CN105593364A

CN105593364A - 新型家禽腺病毒及其疫苗

Info

Publication number: CN105593364A
Application number: CN201380079205.7A
Authority: CN
Inventors: 宋昌宣; 李重馥; 崔仁秀; 朴承龙
Original assignee: Kcav Co Ltd
Current assignee: Kcav Co Ltd
Priority date: 2013-06-27
Filing date: 2013-10-04
Publication date: 2016-05-18
Also published as: KR101564316B1; KR20150001559A

Abstract

本发明涉及新型家禽腺病毒及其疫苗。

Description

新型家禽腺病毒及其疫苗

技术领域

本发明涉及新型家禽腺病毒及其疫苗。

背景技术

被称为包涵体肝炎(Inclusionbodyhepatitis)或家禽腺病毒感染症(Fowladenovirus，FAdV)的疾病是因1群家禽腺病毒(FAdV)发病的传染病。FAdV属于腺病毒科(FamilyAdenoviridae)，基因组(gemone)由没有分节的线形双链(double-stranded)DNA构成。属于1群的家禽腺病毒共存在12个血清型，这些血清型之间表现出非常不同的病原性。已知危害韩国国内养鸡业的主要血清型是4型、8型、11型，在包涵体肝炎的情况下，大部分血清型中均被发现，在4型的情况下，已知伴有心包积水症，并且通常病原性最强。腺病毒感染症是通过感染作为主要靶标的肝细胞并形成特征性的包涵体(Inclusionbody)而引起死亡的疾病。包涵体肝炎能够垂直传播或水平传播，在垂直传播的情况下，通常3～4周龄时发病，也报道过当进行了垂直传播时7日龄之前发病的案例。单独感染时，死亡率为10％左右，较低，但与甘保罗病或鸡传染性贫血等免疫抑制性疾病形成复合感染时，死亡率会进一步变高。已知在感染伴有心包积水的血清型4型的情况下，发病率和死亡率相对变高，在敏感性高的肉鸡中死亡率能够达到80％，因此所处状况是，对韩国国内养鸡业造成巨大经济损失。

该疾病于1949年首次从鸟类分离，目前已广泛分布，全世界均有发病报告。之后，于1987年伴有心包积水症的血清型4型腺病毒感染症在巴基斯坦被报告，后来随着全世界性的发病报告，对养鸡业造成了严重的损害。在心包积水症的情况下，与以往包涵体肝炎不同，其特征在于，在没有免疫抑制性疾病的状态下，单独感染也能够导致高发病率和死亡率。此外，是在幼龄敏感性高的疾病，并且能够进行蛋传(eggtransmission)，因此其是如下疾病：种鸡群受到感染后一直无症状，但蛋传给后代雏鸡而引发严重病症，从而能够对肉鸡产业造成损害。

根据农林畜产检疫本部的报告，对于2007年至2010年申报发生包涵体肝炎的情况可以确认，血清型4型占46％，比率最高，之后是11型(31％)，8b型(23％)，因此4型、8b型以及11型所占比率高。此外，可以确认总发病报告中，72％为来自肉鸡的发病报告，蛋鸡和土鸡占据剩余比率，包涵体肝炎所造成的灾害在肉鸡中最为严重(图1)。

此外，根据农林畜产检疫本部，对于2周龄之前的鸡中因疾病的垂直传播而导致感染的情况而言，在报告的共39件中占10件，因此所处状况是，由来源于种鸡群的包涵体肝炎病毒的传播导致的灾害也持续出现发病报告。

目前韩国国内的状况是，由于未实施包涵体肝炎疫苗，因此相应疾病已胚胎继代，引起了后代雏鸡中的死亡率增加，生产性降低等问题，养鸡产业正遭受着打击。因此，切实的状况是，引入一种包涵体肝炎疫苗，其在种鸡群中，能够在抑制疾病感染的同时保持高抗体滴度，并且有助于传递母源抗体。

现有专利文献

韩国专利公开号第1020110132316

韩国专利公开号第1020110092316

发明内容

技术课题

本发明是依据上述必要性而提出的，本发明的目的在于，提供一种韩国国内分离的新型家禽腺病毒。

解决技术的方法

为了实现上述目的，本发明提供以保藏号KCTC12425BP保藏的FAdVK4家禽腺病毒。

本发明的菌株已于2013年6月12日保藏在韩国典型菌种保藏中心(韩国大田儒城区科学路125，韩国生物科学和生物技术研究院，305-806)。

在本发明的一个实施方式中，上述病毒优选为从韩国国内的鸡分离的病毒，并且优选包含序列号1的碱基序列，但不限于此。

此外，本发明提供包含上述本发明的家禽腺病毒和可药用的载体或稀释剂的针对由家禽腺病毒感染引发的疾病的家禽保护用疫苗。

在本发明的一个实施方式中，上述疫苗优选对预防或治疗包涵体肝炎有效，优选为灭活的形态，优选进一步包含助剂，优选进一步包含一种以上对家禽具有感染性的其他病原菌的疫苗成分，但不限于此。

