CN105601600A - 一种香豆素类化合物及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种香豆素类化合物，化学名称为4-对羟基苯基-5-对羟基苯乙基-7-羟基-3，4-二氢香豆素，提取方法包括：将油茶叶经过热提取、浓缩得到浓缩液，过D101大孔树脂吸附完成后，依次用蒸馏水、乙醇溶液洗脱；将采用乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析，每400-500mL为一个单位收集洗脱液；将收集的第2个单位的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每90-100mL为一个单位收集洗脱液，将第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取，即得。本发明的香豆素类化合物为一种新型的单一化合物，纯度高，成分明确，无任何杂质，属于首次提取并纯化得到，具有开拓性的意义。

Description

一种香豆素类化合物及其提取方法

技术领域

本发明涉及油茶叶中的香豆素类物质提取领域，具体而言，涉及一种香豆素类化合物及其提取方法。

背景技术

油茶(CamelliaoleiferaAbel)别名茶籽树、油茶树，为山茶属茶科(Theaceae)植物，是世界四大木本油料之一，主要分布在中国云南、广西、广东等省份，是中国特有的纯天然高级油料作物。油茶研究大多着眼于油茶仁、油茶粕、茶籽油、油茶壳或其种质资源，对油茶叶的综合利用研究较少，每年四五月间打叶产生的大批落叶造成了很大的资源浪费。油茶叶的开发利用可以充分利用废弃资源，提高油茶的综合利用效率，提高油茶主产区农民的经济收入。油茶叶含有脂肪、蛋白质、还原糖、酸、氨基酸、茶皂素、叶绿素、联苄类化合物以及香豆素类化合物等成分，其微量元素和V_C含量高于一些常见水果。

香豆素类化合物是一种生物活性很强的物质，具有抗氧、抗自由基、抑菌保鲜，防癌、防骨质疏松，清除亚硝酸盐等作用，随着天然产物研究的发展，人们对香豆素类化合物组份、其功效作用及利用价值开展了深入的研究，但是现有技术中从油茶叶中提取的香豆素类物质多属于混合物，多种化合物并存，成分不明确杂质也比较多，不纯净，不利于油茶叶提取物的广泛利用市场化。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种香豆素类化合物，克服了现有技术中存在的诸多技术问题，其为一种新型的单一化合物，纯度高，成分明确，无任何杂质，属于首次从油茶叶中提取并纯化得到，现有技术中没有任何相关记载，具有开拓性的意义，提高了香豆素类物质的附加值，更利于针对性的进行市场化应用，具有广泛的市场应用价值。

本发明的第二目的在于提供一种该香豆素类化合物的提取方法，该提取方法具有易操作，简单方便，无需配备专业人员操作也可实现，节省人力物力，前后步骤衔接紧密，提取操作条件温和，所需化学试剂便宜易得，通过特定的提取操作条件的摸索获得了一种新型化合物，为后续提取制备提供了可参考的工艺路线，非常具有借鉴价值。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明实施例提供了一种油茶叶提取物中的香豆素类化合物，该香豆素类化合物的化学中文名称为4-对羟基苯基-5-对羟基苯乙基-7-羟基-3，4-二氢香豆素，英文名称为4-p-hydroxylphenyl-5-p-hydroxylphenylethyl-7-hydroxyl-3,4-dihydro-coumarin，属于二氢香豆素的衍生物，分子量为376，化学结构式为：

本发明实施例揭示的这种化合物是首次从油茶叶中分离提取出来的，其实其是香豆素类的物质，虽然将其归于香豆素类物质，但是香豆素类物质的性能其也有一定的体现，是一种新的化合物，现有技术中还没有过任何相关报道，具有开拓性的意义。关于油茶叶的提取研究之所以这么受关注，是因为油茶叶中含有脂肪、蛋白质、还原糖、酸、氨基酸、茶皂素、叶绿素、联苄类化合物以及香豆素类化合物等成分，其微量元素和V_C含量也高于一些常见水果，更进一步的油茶叶中的香豆素类物质含量丰富，香豆素类化合物是一种生物活性很强的物质，具有抗氧、抗自由基、抑菌保鲜，防癌、防骨质疏松，清除亚硝酸盐等作用，因此直接提取浓缩后可以更加强化其保健价值，尤其本发明提取出的这种具有特定结构的香豆素类化合物，其应用价值经过进一步开发研究会更具商业价值，值得更广泛的开发利用起来。

