AP-1组分呈阴性的肿瘤中的常见现象。相反地，查询拥有9p24扩增的肿瘤(例如灰色区淋巴瘤和乳腺癌((Eberle等人(2011)ModernPathology24:1586-1597andWu等人(2012)Oncogene31:333-341))的PD-L1表达将进一步鉴定用于抗-PD-L1免疫疗法的候选物。或者，在ALK阳性的T细胞淋巴瘤中首次证明的由NPM/ALK融合蛋白所导致的STAT3通路的异常信号(Marzec等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.105:20852-20857)可以提供PD-L1表达的另一种机制。
对于其他EBV阳性的恶性肿瘤，一个有趣的例外是在几乎所有EBV阳性的BL病例中都没有Gal1、PD-L1和JunB/cJun的染色。已知的是BL中的EBV潜伏程序不同于DLBCL(Vereide等人(2011)Blood117:1977-1985和Bornkamm(2009)Semin.CancerBiol.19:351-365)。具体地，更小组的病毒蛋白在BL中表达，而LMP1未被表达。在对Gal1和PD-L1在PTLD和cHL中的EBV依赖性表达的研究中，显示了Gal1和PD-L1的表达特异性地依赖于LMP1(Green等人(2012)Clin.CancerRes.18:1611-1618和Ouyang等人(2011)Blood117:4315-4322)。因此，BL肿瘤细胞中缺乏LMP1可能会导致不能够激活AP-1信号，并且因此导致没有可检测的Gal1和PD-L1的表达。此外，已经显示Myc蛋白抵消PD-L1的表达(Durand-Panteix等人(2012)J.Immunol.189:181-190)。因此，据信由于myc的易位/扩增和改变的EBV潜伏程序，BL肿瘤细胞将不会受益于针对Gal1或PD-L1的靶向治疗。该发现也增加了在其他过表达Myc的肿瘤(例如所谓的连击DLBCL(Aukema等人(2011)Blood117:2319-2331))中下调PD-L1的可能性。
对于HHV8阳性的恶性肿瘤KS和PEL，大多数病例对Gal1和AP-1组分呈阳性，但只有一个PEL病例显示膜质PD-L1染色，且只有一个KS病例显示细胞质PD-L1染色。内皮细胞有Gal1染色，所以需要对内皮衍生性肿瘤细胞的增殖的KS做仔细的解析。最近对KS中的Gal1表达的分析包括对良性血管增生的分析，并且Gal1只在KS样本中上调(Croci等人(2012)J.Exp.Med.209:1985-2000)。此外，在以前的研究中使用的相同的中和性抗-Gal1抗体显示在小鼠KS模型中减弱异常的血管生成并且促进肿瘤消退(Croci等人(2012)J.Exp.Med.209:1985-2000)。
通过引用并入
本文提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容在此通过引用并入，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地表明通过引用并入本文。在有冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
还通过引用将其全部内容并入本文的是任何多核苷酸和多肽序列，其引用与公共数据库中的条目相关的登录号，例如由基因组研究所(TheInstituteforGenomicResearch)(TIGR)保存在tigr.org互联网上的和/或由国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(NCBI)保存在ncbi.nlm.nih.gov互联网上的那些。
等同形式
本领域技术人员通过使用不超过常规的实验将认识到或者能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。这样的等同形式旨在包括于以下权利要求的范围内。

Claims (33)

1.一种长度小于或等于约60个氨基酸的重组多肽，所述多肽包括与选自下组的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQIDNO:1-16的第102-115位残基。
2.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述多肽的长度等于14个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与SEQIDNO:1-16中任一的第102-115位残基的氨基酸序列相同。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽进一步包括异源序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽是分离的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽与可检测标签共价连接。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽与运载体分子共价结合或者被固定在物体上。
8.根据权利要求7所述的重组多肽，其中所述物体选自下组：细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠、凝胶、板、阵列、和毛细管。
9.一种重组的核酸分子，所述核酸分子具有在严格条件下与如下核酸的互补链杂交的序列：所述核酸编码权利要求1-8中任一项所述的多肽的核酸，或者具有与编码权利要求1-8中任一项所述的多肽的核酸具有至少约95％同源性的序列，其中所述核酸分子仅为编码所述多肽所需的长度。
10.一种包括权利要求9所述的重组核酸的载体，其中任选地，所述载体是包括与所述核酸可操控地连接的启动子的表达载体。
11.一种表达权利要求1-8中任一项所述的多肽的宿主细胞，其包括权利要求9所述的核酸，或者包括权利要求10所述的载体。
12.一种免疫原性组合物，其包括权利要求1-8中任一项所述的多肽、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的载体、或者权利要求11所述的宿主细胞；和药学上可接受的运载体。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包括至少一种额外的免疫刺激剂。
14.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激剂是佐剂和/或免疫检查点抑制剂。