此外，本发明提供家禽腺病毒的制造方法，该制造方法包括：向易受感染的基质接种上述本发明所定义的家禽腺病毒的步骤；b)使上述家禽腺病毒增殖的步骤；及c)收集含有上述家禽腺病毒的物质的步骤。

在本发明的一个实施方式中，上述基质优选为选自由鸡肝胚细胞(CEL)、鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡肾细胞(CK)和非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞株组成的组中的一种细胞，但不限于此。

此外，本发明提供针对由家禽腺病毒感染引发的疾病的家禽保护用疫苗的制造方法，其特征在于，包括将通过上述本发明的方法得到的收集后的家禽腺病毒与可药用的载体或稀释剂结合的步骤，必要时在将上述家禽腺病毒灭活后实施上述步骤。

此外，本发明提供在家禽中控制由家禽腺病毒感染引发的疾病的方法，该方法包括将上述本发明的疫苗施用于鸟。

本发明的疫苗例如能够根据用于市售的活的灭活的家禽腺病毒疫苗所经常使用的常规方法来准备。兽医学疫苗组合物的制造尤其在“HandbunchderSchutzimpfungeninderTiermedizin”(编写：Mays,A.等人,VerlagPaulParey,BerlinundHamburg,Germany,1984)和“VaccinesorVeterinaryApplications”(编写：Peters,A.R.等人,Butterworth-HeinemannLtd,1993)中已被说明。

将增殖步骤后收集的病毒灭活的目的在于，防止病毒的再生。一般而言，灭活能够通过化学或物理方法来实施。化学灭活例如能够通过用酶、甲醛、β-丙内酯、乙烯亚胺或其衍生物处理病毒来实施。必要时，灭活的化合物在后期被中和。被甲醛灭活的物质例如可以由硫代硫酸盐中和。物理灭活能够优选通过向病毒照射能量充分的射线、例如UV光而实施。必要时，照射后pH能够被调整为约7的值。

含有灭活的家禽腺病毒的疫苗例如可以包含一种以上符合该目的的前述可药用的载体或稀释剂。优选的是，本发明的灭活的疫苗包含一种以上具有辅助活性的化合物。符合该目的化合物或组合物包含将氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、矿物油、维生素E乙酸酯等植物油和皂苷作为主成分的水包油型或油包水型乳剂。

灭活的疫苗主要非经口施用，即通过肌肉内或皮下内施用。

本发明的疫苗包含有效量的家禽腺病毒作为活性成分，所述有效量是指通过抵抗毒性病毒所引起的攻击(施用抗原)，在接种疫苗的鸟类或其后代中使能够诱导免疫的家禽腺病毒物质免疫化的量。本申请中，免疫被定义为，与未进行疫苗接种的组相比，疫苗接种后在鸟类群体中诱导相当高水平的免疫。

通常，灭活疫苗包含与每只鸟类10⁴-10¹⁰TCID50等效的抗原。

本发明的家禽腺病毒疫苗能够有效地用于鸡，但火鸡、珍珠鸡(guineafowl)和鹌鹑等其他家禽也能够有效地以疫苗来接种。鸡包含食用鸡、克隆家畜和下蛋的家畜。

有益效果

本发明通过提供新型家禽腺病毒、包含其的疫苗及它们的制造方法，能够有效保护家禽不受家禽腺病毒感染。

附图说明

图1是2007年至2010年之间韩国国内成功分离的包涵体肝炎病毒的血清型和发病比率。<出处：农林畜产检疫本部>

图2是其他病原体感染与否的试验。

图3是HEXON基因部位的系统学分析。

具体实施方式

以下，通过非限制性的实施例来更详细说明本发明。但，下述实施例是为了例示本发明而记载的，本发明的范围不应理解为受到下述实施例的限制。

①韩国国内露天养殖场中的FowlAdenovirusFAdVK4株分离、鉴定，其他病原体否定试验

从2010年位于京畿道的肉鸡养殖场委托的肉鸡摘取肝并放入灭菌磷酸缓冲溶液(pH7.2)，从而制作10重量％的乳液。将其在3,000g下离心分离15分钟使细胞和组织沉淀，将上清液用0.45μm的注射器过滤器过滤。通过孵化11日龄的SPF鸡胚的绒毛尿囊膜(chorioallantoicmembrane:CAM)接种法分离，并通过聚合酶链式反应(PCR)最终鉴定FAdVK4细胞株。

