CN105601719A - 拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽及其应用，可以抑制基质金属蛋白酶2、9，具有减轻骨质疏松的多肽。其序列为PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA是全新的序列，它们可以在体外抑制基质金属蛋白酶2、9的活力，并在体内试验中可以缓解骨质疏松模型动物的骨密度下降，具有潜在的新药开发价值。

Description

拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽及其应用
技术领域
本发明涉及拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶，具有减轻骨质疏松症的多肽。
背景技术
骨质疏松即骨质疏松症(osteoporosis)，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。
目前，用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物分为两大类，第一类为抑制骨吸收药，包括钙剂、维生素D及活性维生素D、降钙素、二磷酸盐、雌激素以及异黄酮；第二类为促进骨性成药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。这些药物可以阻止骨吸收但对骨形成的作用特别小。
基质金属蛋白酶家族参与多种正常的生理功能，例如卵细胞着床，骨骼生长和器官发育等。基质金属蛋白酶被更多的看作是这些病理过程的调节因子。其家族成员包括MMP1-26分布于骨基质中。大量研究表明基质金属蛋白酶参与骨的重塑和构建且表达骨吸收活性，其中MMP-2、MMP-9等对原发性骨质疏松发病的影响已被证实。目前研究发现，MMP-2是分布最广的MMP，其主要作用可能为降解损伤或变性胶原以保护机体。MMP-9也是明胶酶中的一种。MMP-9包含一个V型的胶原蛋白结构域，这个结构域有高度的糖基化作用，，它影响底物的特异性以及有抗衰变的作用。MMP-9有许多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，细胞因子及其受体也是MMP-9作用的底物。在骨代谢中，首先由MMP-2启动骨转换，随后激活MMP-9，在MMP-2及MMP-9的作用下水解部分降解的Ⅰ型胶原及其他多种骨基质蛋白，骨盐因失去依附而丢失，发生骨质疏松。因此，测定MMP-2和MMP-9活性是影响骨质疏松的重要指标。抑制基质金属蛋白酶，可以有效抑制骨质疏松。组织金属蛋白酶抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1，TIMP-1)是由成骨细胞分泌的内源性基质金属蛋白酶抑制剂。研究表明，TIMP-1能特异性的抑制基质金属蛋，在骨重建过程中对启动骨吸收与骨形成起着重要作用。因此，制备拟TIMP-1多肽，可以有效抑制MMP，从而抑制骨质疏松。这一发现为骨质疏松患者的治疗找到了新的突破口。尽管如此，并没有成熟开发的拟TIMP-1多肽问世，用于治疗骨质疏松症。
发明内容
发明目的
本发明提供全新的序列，该序列为拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，对骨质疏松症具有很好的疗效。
技术方案
拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，其特征在于其序列为PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA，其多肽在治疗骨质疏松症的应用。
有益效果
拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制基质金属蛋白酶2、9的酶活力。在体试验研究表明，我们设计的多肽可以缓解骨质疏松模型动物的骨密度下降。
具体实施方式
实施例1
多肽的化学合成方法
多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质(可在AdvancedChemTech公司购得)上有自由氨基，按C端向N端的顺序将各个氨基酸连接。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑的混合物来封闭未连接的自由氨基。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用98％三氟乙酸从介质上切割下来。
应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA，该序列为全新序列。
也可委托上海吉尔合成。
实施例2
多肽体外对基质金属蛋白酶2、9的IC50值。
重组人基质金属蛋白酶-2由E.coli细胞表达.该酶用0.01μM的基质金属蛋白酶-3活性位点活化，所用的缓冲液为100mMTris/HCl，pH7.4，100mMNaCl，10mMCaCl2and0.01％Tween-20。活化时基质金属蛋白酶-2的浓度为72ng/μl(1μM)。酶活力的检测是通过切割荧光产生多肽底物Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2并检测产生的荧光值实现的(激发波长＝328nm，检测波长＝392nm)。所有的检测在37℃下100μl反应体系中进行。实施例1测得的IC50值为75.07μmol。
重组人基质金属蛋白酶-9的检测与-2的检测类似并使用同样的荧光产生底物。反应也是在37℃下100μl反应体系中进行。检测时向反应体系中加20μl重组人基质金属蛋白酶-9(2ng/μl).底物的终浓度为10μM。实施例1测得的IC50值为25.80μmol。
实施例3
多肽对体外培养人成骨细胞的生长EC50。
采用MTT比色法。将对数生长的人成骨细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、分别加入不同浓度的实验药物实施例1多肽(上海吉尔合成)；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成骨细胞增殖率＝(1—实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实施例1多肽的EC50为13.15μM。
实施例4
实施例1多肽对骨密度的影响：取50只大鼠随机分为5组：高剂量组、中剂量组、低剂量组，阳性对照组，模型组，每组l0只。造模及治疗大鼠用10％的水合氯醛以3ml/100g行腹腔注射，麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定于事先制作的老鼠手术台上，于腹股沟正中处做纵切口，长约2cm，切开皮肤及皮下筋膜，水平切断左侧股神经，靠近上段予以切除5mm，并作神经断端打结，缝合切口。再将大鼠取俯卧位固定于手术台上，在股骨大转子与靠近尾部之间与后外方45°方向行长约1cm的切口，暴露坐骨神经，靠近近端予以切除5mm，并作神经断端打结，缝合切口，普通喂养13周后给药。治疗：模型组按照1ml/100g的剂量灌胃生理盐水；阳性对照组灌胃2.0ml二磷酸盐；高中低剂量组分别给予实施例1多肽0.5，1.0，2mg/Kg灌胃，连续给药10周。先采用双能X线骨密度仪测双侧股骨骨密度。
结果：如表1。与模型组大鼠相比，实施例1多肽低、中、高剂量能显著性缓解大鼠骨密度下降(P<0.05)。
表1实施例1多肽对大鼠骨密度的作用
*p<0.05，**p<0.01与模型组相比
实施例5
实施例1多肽对骨密度的影响：取50只大鼠随机分为5组：高剂量组、中剂量组、低剂量组，阳性对照组，模型组，每组l0只。造模及治疗大鼠用大鼠维甲酸70mg/kg灌胃两周。治疗：模型组按照1ml/100g的剂量灌胃生理盐水；阳性对照组灌胃2.0ml二磷酸盐；高中低剂量组分别给予实施例1多肽0.5，1.0，2mg/Kg灌胃，连续给药10周。先采用双能X线骨密度仪测双侧股骨骨密度。
结果：如表2。与模型组大鼠相比，实施例1多肽低、中、高剂量能显著性缓解大鼠骨密度下降(P<0.05)。
表2实施例1多肽对大鼠骨密度的作用
*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
SEQUENCELISTING
<110>苏州普罗达生物科技有限公司
<120>拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽及其应用
<130>
<160>1
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
ProGluProGluPheHisLeuIleSerAlaPheTrpProSerLeuPro
151015
SerTyrLeuAspAlaAla
20

Claims (2)

1.拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，其特征在于其序列为PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA。
2.根据权利要求书1所述的拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽在治疗骨质疏松症的应用。
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