15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物，其中所述免疫检查点选自下组：PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-1、CTLA-4、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-4、BTLA、SIRPalpha(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、A2aR、及其组合。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物能够在哺乳动物中引发中和性抗-Gal1抗体。
17.一种分离的中和性抗-Gal1抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合权利要求1-8中任一项所述的多肽。
18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、抗体片段、合成的、鼠的、人的、或者被可检测化标记的。
19.根据权利要求17或18所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合部分是被可检测化标记的，包括效应域，包括Fc结构域，和/或选自下组：Fv、Fav、F(ab’)2)、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2、和双功能抗体片段。
20.一种鉴定中和性抗-Gal1抗体的方法，所述方法包括
(a)向受试者施用有效量的选自下组的试剂：权利要求1-8中任一项所述的多肽、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、或者权利要求12-16中任一项所述的免疫原性组合物，以产生中和Gal1的抗体；和
(b)分离对所述施用的试剂具有特异性的抗-Gal1抗体。
21.一种鉴定中和性抗-Gal1抗体的方法，所述方法包括
(a)在体外细胞培养系统中向B细胞施用有效量的选自下组的试剂：权利要求1-8中任一项所述的多肽、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、或者权利要求12-16中任一项所述的免疫原性组合物，以产生中和Gal1的抗体；和
(b)分离对所述施用的试剂具有特异性的抗-Gal1抗体。
22.一种制备分离的杂交瘤的方法，所述杂交瘤产生特异性结合Gal1的中和性抗-Gal1的抗体，所述方法包括：
a)用有效量的选自下组的试剂：权利要求1-8中任一项所述的多肽、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、或者权利要求12-16中任一项所述的免疫原性组合物，来免疫哺乳动物或者接触B细胞；
b)任选地从所述被免疫哺乳动物中分离脾细胞；
c)将来自所述被免疫哺乳动物的脾细胞或者B细胞与永生化的细胞系融合，以形成杂交瘤；和
d)筛选用于产生抗-Gal1抗体的个体杂交瘤，所述抗体特异性结合所述试剂。
23.一种抗体，所述抗体通过权利要求20-22中任一项所述的方法产生。
24.一种在受试者中引发抗-Gal1免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的选自下组的试剂：权利要求1-8中任一项所述的多肽、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12-16中任一项所述的免疫原性组合物、或者权利要求17-19和23中任一项所述的抗体，由此引发免疫应答。
25.根据权利要求24所述的方法，其中以单剂量施用所述试剂、以多剂量施用所述试剂、或者将所述试剂作为异源性初次免疫-加强免疫方案的一部分进行施用。
26.一种在受试者中抑制Gal1活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的选自下组的试剂：权利要求1-8中任一项所述的多肽、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12-16中任一项所述的免疫原性组合物、或者权利要求17-19和23中任一项所述的抗体，由此在所述受试者中抑制Gal1的活性。
27.一种用于在受试者中预防或延迟Gal1活性介导的疾病的发病、或者减缓Gal1活性介导的疾病的进程的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的选自下组的试剂：权利要求1-8中任一项所述的多肽、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12-16中任一项所述的免疫原性组合物、或者权利要求17-19和23中任一项所述的抗体，由此在所述受试者中预防或延迟所述Gal1介导的疾病的发病、或者减缓所述Gal1介导的疾病的进程。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，所述方法进一步包括施用至少一种额外的上调免疫应答的试剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一种额外的试剂包括免疫检查点抑制剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述免疫检查点选自下组：PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-1、CTLA-4、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-4、BTLA、SIRPalpha(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、A2aR、及其组合物。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述Gal1介导的疾病是Gal1-阳性癌症、Gal1介导的血管生成紊乱、AP1依赖性淋巴恶性瘤、MLL重排的ALL、EBV+的移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、鼻咽癌、卡波济氏肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、和黑色素瘤。
32.根据权利要求24-31中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
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