②新型FAdV露天分离株内其他病原体否定试验

为了确认能够在鸡胚胚胎的尿囊液和绒毛尿囊膜中增殖的其他病原体的存在与否，对传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)、新城疫病毒(Newcastledisease,NDV)、传染性F囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)、鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectiousanemiavirus,CIAV)、支原体(Mycoplasma)实施逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和聚合酶链式反应(PCR)，从而确认除了甘保罗病病毒分离株(IBDK7)以外没有其他病原体。

③基因组碱基序列分析

对孵化11日龄的SPF鸡胚接种病毒，利用5天后获得的尿囊液150μl提取DNA。将如此得到的DNA与DNA溶液5μl、10×PCR缓冲液5μl、2.5mMdNTPs4μl、各引物1μl、Taq聚合酶0.5μl和DW33.5μl混合。(G.Meulemans等人,Polymerasechainreactioncombinedwithrestrictionenzymeanalysisfordetectionanddifferentiationoffowladenoviruses,AVIANPATHOLOGY30:6,655-660,2001)

将利用上述反应液得到的PCR产物精制，使用ABI3100自动碱基序列分析仪确定碱基序列。其结果，得到了由HEXON表示的本发明的FAdVK4的基因组碱基序列。(表1、表2)

[表1]

表1.HEXON碱基分析中使用的引物组(primerset)的碱基序列和位置

[表2]

表2.FAdVK4病毒的HEXON碱基序列

④FAdVK4病毒的分子生物学特性

将FAdVK4病毒全部基因与GenBank上记录的国内外包涵体肝炎病毒使用BLAST搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和Bioedit程序进行比较分析。其结果，确认IBDK4为血清型4型，并且确认与韩国国内流行的包涵体肝炎的同源性高。(图3)

⑤FAdVK4灭活油疫苗的制作和安全性实验

由鸡胚胎肝细胞(ChickenEmbryoLivercell,CEL)培养出FAdVK4细胞株直至表现出细胞病变效应(Cytopathiceffect,CPE)，然后向病毒培养液添加0.1％容量的福尔马林溶液，在4℃反应24小时而灭活后，以动物用杀毒疫苗中大量使用的作为油抗原增强剂的ISA70与抗原为30:70的比率进行乳化。乳化后最终病毒滴度为5×10⁵组织培养感染量(tissuecultureinfectivedose，TCID₅₀)/1次接种量(0.5mL)。

为了调查制造的灭活杀毒疫苗的安全性，向15只SPF鸡的大腿部肌肉内各注射1mL(2剂量(dose))。接种后调查3周临床症状、增重率、死亡率，在3周、4周、5周后各解剖5只，调查接种部位是否形成肉眼病变。其结果，在FAdVK4细胞株灭活杀毒疫苗接种组中未看到临床症状和死亡，此外接种组和对照组的增重率未表现出明显的差异，也未表现出肉芽肿形成，从而确认了试验疫苗的安全性。(表3、表4)

[表3]

表3.接种FAdVK4灭活油疫苗后3周龄的SPF接种鸡的临床症状和死亡表达只数

[表4]

表4.FAdVK4灭活油疫苗接种后3周龄的SPF接种鸡的体重变化和肉芽肿形成

⑥针对FAdVK4灭活杀毒疫苗的SPF鸡的免疫原性实验

为了了解FAdVK4灭活杀毒疫苗的免疫原性，针对6周龄的SPF鸡，对15只SPF鸡的大腿部肌肉内接种1只鸡量的FAdVK4灭活杀毒疫苗。疫苗接种3周后进行采血，通过琼脂凝胶沉淀反应(AgarGelPrecipitation,AGP)确认针对家禽腺病毒的抗体。试验结果，疫苗接种组与对照组相比表现出明显高的抗体阳性率，从而确认了试验疫苗的免疫原性。(表5)

[表5]

表5.FAdVK4灭活油疫苗接种后6周龄的SPF接种鸡的抗体形成能力

⑥接种FAdVK4灭活油疫苗的SPF鸡中对于同种和异种血清型病毒的抵抗效应试验

为了测试FAdVK4灭活油疫苗的交叉抵抗效应，将100只2周龄的SPF鸡以每组10只分成10组，然后对5组鸡的大腿部肌肉内接种1只鸡量。接种2周后将同种和异种血清型(血清型3、4、8、9、11型)通过静脉以每只10⁶TCID₅₀进行侵入性接种后，观察2周临床症状和死亡率，然后在接种2周后将所有组的鸡解剖，利用由腺病毒感染引起的肉眼病变(肝肿大和坏死，4型时为心包积液)和聚合酶链式反应(PCR)实施病毒再分离。试验结果确认，疫苗接种组与非接种对照组相比针对同种和异种病毒的临床症状和死亡率均减少，侵入性菌株再分离率也减少，从而确认了试验疫苗的交叉防御能力。(表6、表7)

