CN105504028A - 基质金属蛋白酶10抑制多肽及其应用 - Google Patents

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罗瑞雪
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Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶10具有减轻骨质疏松的多肽。其序列为EEVTPLTFSRLYEGEADIMISFAVKE是全新的序列，它们可以在体外抑制基质金属蛋白酶10的活力，并在体内试验中可以缓解骨质疏松模型动物的骨密度下降，具有潜在的新药开发价值。

Description

基质金属蛋白酶10抑制多肽及其应用
技术领域
本发明涉及基质金属蛋白酶10抑制多肽，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶10，具有减轻骨质疏松症的多肽。
背景技术
骨质疏松即骨质疏松症(osteoporosis)，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。
目前，用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物分为两大类，第一类为抑制骨吸收药，包括钙剂、维生素D及活性维生素D、降钙素、二磷酸盐、雌激素以及异黄酮；第二类为促进骨性成药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。这些药物可以阻止骨吸收但对骨形成的作用特别小。
基质金属蛋白酶家族参与多种正常的生理功能，例如卵细胞着床，骨骼生长和器官发育等。基质金属蛋白酶被更多的看作是这些病理过程的调节因子。基质金属蛋白酶-10(MMP-10)属于基质金属蛋白酶家族中基质水解酶成员，被称为基质溶素，在骨骼形成的成骨细胞和生长板的软骨细胞中高度表达。在人体中，诱导成肌细胞转化为成骨细胞，并参与胞外骨基质的降解代谢。因此，血浆中基质金属蛋白酶10的含量升高与骨密度下降密切相关。基质金属蛋白酶10可以抑制骨质的形成。因此，抑制基质金属蛋白酶10可以有效促进骨质的形成。这一发现为骨质疏松患者的治疗找到了新的突破口。尽管如此，并没有成熟开发的基质金属蛋白酶10抑制剂问世，用于治疗骨质疏松症。
发明内容
发明目的
本发明提供全新的序列，该序列基质金属蛋白酶10抑制多肽，可用于治疗骨质疏松症。
技术方案
基质金属蛋白酶10抑制多肽，其特征在于其序列为EEVTPLTFSRLYEGEADIMISFAVKE，其多肽在治疗骨质疏松症的应用。
有益效果
基质金属蛋白酶10抑制多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制基质金属蛋白酶10的酶活力。在体试验研究表明，我们设计的抑制多肽可以缓解骨质疏松模型动物的骨密度下降。
具体实施方式
实施例1
多肽的化学合成方法
多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质(可在AdvancedChemTech公司购得)上有自由氨基，按C端向N端的顺序将各个氨基酸连接。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑的混合物来封闭未连接的自由氨基。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用98％三氟乙酸从介质上切割下来。
应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为EEVTPLTFSRLYEGEADIMISFAVKE，该序列为全新序列。
实施例2
抑制多肽体外对基质金属蛋白酶10的IC50值。
重组人基质金属蛋白酶10酶活力的检测是通过切割荧光产生多肽底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH2并检测产生的荧光值实现的(激发波长＝328nm,检测波长＝392nm)。所有的检测在37℃下100μl反应体系中进行。活化时基质金属蛋白酶10的浓度为100ng/μl(1μM)。反应开始时向反应体系中加10μl基质金属蛋白酶-10存储液(1ng/μl)底物的终浓度为10μM。实施例1的基质金属蛋白酶10抑制多肽的IC50值为11.81μmol。
实施例3
抑制多肽对体外培养人成骨细胞的生长EC50。
采用MTT比色法。将对数生长的人成骨细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、分别加入不同浓度的实验药物实施例1多肽(上海吉尔合成)；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成骨细胞增殖率＝(1—实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实施例1多肽的EC50为4.31μM。
实施例4
实施例1抑制多肽对大鼠骨密度的影响：取50只大鼠随机分为5组：高剂量组、中剂量组、低剂量组，阳性对照组，模型组，每组l0只。造模及治疗大鼠用10％的水合氯醛以3ml/100g行腹腔注射，麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定于事先制作的老鼠手术台上，于腹股沟正中处做纵切口，长约2cm，切开皮肤及皮下筋膜，水平切断左侧股神经，靠近上段予以切除5mm，并作神经断端打结，缝合切口。再将大鼠取俯卧位固定于手术台上，在股骨大转子与靠近尾部之间与后外方45°方向行长约1cm的切口，暴露坐骨神经，靠近近端予以切除5mm，并作神经断端打结，缝合切口，普通喂养13周后给药。治疗：模型组按照1ml/100g的剂量灌胃生理盐水；阳性对照组灌胃2.0ml二磷酸盐；高中低剂量组分别给予实施例1抑制多肽0.5，1.0，2mg/Kg灌胃，连续给药10周。先采用双能X线骨密度仪测双侧股骨骨密度。
结果：如表1。与模型组大鼠相比，实施例1抑制多肽低、中、高剂量能显著性缓解大鼠骨密度下降(P<0.05)。
表1实施例1抑制多肽对大鼠骨密度的作用
*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
SEQUENCELISTING
<110>苏州普罗达生物科技有限公司
<120>基质金属蛋白酶10抑制多肽及其应用
<130>
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
GluGluValThrProLeuThrPheSerArgLeuTyrGluGlyGluAla
151015
AspIleMetIleSerPheAlaValLysGlu
2025

Claims (2)

1.基质金属蛋白酶10抑制剂多肽，其特征在于其序列为EEVTPLTFSRLYEGEADIMISFAVKE。
2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶10抑制多肽在治疗骨质疏松症的应用。
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