CN105572269A - 一种有序大孔整体柱色谱材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有序大孔整体柱色谱材料的制备方法。首先将甲基丙烯酸缩甘油酸酯（GMA）单体溶液提前聚合成溶胶，并将其均匀分散在溶剂相；随后将得到的悬浊液置于液氮中进行定向冷冻，再对获得材料进行固化，制备得到有序大孔整体柱。本发明将定向冷冻法应用于高效液相色谱的制备，首次获得介孔分布有序、且孔径可调的色谱整体柱介质。制备方法简单，重现性良好，且制备出的材料能够应用于快速分离生物大分子物质，有效提高色谱分离效果。

Description

一种有序大孔整体柱色谱材料的制备方法

技术领域

本发明设计一种整体柱的制备方法，特别涉及一种有序大孔整体柱色谱材料的制备方法。

背景技术

生物大分子的色谱分离技术一直是生物化工领域的前沿，而作为色谱技术核心的色谱介质，长久以来一直是众多科学家研究的热点之一。高流速、高选择性、高分辨率的色谱介质一直是众多研究工作者不断追求的^]。整体柱的双孔结构所带来的良好渗透性和低传质阻力，使其适用于高通量研究；同时由于在柱内合成，具有操作简单、成本合算的特点，是一类非常有前景、价值的的色谱介质。流动相流经固定相是色谱过程的基本特征。因此，固定相的结构、组成是影响色谱效能的关键因素。基于此分析，设计出合理的色谱介质的结构，尤其是孔的精细结构，包括孔的大小、形貌、分布等，是制备高效色谱的关键。

近年来，科学家们在整体柱合成调控孔结构这一块取得一些发展。在经典的有机相分离制备整体柱的基础上，研究工作者们对合成方法进行了改进，如采用可控活性自由基聚合、开发高性能致孔剂等(《Polymer》杂志，第48卷，2187(2007年)；《JournalofChromatographyA》杂志，第1163卷，212(2007年)；《Polymer》杂志，第47卷，2603(2006年))，精细化调节孔结构，合成了一系列具有新型孔结构的整柱材料。但是上述方法都难以突破相分离致孔剂技术的局限性，合成整体柱的流通孔结构均为无规则大孔，孔径大小均难以调控。从传质角度来看，无规则大孔不利于传质过程；此外，整体柱的多孔结构受相分离条件的影响很大，在合成大尺寸整体柱时会加重贯通孔的不均匀性，进一步造成柱效降低，背压过大，应用价值显著下降。

为了更好的指导整体柱的设计和合成，科学家们从理论上对整体柱的孔结构与其色谱行为进行了初步探索，提出了一些数学模型。Sun等(《Chemicalengineeringscience》杂志，第60卷，4780(2005年))提出了一种新型的整体柱模型，高效能整体柱应具备的孔的结构特征：规则直通管道式流通孔；管道孔之间带有高联通的小孔通道。理论证明，该种整体柱能够有效提高传质速率，显著降低分离过程中的背压。遗憾的是，到目前为止这种带有有序流通孔道的整体柱材料未被成功合成出来。整体柱进一步发展的瓶颈在于如何合理构建规则贯通孔结构。突破现有的致孔理论和技术，探索出新的致孔方法是解决这一问题的关键。

最近，一种名为冷冻冰晶定向生长法的技术被不断发展，用于制备3D有序介孔材料(《SoftMatter》杂志，第8卷，3620(2012年)；《JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology》杂志，第86卷，172(2011年)；《AdvancedMaterials》杂志，第19卷，1529(2007年))。利用冷冻过程中，溶剂晶体生长为了降低表面吉布斯能，在冷冻过程中会将溶质分子不断排挤出晶体，形成有序冰晶结构形貌，移除冰晶模板可得有序介孔材料。理论研究表明该种方法获得的多孔材料孔结构是对致孔剂晶体形貌的复制，因此冷冻条件如冷冻温度、固含量比例、致孔剂种类、冷冻速率及冷冻取向都将对最终孔材料的孔结构产生巨大影响。当温度较低时，晶体成核较迅速最终生成小尺寸冰晶，反之，温度升高时，冰晶成核速度较慢并倾向于生成大尺寸冰晶。冷冻方向的取向则可通过液氮产生的低温同周围环境的温差完成对冰晶生长方向控制。然而，目前报道成功制备出的材料有着应用限制。该种技术制备出的整体柱虽然拥有有序的贯通孔道，但在孔壁缺少必要的扩散孔，同时机械强度较差，这使其不适宜用作色谱材料。

