CN105566587A - 一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚乙烯醇重氮聚合物，其具有式(1)所示结构，是通过对聚乙烯醇接枝改性而得，该聚乙烯醇重氮聚合物经过紫外光照射后，聚乙烯醇重氮聚合物与毛细管内壁上的硅羟基发生光固化交联反应形成涂层。该涂层的制备可以通过自组装的方式在水相中进行，制备过程简单快捷。涂层的化学键合通过感光性聚乙烯醇重氮聚合物的光固化交联反应实现，不易出现毛细管堵塞等质量问题，且分离速度快，蛋白质之间分离得更彻底。

Description

一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及聚合领域，具体涉及一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，以及采用所述聚乙烯醇重氮聚合物进行静电自组装和光固化交联反应在毛细管内壁形成稳定的共价键合的毛细管涂层。
背景技术
近年来，毛细管电泳因其灵敏度高、分辨率高、进样少、溶剂用量低、速度快、检测方法多样等特点，在药物检测、生命科学、环境保护和食品检验等领域，特别是在各种蛋白质、RNA等生物大分子的分离分析方面，得到快速的发展及广泛应用。然而未经修饰的毛细管内壁表面由于与蛋白质发生相互之间静电作用、范德华力和氢键相互作用等的影响，在毛细管内壁产生非特异性吸附，从而对复杂体系中蛋白质的分离分析造成影响。因此对毛细管内壁进行修饰成为必然的选择，所修饰的涂层性能要求越来越高。
目前，硅烷化试剂被广泛作为偶联剂应用于制备抗蛋白吸附共价键合涂层。制备中所用硅烷化试剂的毒性大，对溶剂中的水分敏感，易发生水解生成二氧化硅粒子而造成各种涂覆问题，且制备的涂层不均一、规整性差，甚至使毛细管堵塞。如：(1)专利CN101498699A报道了采用聚乙烯醇和氨丙基三乙氧基硅烷制备了毛细管电泳共价键合涂层。制备的过程有毛细管预处理，毛细管内壁硅烷化反应，管壁醛基的修饰反应和聚乙烯醇共价键合反应等多个步骤；(2)专利CN103808786A公开了一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法，利用分子刷聚合物POEGMA和硅烷化试剂化学键合制备毛细管涂层，其硅烷化处理温度达120℃，与分子刷POEGMA反应时间较长(24h)。(3)专利CN1885026A公开报道了一种毛细管电泳涂层柱，是由超支化大分子经过物理吸附和化学键合的方式制得毛细管电泳涂层柱，制备过程需进行封端处理及老化处理(温度为150-200℃)，制备过程复杂，耗时较长，所用的硅烷化试剂具有毒性、易水解。(4)Schlenoff等在《AnalyticalChemistry》杂志1999,71,4007-4013报道了利用PSS和甲基二烯丙基氯化铵(PDADMAC)通过静电自组装的方法在毛细管内壁上制备了非共价键合的抗蛋白吸附涂层，但其缺点在于涂层无法通过共价键合在毛细管内壁上，寿命短、稳定性差。
上述所列的毛细管电泳涂层柱的制备方法，操作条件苛刻，制备过程中毒性较大，生产效率偏低，成本较高，且所制备的抗蛋白吸附毛细管电泳涂层柱稳定性差，限制了其在蛋白质等分离分析中的应用。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有的毛细管壁涂覆材料涂覆工艺复杂且涂层稳定性差的问题，进而提供一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，所述的聚乙烯醇重氮聚合物在注射器驱动力的作用下，在所述石英毛细管内壁组装生长，经过紫外光照后，聚乙烯醇重氮聚合物与毛细管内壁上的硅羟基发生光固化交联反应构筑涂层。采用这种带有聚乙烯醇重氮聚合物涂层的毛细管对蛋白质分离时能够实现分离速度快，蛋白质之间分离得更彻底的优点。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种聚乙烯醇重氮聚合物，其具有式(1)所示结构：
其中m为5-10的整数,n为8-15的整数。
一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
S1、合成氯代聚醋酸乙烯酯(PVAc-Cl)：
将单体醋酸乙烯酯(VAc)溶于第一有机溶剂中，引发剂及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入反应容器内，并在惰性气氛中于50℃-80℃回流条件下反应5-8h，再将产物洗涤，得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物氯代聚醋酸乙烯酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化苯甲酰或过氧化二苯甲酰中的一种或其中几种的混合物；
S2、合成聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯(P(VAc-b-St))：