在本发明中，提取得到的提取物中，该新型的香豆素类化合物的纯度可以达到95％以上，更优可以达到98％以上，只有少量的杂质，得到的物质很纯，不像现有技术中大部分是多种香豆素类物质形成的混合物，纯度高的单一物质相比于混合物，会更加提高其应用价值。

本发明除了针对该新型的香豆素类化合物从化学名称、化学结构式、分子量等方面予以确认，还提供了该化合物的提取方法，包括如下步骤：

(A)将油茶叶经过热提取、浓缩得到浓缩液，过D101大孔树脂吸附完成后，依次用蒸馏水、20-30wt％乙醇、75-80wt％乙醇溶液洗脱；

(B)将采用75-80wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每400-500mL为一个单位收集洗脱液；

(C)将收集的第2个单位的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每90-100mL为一个单位收集洗脱液，将第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取，即得。

本发明实施例的提取方法是专门针对本发明的特定化合物而设计的，每一个步骤均需要按照本发明的方案进行操作，不能缺少任何一个步骤，也不能颠倒前后步骤的顺序，更不能采用其他操作方法替换本发明的任一操作步骤，尤其是本发明的提取方法中涉及的各个操控参数，需要控制在适宜的范围内，比如(A)步骤中，需要采用不同溶剂进行洗脱，并且由于目标化合物存在于75-80wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液中，因此针对这部分洗脱液进行进一步的一系列提取操作，可见发明人在设计整个提取方法中均是有目的性的一步步进行操作的，是需要付出大量的创造性劳动的，才能最终提取得到目标化合物。

步骤(A)中，油茶叶在过柱子之前先要经过热提取、浓缩等预处理操作，油茶叶热提取的温度最好控制在70-80℃，更优为75℃，如果温度太高可能会破坏油茶叶中的营养成分，因此要注意温度的控制，另外热提取之前先将油茶叶粉碎成60目以上的粉状；优选地，热提取采用50wt％以上的乙醇为溶剂进行提取，粉碎成粉状有利于提取操作的顺利进行。

在本发明的步骤(B)中，75-80wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液先进行浓缩干燥后，溶解于二氯甲烷-甲醇中，再进行硅胶层析，其中硅胶层析过程中所用的硅胶目粒度控制在200-300目，以提高提取效率，二氯甲烷-甲醇的体积比最好控制在10:1-1:3，层析时每400-500mL为一个单位收集洗脱液，一般是每500mL收集为一个流份，收集大概24个组份，对其中三个组分进行细分，分别是排号为第2、10、23这三个组分，由于本发明的目标化合物存在于第2个单位的洗脱液中，针对第2组分进一步分离提取，实际进行操作时，一般为对第2个单位的洗脱液进行再一次的硅胶层析，其中硅胶层析过程中所用的硅胶目粒度控制在200-300目，以提高提取效率。

优选地，步骤(C)中，将第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取的步骤包括：将洗脱液经过液相色谱检测后，根据检测结果采用甲醇-水溶液洗脱，再用半制备液相色谱进行分离，即得。

更优选的，甲醇-水溶液的质量百分比浓度控制在60-90％；半制备液相色谱进行分离过程中，最好采用质量百分比浓度为30-40％的乙腈-水溶液为流动相，以获得更加纯净的物质。

现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的新型的油茶叶提取物中的香豆素类化合物，纯度高，成分明确，无任何杂质，属于首次从油茶叶中提取并纯化得到，现有技术中没有任何相关记载，具有开拓性的意义，提高了香豆素类物质的附加值，更利于针对性的进行市场化应用，具有广泛的市场应用价值；

(2)对于上述香豆素类化合物本发明提供的提取方法具有易操作，简单方便，无需配备专业人员操作也可实现，节省人力物力，前后步骤衔接紧密，提取操作条件温和的优点，当然本发明提供的提取方法只是较优的一种方法，对于现有技术中任何一种提取方法只要得到具有本发明特定结构的化合物，均在本发明的保护范围内。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例一中的80wt％乙醇洗脱液的HPLC图谱；