[表6]

表6.FAdVK4灭活油疫苗接种后同种和异种血清型病毒侵入性接种时的临床症状、死亡率

[表7]

表7.FAdVK4灭活油疫苗接种后同种和异种血清型病毒侵入性接种时肉眼病变和病毒再分离率

⑥接种FAdVK4灭活油疫苗的种鸡的后代雏鸡中针对同种和异种血清型病毒的抵抗效应试验

为了测试FAdVK4灭活油疫苗的种鸡中的抗体形成能力和后代雏鸡中针对同种和异种血清型病毒的抵抗能力，任意选定FAdV抗体为阴性的肉用种鸡养殖场，并且分成疫苗接种组和对照组2组，向17周龄的种鸡的大腿部肌肉内注射1只鸡量的试验疫苗。注射疫苗3周后，在试验组中对20只进行采血，在对照组中对10只进行采血，通过AGP检测方法确认针对FAdV的抗体形成能力。试验结果确认，疫苗接种组与疫苗非接种组相比针对FAdV的抗体形成明显，从而确认了肉用种鸡中的免疫原性。

对于试验疫苗接种组和非接种对照组的1日龄的后代雏鸡，在试验组中利用100只，在对照组中利用50只，并分成10组，将同种和异种血清型(血清型3、4、8、9、11型)通过肌肉以每只10⁶TCID₅₀进行侵入性接种后，观察2周临床症状和死亡率，然后在接种2周后将所有组的鸡解剖，观察由腺病毒感染引起的肉眼病变(肝肿大和坏死，4型时为心包积水)和肝的组织学病变。试验结果确认，疫苗接种组的后代雏鸡中由FAdV引起的临床症状表达和死亡率明显减少，解剖时所见肉眼病变和肝的组织学病变指数也明显减少，从而确认了后代雏鸡中针对多种血清型的FAdV能够预防早期感染。(表8、表9、表10)

[表8]

表8.FAdVK4灭活油疫苗接种后17周龄的肉用种鸡中的抗体形成能力

[表9]

表9.向接种FAdVK4灭活油疫苗的种鸡的后代雏鸡侵入性接种同种和异种血清型病毒时的临床症状、死亡率

[表10]

表10.向接种FAdVK4灭活油疫苗的种鸡的后代雏鸡侵入性接种同种和异种血清型病毒2周后的肉眼病变和组织病变

专利程序中关于微生物保藏国际认证的布达佩斯条约

国际样式

对于原保藏的保藏证明

依照下记国际保藏当局并根据7.1条规定发行

委托人：宋昌宣

143-701大韩民国首尔市广津区陵洞路120建国大学校

Claims

1.一种FAdVK4家禽腺病毒，其以保藏号KCTC12425BP得到保藏。

2.根据权利要求1所述的家禽腺病毒，所述病毒是从韩国国内的鸡分离的。

3.根据权利要求1所述的家禽腺病毒，其特征在于，所述病毒具有序列号1的碱基序列。

4.一种家禽保护用疫苗，其包含权利要求1或2所述的家禽腺病毒和可药用的载体或稀释剂，并且用于由家禽腺病毒感染引发的疾病。

5.根据权利要求4所述的家禽保护用疫苗，其特征在于，所述疫苗对预防或治疗包涵体肝炎有效。

6.根据权利要求4所述的家禽保护用疫苗，其特征在于，所述疫苗为灭活的形态。

7.根据权利要求4所述的家禽保护用疫苗，其特征在于，所述疫苗进一步包含助剂。

8.根据权利要求4所述的家禽保护用疫苗，其特征在于，所述疫苗进一步包含一种以上对家禽具有感染性的其他病原菌的疫苗成分。

9.一种家禽腺病毒的制造方法，其包括：

a)向易受感染的基质接种权利要求1所述的家禽腺病毒的步骤；

b)使所述家禽腺病毒增殖的步骤；及

c)收集含有所述家禽腺病毒的物质的步骤。

10.根据权利要求9所述的家禽腺病毒的制造方法，其特征在于，所述基质是选自由鸡肝胚细胞(CEL)、鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡肾细胞(CK)和非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞株组成的组中的一种细胞。

11.一种针对由家禽腺病毒感染引发的疾病的家禽保护用疫苗的制造方法，其特征在于，包括使通过权利要求9所述的方法得到且收集的家禽腺病毒与可药用的载体或稀释剂结合的步骤，必要时所述步骤在所述家禽腺病毒灭活后实施。

12.一种在家禽中控制由家禽腺病毒感染引发的疾病的方法，其包括将权利要求4所述的疫苗施用于鸟类。