将催化剂卤化亚铜、配体2,2-联吡啶(bpy)、苯乙烯单体(St)加入反应釜中，并在惰性气氛中于室温条件下搅拌均匀后，加入步骤S1制备的氯代聚醋酸乙烯酯，将混合物加热到125-135℃，恒温搅拌反应2-5h；待反应液冷却后，加入第二有机溶剂溶解粗产物，溶解后的溶液用色谱柱过滤以去除残留的铜离子，再将产物洗涤得淡黄色固体，真空干燥后得聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯；
S3合成聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St))：
将聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯溶解于第三有机溶剂中，并加入pH＝11-13的强碱型甲醇溶液，加热至60-80℃回流反应2-4h，水解产物用甲醇沉淀析出，过滤2-3次，在50-70℃条件下真空干燥，得到聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S4合成硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NO2)：
将聚乙烯醇-b-聚苯乙烯溶解于第三有机溶剂中，在0-3℃的冰水浴条件下缓慢滴加硝酸和浓硫酸的混合溶液；反应5-8h后，加入冷水和/或冰块至其溶解，高速离心，滤饼洗涤，于常温下真空干燥，得到硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S5合成氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NH2)：
将硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯、氯化亚锡加入到pH＝2-3的酸性甲醇溶液中，于室温条件下搅拌反应22-28h；高速离心，滤饼洗涤，真空干燥后得到氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S6合成聚乙烯醇重氮聚合物：
将氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯和酸性溶液加入到反应釜中，冰水浴冷却至0-3℃后，滴加浓度为0.1-0.25mol·L-1的亚硝酸钠溶液，反应终点后再搅拌反应0.5-3h，即可生成聚乙二醇重氮聚合物。
所述步骤S1中单体醋酸乙烯酯与偶氮二异丁腈的摩尔比为1:0.001-1:0.003；所述的醋酸乙烯酯与四氯化碳的摩尔比为1:0.03-1:0.05。
所述步骤S2中所述氯代聚醋酸乙烯酯与氯化亚铜的摩尔比为1:1.0-1:2.5；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与2,2-联吡啶的摩尔比为1:3.0-1:5.0；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与苯乙烯单体的摩尔比为1:4.0-1:8.0。
所述步骤S3中所述的聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯与氢氧化钠的甲醇溶液的摩尔比为1:2.5-1:5.0。
所述步骤S4中所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与硝酸的摩尔比为1:1.5-1:3.0；所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与浓硫酸的摩尔比为1:2-1:4.0；
所述步骤S5中所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与氯化亚锡的摩尔比为1:4.0-1:6.0；所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与酸性甲醇溶液中的酸的摩尔比为1:2.5-1:5.0；
所述步骤S6中所述的氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与酸性溶液的摩尔比为1:2.0-1:4.5；所述的端氨基苯基聚乙二醇与浓亚硝酸钠溶液的摩尔比为1:1.0-1:4.0。
详细地，所述步骤S1为：将单体醋酸乙烯酯(VAc)溶于第一有机溶剂中，引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入圆底烧瓶内，经通氮气、抽真空反复循环3次驱走空气，并于50℃-80℃回流条件下反应5-8h，再将产物经甲醇溶解，水沉淀，反复2-3次，至得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物大分子引发剂氯代聚醋酸乙烯酯；所述第一有机溶剂为丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)。
所述步骤S2中所述的第二有机溶剂为四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中的一种或其中几种的组合物；
所述步骤S2中的卤化亚铜为氯化亚铜(CuCl)和/或溴化亚铜；
所述的步骤S3中强碱甲醇溶液为氢氧化钾水溶液和/或氢氧化钠水溶液与甲醇的混合物；
所述的步骤S3和S4中的第三有机溶剂为四氢呋喃(THF)、二氯甲烷，三氯甲烷中的一种或其中几种的组合物；