图2为本发明实施例一中的第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取后所对应的液相色谱图；

图3为本发明实施例一中的目标化合物的离子图、色谱图和质谱图；

图4为本发明实施例一中的目标化合物的¹H-NMR图谱；

图5为本发明实施例二中的目标化合物的¹³C-NMR图谱；

图6为本发明实施例二中的目标化合物的H-HCOSY图谱；

图7为本发明实施例二中的目标化合物的HSQC图谱；

图8为本发明实施例二中的目标化合物的HMBC图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

香豆素类化合物的提取方法如下步骤操作：

1)试验仪器与试剂准备：

新鲜油茶叶：采自湖南省天际岭国家森林公园，由中南林业科技大学谭晓风教授鉴定为普通油茶(CamelliaoleiferaAbel.)叶；

甲醇、乙腈：美国Fluka公司；

乙醇：国药集团；

二氯甲烷：国药集团；

二甲基亚砜(DMSO)：国药集团；

超声波清洗器，AS系列，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；

旋转蒸发仪，R-205B，上海申胜仪器公司；

D-101大孔树脂：天津富邦化工科技有限公司；

柱色谱硅胶：青岛海洋化工厂生产；

薄层色谱硅胶板：青岛海洋化工厂生产；

ZFB型三用紫外分析仪：上海康华生化仪器制造有限公司；

恒温水浴锅：北京医疗电子仪器厂；

超声波清洗器(JK-500B)：合肥金尼克机械制造有限公司；

氮吹仪：北京优晟联合科技有限公司；

分析用液相色谱：依利特高效液相色谱，配UV1201检测器；

分析色谱柱：UnitaryC184.6mm×250mm，5μm，浙江华谱新创科技有限公司；

制备色谱柱：C18，10mm×250mm，5μm，浙江华谱新创科技有限公司；

半制备液相色谱：创新通恒的LC3000型；

DAC制备色谱：创新通恒公司LC6000高效液相色谱；

2)具体提取方法：将自然阴干的油茶干燥叶粉碎成60目以上的粉末，取20kg分两批用50％乙醇按料液比1∶3加热回流重复提取2次，每次提取2h，加热提取的温度控制在70℃，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积一半的粗提液样品，备用；

3)油茶50％醇提取物样品经过质谱分析，鉴定18个组分，其中的花青素，以及提取液中的大量的多糖、蛋白质，鞣质等亲水性成分，复杂且难于分离，都不作为本发明研究的重点。因此需用D101型大孔吸附树脂纯化，方法是：用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，取一半提取液分两次上样，依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脱，每个梯度洗脱4倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩，其中80％乙醇部位总样-硅胶柱层析合并组分色谱图如图1所示，对D101大孔树脂洗脱得到的三个部位进行分析显示，水洗部位含有大量多糖和蛋白质等，20％乙醇部位可能含有茶皂苷等中等极性化合物，但这一部位有大量有色物质干扰，而且样品的紫外吸收较弱，分离难度也较大。80％乙醇部位活性较强，富含目标化合物，因此作为重点分离的目标。其中，流动相A为甲醇，B为水；洗脱程序：0-10min50％A，10-20min80％A，20-21min100％A；检测波长254nm，进样量10μL；

4)将采用80％乙醇洗脱得到洗脱液样品浓缩干燥(约150g)，溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约800g，流动相为二氯甲烷-甲醇(10:1-1:3梯度洗脱)，每500mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为1-2+2’，3-7+3’-7’，8-10+8’-10’，11-13+11’，14-16+12’-13’，17-19+14’，20-22+15’-18’，19’-21’，23-26+22’-27’，27-40，28’-34’，35’-44’，41-47，48-64，65，66-67，68-70，71，72-78，45’-51’，52’-63’，64’-67’，68’-71’，72’-84’共计24个组分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号加以区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接)；