基于此，本发明在冰晶冷冻定向生长法基础上进行探索改进，将这一方法与传统相分离致孔方法结合，从而探索出一种全新有序孔整体柱的制备技术。

发明内容

针对背景技术中存在的不足，本发明提供了一种有序大孔整体柱的制备方法，其具体方案如下：

一种有序大孔整体柱的制备方法，其特征在于：首先单体分子被预先聚合成溶胶，均匀分散在溶剂相，再将其置于液氮中定向冷冻。随后对获得的整体柱进行固化处理，最终去除致孔剂，得到有序大孔整体柱。

具体步骤如下：

1）将GMA，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDM），在致孔剂中溶解，于室温磁力搅拌，加热预制成溶胶；

2）将浊液冷却至室温，倒入反应器中，将反应器按照一定的速率逐渐浸没于液氮中，进行定向冷冻；

3）将定向冷冻获得的样品，迅速升温，于70℃~90℃范围，恒温一定的时间，进一步固化样品；

4）将样品与蠕动泵相连，先后泵入乙醇、水，去除残余的致孔剂，即得。

作为优选项：

1）所述引的致孔剂为1,4-二氧六环，三丙二醇，十二烷醇，环己烷；

2）所引述的液氮定向冷冻速率为3cm/h；

3）所引述的整体柱固化恒温温度为80℃。

本发明的有益效果体现：

1）本发明首次成功制备出了可用于色谱领域的有序大孔整体柱；

2）本发明制备出的整体柱具有孔径可调、且能高速分离生物分子的特点。

附图说明

图1：本发明方法制备有序大孔整体的示意图；

图2：实施案例1制备的整体柱的扫描电镜表征图；

图3：实施案例1制备的整体柱的蛋白动态吸附量色谱评价，其中，从左到右分别为溶菌酶(2mg/mL)和免疫球蛋白(1mg/mL)在不同流速（从左到右依次为8，4，2mg/min）条件下的动态吸附量色谱评价穿透曲线图；

图4：实施案例2制备的整体柱的压汞测试表征图；

图5：实施案例2制备的整体柱的离子交换色谱作用评价，其中，从左到右分别为溶菌酶和免疫球蛋白在不同流动相pH条件(溶菌酶从上到下依次为6、7、8；免疫球蛋白为5、5.5、6)下有序大孔整体柱对溶菌酶(左)和免疫球蛋白(右)的等温吸附曲线；

图6：实施案例3制备的整体柱的背压表征图；

图7：实施案例3制备的整体柱的动力学吸附色谱评价，其中，从左到右分别为溶菌酶和免疫球蛋白(0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.3mg/mL)。

具体实施方案

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

本例以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，协同致孔剂在传统相分离基础上同定向冰晶冷冻技术结合，制备GMA有序大孔整体柱。

(1)制备整体柱

取GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)，EDMA(乙二醇二甲基丙烯酸酯)，BPO(过氧化苯甲酰)置于200mL的烧杯中，加入致孔剂(1，4-二氧六环，三丙二醇，十二烷醇，环己烷)作为溶剂，室温磁力搅拌2h。氮气置换30min后，将反应物于60℃水浴加热至呈牛奶状浊液。冷却浊液至室温，再倒入反应器中，将反应器以3cm/h的速率逐渐浸没于液氮中，进行定向冷冻。冷冻完成后，将样品迅速升温至80℃，恒温12h，进一步固化样品。然后将样品与蠕动泵相连，先后泵入100mL乙醇，50mL水，洗除残余的致孔剂，即得。

(2)整体柱的修饰

将Na2SO3/异丙醇/水按照质量比10/15/75配制成溶液。于室温条件下，以0.2mL/min的流速连续12h泵入上述制备的环氧有序大孔整体柱中。取出样品，用蒸馏水漂洗3次以上，去除反应残余物，样品存于20%乙醇溶液中。

2.产品检测

1）制备整体柱的扫描电镜表征图2所示，由图1a可以看出，整体柱骨架中具有贯通有序大孔结构；图1b中可见该整体柱的孔壁表面较为粗糙，壁厚约为2-3μm，整体柱骨架中存在许多贯通扩散孔。由电镜结果可初步推断该种有序大孔整体合成成功。