5)经过液相检测，选取其中的第2个单位的洗脱液3-7+3’-7’进行细分，溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入8g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约80g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇(50:1-10:1梯度洗脱)，每100mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为1，2-3，4，5-7，8，9-10，11，12-14，15，16-17，18-21，22-24，25-26，27-30，31，32-36共计16个流份，12-14利用DAC制备色谱分离(色谱图如图2所示)，60wt％甲醇-水梯度洗脱，得到两个单体化合物CO-6，CO-7，以及两个需进一步纯化的组分，再利用半制备液相色谱对这两个组分进行制备，40％乙腈-水恒定洗脱，得到两个单体化合物CO-12，CO-13，CO-13即为目标化合物。

下面对得到的目标化合物进行结构鉴定，所用的仪器与试剂：NMR：核磁共振所有H谱全为400MHz，所有¹³C谱均为100MHz。核磁共振检测条件：核磁共振一维和二维脉冲序列采用仪器的相应标准程序，1H-NMR谱采样脉冲宽度90°，累加次数32；13C-NMR谱采样脉冲宽度90°，累加次数，2000，H-HCOSY、HSQC、HMBC三种试验采样数据阵均为F₂×F₁＝2048×256，零填充至2048×1024进行FT变换，窗函数处理谱图。

具体鉴定过程按照如下操作进行：

化合物CO-13，白色无定形粉末，如图3中HRESIMS(Positive)显示：m/z377.1398[M+H]⁺(CalcdforC₂₃H₂₁O₅，377.1389)，753.2779[2M+H]⁺，283.0956[M+H-C₆H₁₂O]⁺，结合¹H-NMR及¹³C-NMR确定化合物CO-13的分子式为C₂₃H₂₀O₅。

¹H-NMR图谱如图4所示，从谱图中可以看出，在低场区可以清晰的观察到6组芳基质子信号，包括一对处于苯基间位的两质子信号δ6.49(1H,d,J＝2.3Hz)，6.40(1H,d,J＝2.3Hz)和四组对称质子信号δ6.80(2H,d,J＝8.5Hz)，6.78(2H,d,J＝8.5Hz)，6.67(2H,d,J＝8.5Hz)，6.62(2H,d,J＝8.5Hz)，根据偶合常数判断四组对称质子信号均为苯基邻位偶合；δ4.14(1H,brd,J＝6.6Hz)为位于吸电基团去屏蔽区的质子信号；在高场区存在δ2.83(1H,dd,J＝6.6,15.5Hz)，2.72(1H,brd,J＝15.5Hz)，2.63(2H,m)和2.52(2H,m)四组信号，分属于三组亚甲基。

结合所有核磁谱图及分析，化合物CO-13鉴定为4-对羟基苯基-5-对羟基苯乙基-7-羟基-3，4-二氢香豆素。查Scifinder数据库，该化合物为新物质，分子量为376，提取纯度可达95wt％以上，化学结构式为：

实施例2

香豆素类化合物的提取方法如下步骤操作：

1)所用的试验仪器与试剂准备与实施例1基本相同；

2)具体提取方法：将自然阴干的油茶干燥叶粉碎成70目以上的粉末，取20kg分两批用60％乙醇按料液比1∶3加热回流重复提取2次，每次提取2h，加热提取的温度控制在80℃，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积一半的粗提液样品，备用；

3)油茶50％醇提取物样品经过质谱分析，鉴定18个组分，其中的花青素，以及提取液中的大量的多糖、蛋白质，鞣质等亲水性成分，复杂且难于分离，都不作为本发明研究的重点。因此需用D101型大孔吸附树脂纯化，方法是：用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，取一半提取液分两次上样，依次用水、30％乙醇、75％乙醇洗脱，每个梯度洗脱4倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩；

4)将采用75％乙醇洗脱得到洗脱液样品浓缩干燥(约150g)，溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约800g，流动相为二氯甲烷-甲醇(10:1-1:3梯度洗脱)，每400mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为1-2+2’，3-7+3’-7’，8-10+8’-10’，11-13+11’，14-16+12’-13’，17-19+14’，20-22+15’-18’，19’-21’，23-26+22’-27’，27-40，28’-34’，35’-44’，41-47，48-64，65，66-67，68-70，71，72-78，45’-51’，52’-63’，64’-67’，68’-71’，72’-84’共计24个组分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号加以区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接)；

5)经过液相检测，选取其中的第2个单位的洗脱液3-7+3’-7’进行细分，溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入8g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约80g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇(50:1-10:1梯度洗脱)，每90mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为1，2-3，4，5-7，8，9-10，11，12-14，15，16-17，18-21，22-24，25-26，27-30，31，32-36共计16个流份，12-14利用DAC制备色谱分离(色谱图如图2所示)，90wt％甲醇-水梯度洗脱，得到两个单体化合物CO-6，CO-7，以及两个需进一步纯化的组分，再利用半制备液相色谱对这两个组分进行制备，30％乙腈-水恒定洗脱，得到两个单体化合物CO-12，CO-13，CO-13即为目标化合物，，对该化合物进行结构鉴定的过程如下：

¹³C-NMR图谱如图5所示，从谱图中可以看出，低场区δ168.68(C-2)是内脂羰基特征信号，δ129.04(C-2”’,C-6”’)，127.68(C-2’,C-6’)，115.22(C-3’,C-5’)，114.60(C-3”’,C-5”’)是四组苯基对称碳信号，δ157.32(C-7)，156.19(C-4’)，155.17(C-4”’)，152.79(C-10)是苯环上连氧碳信号；高场区有四个碳信号，结合HSQC可知δ37.82(C-3)，35.99(C-2”)，34.42(C-1”)均为亚甲基碳信号，δ36.29(C-4)为次甲基碳信号。

目标化合物的H-HCOSY如图6所示，从谱图中可以看出，在H-HCOSY中，δ6.80(H-2’,6’)与δ6.67(H-3^’,5’)形成典型的对位取代苯的AA＇BB＇自旋系统，δ6.78(H-2”’,6”’)与δ6.62(H-3”’,5”’)形成典型的对位取代苯的AA＇BB＇自旋系统；δ6.49(H-6)与6.40(H-8)形成不完全对称的1,3,4,5-四取代苯的自旋系统；δ2.63(H-1”)与2.52(H-2”)形成一组A₂B₂的自旋系统，即-CH₂CH₂-单元；初步推断化合物中含有两个对位取代苯基、一个1,3,4,5-四取代苯基以及一组-CH₂CH₂-单元。δ4.14(H-4)，2.72(H-3a)和2.83(H-3b)三个质子两两相关，结合偶合常数可知δ4.14(H-4)与另外两个质子均为³J偶合，δ2.72(H-3a)与2.83(H-3b)为²J偶合，三个质子自成一个自旋偶合体系。

通过HSQC(图7)将碳氢信号一一对应，再利用HMBC将结构片段拼接起来。对目标化合物的HMBC图进行解析如下：如图8所示，δ4.14(H-4)，2.72(H-3a)和2.83(H-3b)三个质子均与脂羰基的δ168.68(C-2)相关，H-4位于电负性基团的去屏蔽区，显著移向低场，因此推测C-4处于羰基的β位，C-3处于α位即与羰基直接相连；δ4.14(H-4)与δ132.38(C-1’)，127.68(C-2’,C-6’)相关，δ2.72(H-3a)和2.83(H-3b)与δ132.38(C-1’)，与127.68(C-2’,C-6’)不相关，表明一个对羟基苯基连接在C-4位：由于δ2.52(H-2”)和2.63(H-1”)均与δ132.06(C-1”’)相关，而且δ2.52(H-2”)与δ129.04(C-2”’,C-6”’)相关，可以推断，另外一个对羟基苯基片段连接在-CH₂CH₂-结构单元的C-2”位。四取代苯基的C-7位连接羟基，C-10位也与氧原子直接相连，这从C-6和C-8的化学位移可以得到印证，δ2.52(H-2”)和2.63(H-1”)以及6.49(H-6)均与δ141.55(C-5)相关，将四取代苯基片段与-CH₂CH₂-结构单元连接起来；另一方面δ6.49(H-6)，6.40(H-8)，4.14(H-4)和2.72(H-3a)均与δ114.57(C-9)相关，将四取代苯基片段与内酯片段连接起来。