2）蛋白质动态吸附色谱评价：以上述GMA有序大孔整体柱为分离柱，考察了不同流速下(2.0，4.0，8.0mg/min)，溶菌酶、免疫球蛋白在GMA整体柱上的保留行为。色谱流动相由A液和B液组成：其中A液为20mmol/L，pH6.0的磷酸缓冲溶液；B液为1.5MNaCl+20mmol/L的磷酸缓冲溶液。系统于室温下操作，检测器温度为室温；紫外检测波长为280nm。采用A液平衡色谱柱，达最终饱和平衡后，以流动相B液冲洗色谱柱。

由图3可见，随着流动相流速的增加，2种蛋白的动态吸附量均为产生显著变化。由此可以推知，本发明制备的整体柱存在有序大孔结构，能够提高传质效率；同时孔壁众多的扩散孔能够提高蛋白质负载量，因此能够实现快速纯化生物大分子物质。

实施例2

(1)制备整体柱

制备方法同实施例1中的步骤(1)。

(2)整体柱的修饰

制备方法同实施例1的步骤(2)。

2.产品检测

1）制备整体柱的压汞测试表征如图4所示，该整体柱大孔的尺寸分布主要集中在约7-10μm之间，该结果与电镜图1a吻合，证明该整体柱骨架中的确存在有序大孔结构。

2）离子交换色谱评价：以上述GMA有序大孔整体柱为分离柱，考察了不同流动相pH(溶菌酶：6，7，8；免疫球蛋白：5，5.5，6)条件下，溶菌酶、免疫球蛋白在GMA整体柱上的保留行为。色谱流动相由A液和B液组成：其中A液为20mmol/L，pH6.0的磷酸缓冲溶液；B液为1.5MNaCl+20mmol/L的磷酸缓冲溶液。系统于室温下操作，检测器温度为室温；紫外检测波长为280nm。采用A液平衡色谱柱，达最终饱和平衡后，以流动相B液冲洗色谱柱。

如图5所示，随着流动相pH值的增加，2种蛋白的吸附量减少。

实施例3

(1)制备整体柱

制备方法同实施例1中的步骤(1)。

(2)整体柱的修饰

制备方法同实施例1的步骤(2)。

2.产品检测

1）制备整体柱的背压表征如图6所示，流速与背压呈现良好的线性关系。当流速在较大范围变化，即使在流速高达3800cm/h的情况下，背压均较低。上述结果表明此类有序大孔整体柱具有较高的机械强度。

2）动力学吸附色谱评价：将上述GMA有序大孔整体柱粉碎磨细过筛，获得粒径大小为70μm的颗粒。考察所获吸附介质对不同浓度梯度(0.1，0.2，0.3mg/mL)的溶菌酶和免疫球蛋白的动力学吸附行为。检测器温度为室温；紫外检测波长为280nm。

如图7所示，随着流动相流速的增加，2种蛋白的动态吸附量均为产生显著变化。

Claims (8)

1.一种有序大孔整体柱色谱材料的制备方法，其特征在于：单体分子被预先聚合成溶胶，并均匀分散在溶剂相，再将其置于液氮中定向冷冻，随后对获得的整体柱进行固化处理，最终去除致孔剂得到有序大孔整体柱。

2.如权利要求1所述的制备方法的具体步骤，其特征在于：步骤如下：

将GMA，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDM），在致孔剂中溶解，于室温磁力搅拌，加热预制成溶胶。

3.将浊液冷却至室温，倒入反应器中，将反应器按照一定的速率逐渐浸没于液氮中，进行定向冷冻。

4.将定向冷冻获得的样品，迅速升温，于70℃~90℃范围，恒温一定的时间，进一步固化样品。

5.将样品与蠕动泵相连，先后泵入乙醇、水，去除残余的致孔剂，即得。

6.如权利要求1和2所述的GMA有序大孔整体柱色谱材料制备方法，其特征在于：所述引的致孔剂为1,4-二氧六环，三丙二醇，十二烷醇，环己烷。

7.如权利要求1和2所述的GMA有序大孔整体柱色谱材料制备方法，其特征在于：所引述的液氮定向冷冻速率为3cm/h。

8.如权利要求1和2所述的GMA有序大孔整体柱色谱材料制备方法，其特征在于：所引述的整体柱固化恒温温度为80℃。