结合所有核磁谱图及分析，目标化合物鉴定为4-对羟基苯基-5-对羟基苯乙基-7-羟基-3，4-二氢香豆素。查Scifinder数据库，该化合物为新物质，分子量为376，提取纯度可达98wt％以上，化学结构式为：

总之，经过本发明实施例的提取方法得到的目标化合物经过结构鉴定后均具有相同的结构，而且这种化合物属于首次发现，对后续研究具有一定的指导意义。

实验例1

将本发明实施例1提取得到的目标化合物进行如下实验：MTS法检测化合物对RAW264.7细胞增殖活性的影响。将细胞接种于96孔板，分别设空白对照组、试验组(10μg/mL、30μg/mL和100μg/mL三个不同浓度组)，每组设三个复孔。每孔加MTS溶液20μL，孵育1-2小时，利用酶标仪在波长490nm条件下测其吸光值。发现试验组(三组)与对照组吸光度无显著差异，说明化合物不会影响RAW264.7细胞的增殖活性，从这个实验可以看出本发明提取得到的目标化合物对机体没有任何副作用；

然后再将本发明实施例1的目标化合物进行如下实验：利用浓度为1ug/mL的LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型。分别设空白对照组、LPS诱导组、LPS与试验组(共三组，化合物浓度分别为10μg/mL、30μg/mL和100μg/mL)，试验组与LPS诱导组相比，通过RT-qPCR、Westernblot等方法检测，发现试验组均可显著抑制RAW264.7细胞中IL-1β、TNF-α、iNOS等相关炎症因子的转录与表达水平，通过该实验可以发现本发明的目标化合物具有抑制炎症从而达到进一步抑制癌症等恶性肿瘤的效果，而且效果显著。

通过将本发明实施例2提取得到的目标化合物进行实验也呈现相同的结果。

其中，该实验中所用的实验仪器主要有：上海团结仪器制造有限公司的倒置生物显微镜，日本岛津生产的分析天平，德国eppendorf公司生产的低温离心机，北京君意公司生产的电泳仪、凝胶成像仪、垂直板电泳槽以及水平电泳槽，英国ELGA公司生产的超纯水系统，六一仪器厂生产的水平摇床等；所用的实验试剂主要有：LPS脂多糖、MTS、H-DMEM培养基、Trizol试剂、引物、异丙醇、氯仿、溴酚蓝、溴化乙锭、胎牛血清等。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种香豆素类化合物，其特征在于，该香豆素类化合物的化学结构式为：

2.权利要求1所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(A)将油茶叶经过热提取、浓缩得到浓缩液，过D101大孔树脂吸附完成后，依次用蒸馏水、20-30wt％乙醇、75-80wt％乙醇溶液洗脱；

(B)将采用75-80wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每400-500mL为一个单位收集洗脱液；

(C)将收集的第2个单位的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每90-100mL为一个单位收集洗脱液，将第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取，即得。

3.根据权利要求2所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(A)中，油茶叶热提取的温度控制在70-80℃。

4.根据权利要求3所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(A)中，热提取之前先将油茶叶粉碎成60目以上的粉状。

5.根据权利要求4所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，热提取采用50wt％以上的乙醇为溶剂进行提取。

6.根据权利要求2所述的油茶叶提取物中的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(B)中，75-80wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液先进行浓缩干燥后，溶解于二氯甲烷-甲醇中，再进行硅胶层析。

7.根据权利要求6所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(B)中，胶层析过程中所用的硅胶目粒度控制在200-300目。

8.根据权利要求2所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(C)中，将第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取的步骤包括：将洗脱液经过液相色谱检测后，根据检测结果采用甲醇-水溶液洗脱，再用半制备液相色谱进行分离，即得。

9.根据权利要求8所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(C)中，甲醇-水溶液的质量百分比浓度控制在60-90％；

优选地，半制备液相色谱进行分离过程中，采用质量百分比浓度为30-40％的乙腈-水溶液为流动相。

10.根据权利要求2-9任一项所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(C)中，最后所得的提取物中香豆素类化合物的含量在95wt％以上。