所述的步骤S6中酸性甲醇溶液为盐酸水溶液和/或磷酸水溶液与甲醇的混合物。
所述的步骤S1的洗涤条件为：将产物经甲醇溶解后，再采用水沉淀，反复2-3次；
所述的步骤S2的洗涤条件为：将产物用正己烷沉淀，抽滤后，滤饼重新沉淀抽滤2-3次。
一种毛细管内壁涂层的制备方法，包括下述步骤：
将浓度为4mg·ml-1-10mg·ml-1的聚乙烯醇重氮聚合物溶液缓慢注入活化后的毛细管内，所述聚乙烯醇重氮聚合物溶液沿所述石英毛细管内壁生长完成自组装过程，经过紫外光照射后，聚乙烯醇重氮聚合物与毛细管内壁上的硅羟基发生光固化交联反应形成涂层，所述的紫外光光源波长在248nm-365nm，照射时间为10min-30min。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的聚乙烯醇重氮聚合物可以自组装涂覆在毛细管内壁，聚乙烯醇重氮聚合物溶液能够在注射器驱动力的作用下沿石英毛细管内壁组装生长，经过紫外光照射后，聚乙烯醇重氮聚合物与毛细管内壁上的硅羟基发生光固化交联反应形成涂层。该涂层的制备可以通过自组装的方式在水相中进行，制备过程简单快捷。涂层的化学键合通过感光性聚乙烯醇重氮聚合物的光固化交联反应实现，不易出现毛细管堵塞等质量问题。
(2)本发明的聚乙烯醇分子具有良好的亲水性，优异的抗蛋白吸附能力，因此应用于毛细管内壁涂层时具有优良的蛋白分离能力。
(3)本发明的毛细管内壁的涂层为聚乙烯醇重氮聚合物经紫外光照射后聚合而成，避免使用毒性高、价格昂贵的偶联剂硅烷化试剂，简化了制备毛细管共价键合涂层的流程，重复性好，原料价格低，生产过程绿色环保。
(4)采用本发明提供的毛细管进行对三种常见蛋白质1、溶菌酶，2、牛血清白蛋白，3、核糖核酸酶A，电泳分离性能的比较表明，聚乙烯醇重氮聚合物的毛细管共价键合的涂层能够对常见的三种蛋白质进行很好的基线分离，而毛细管裸柱则无法对这三种蛋白质进行分离，而且其可以在短短的15min内实现分离，从图2至图6可知，三种蛋白质的电泳分离曲线的峰与峰之间的间隔较大，因此本发明提供的带有的聚乙烯醇重氮聚合物涂层的毛细管能够使这三种常见蛋白质分离的更彻底。
附图说明
图1-1是聚乙烯醇傅立叶变换红外光谱分析曲线图；
图1-2是实施例1所得的聚乙烯醇重氮聚合物的傅立叶变换红外光谱分析曲线图；
图2至图6是典型的感光性抗蛋白吸附共价键合涂层与毛细管裸柱对三种常见蛋白质电泳分离性能的比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
本发明所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法包括以下步骤：
一种聚乙烯醇重氮聚合物，其具有式(1)所示结构：
其中m为5-10的整数,n为8-15的整数。
其合成工艺路线如下所示：
本发明所述的活化毛细管裸柱的方法包括如下步骤：
先后分别用0.1mol·L-1的氢氧化钠溶液、蒸馏水、0.1mol·L-1盐酸溶液、蒸馏水及甲醇冲洗毛细管裸柱，时间分别为30min、10min、30min、10min和10min，最后用N2吹干毛细管裸柱，即可获得活化的毛细管裸柱。
实施例1
一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，包括下述步骤：
S1、合成氯代聚醋酸乙烯酯(PVAc-Cl)：
将干燥后的醋酸乙烯酯(VAc)溶于丙酮中，再将引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入圆底烧瓶内；其中醋酸乙烯酯与偶氮二异丁腈和四氯化碳的摩尔比分别为1∶0.001和1∶0.03。经通氮气、抽真空反复循环3次驱走空气形成惰性氛围后，并于60℃回流条件下反应6h，再将产物经甲醇溶解，水沉淀，反复3次，直至得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物氯代聚醋酸乙烯酯；
S2、合成聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯(P(VAc-b-St))：
将催化剂氯化亚铜(CuCl)、配体2,2-联吡啶(bpy)、苯乙烯单体(St)加入反应釜中，通氮气、抽真空反复循环3次，于室温条件下搅拌均匀后，加入步骤S1制备的氯代聚醋酸乙烯酯；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与氯化亚铜、2,2-联吡啶和苯乙烯单体的摩尔比分别为1∶1.0、1∶3.0和1∶4.0。将混合物加热到130℃，恒温搅拌反应3h；待反应液冷却后，加入四氢呋喃溶解粗产物，溶解后的溶液用中性三氧化二铝(Al2O3)色谱柱过滤以出去残留的铜离子，再用正己烷沉淀，抽滤后，滤饼重新沉淀2次，得淡黄色固体，真空干燥后得聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯；
S3合成聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St))：
将聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯嵌段产物溶解于四氢呋喃中，再加pH＝12的强碱氢氧化钠的甲醇溶液，加热至60℃回流反应3h。水解产物用甲醇沉淀析出，过滤3次，在60℃条件下真空干燥，得到聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S4合成硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NO2)：
将聚乙烯醇-b-聚苯乙烯溶解于四氢呋喃中，在0-3℃的冰水浴条件下缓慢滴加硝酸和浓硫酸的混合溶液；所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与硝酸、浓硫酸的摩尔比分别为1∶1.5和1∶2.0。反应5h后，加入冰块至其溶解，高速离心，滤饼采用蒸馏水洗涤3次，于常温下真空干燥，得到硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S5合成氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NH2)：
将硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯、氯化亚锡加入到pH＝2-3的盐酸的甲醇溶液中；所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与氯化亚锡、盐酸的摩尔比分别为1∶4.0和1∶2.5；于室温条件下搅拌反应24h；高速离心，蒸馏水洗涤3次后，真空干燥后得到淡黄色氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S6合成聚乙烯醇重氮聚合物：
将氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯和盐酸溶液加入到反应釜中，冰水浴冷却至0-3℃后，滴加浓亚硝酸钠溶液0.1mol·L-1；所述的氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与盐酸、浓亚硝酸钠的摩尔比分别为1∶2.0和1∶1.0。用淀粉-KI试纸检测反应终点，再搅拌反应2h，即可生成聚乙烯醇重氮聚合物。
图1-1和图1-2分别所示为醋酸乙烯酯和本发明的聚乙烯醇重氮聚合物的傅立叶变换红外谱仪测得。
利用上述聚乙光谱分析曲线图，傅立叶变换红外光谱分析图由Tensor27型红外光聚乙烯醇重氮聚合物在毛细管内壁涂层的方法，包括下述步骤：
将活化后的毛细管裸柱用浓度为8.0mg·ml-1的聚乙烯醇重氮聚合物溶液用注射器缓慢注入活化后的毛细管中，所述聚乙烯醇重氮聚合物溶液注射器的驱动力的作用下沿所述石英毛细管内壁生长完成自组装过程。将组装好的毛细管用蒸馏水冲洗，同时置于波长为325nm的紫外灯下曝光，曝光时间为20min，即可构筑具有感光性聚乙烯醇结构的抗蛋白吸附共价键合涂层。由于毛细管内壁上的硅羟基与涂层间发生光固化交联反应而被屏蔽，所以该共价键合涂层具有优异的抗蛋白吸附性能，图2所示为本实施例的毛细管对三种常见蛋白质1、溶菌酶，2、牛血清白蛋白，3、核糖核酸酶A，电泳分离性能的比较，聚乙烯醇重氮聚合物的毛细管共价键合的涂层能够对常见的三种蛋白质进行很好的基线分离，而毛细管裸柱则无法对这三种蛋白质进行分离(位于图2中上方的曲线bare)。
图2的蛋白质分离性能由CL-1020型毛细管电泳仪测得，被分析物中三种蛋白质(溶菌酶、牛血清白蛋白、核糖核酸酶A)的浓度均为0.5mg·ml-1，紫外检测波长均为214nm，共价键合毛细管涂层与毛细管裸柱的有效长度均为40cm，内径均为75μm，检测的柱温均为25℃，分离电压均为+15KV，分离介质均是浓度为40mM的磷酸盐缓冲溶液，其pH＝3.0。
本实施例提供的一种新型的共价键合聚乙烯醇毛细管涂层的制备方法，通过感光性重氮基将具有抗蛋白吸附性能的聚乙烯醇(PVA)键合在毛细管内壁，从而形成有效而稳定的聚合物涂层应用于毛细管电泳分离蛋白质。从图2可知，本实施例可以在短短的15min内实现分离，三种蛋白质的电泳分离曲线的峰与峰之间的间隔较大，因此本发明提供的带有的聚乙烯醇重氮聚合物涂层的毛细管能够使这三种常见蛋白质分离的更彻底。
实施例2
一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，包括下述步骤：
S1、合成氯代聚醋酸乙烯酯：
将干燥后的醋酸乙烯酯(VAc)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再将引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入圆底烧瓶内；其中醋酸乙烯酯与偶氮二异丁腈和四氯化碳的摩尔比分别为1∶0.002和1∶0.04。经通氮气、抽真空反复循环3次驱走空气形成惰性氛围后，并于50℃回流条件下反应5h，再将产物经甲醇溶解，水沉淀，反复2次，直至得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物大分子引发剂氯代聚醋酸乙烯酯；
S2、合成聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯(P(VAc-b-St))：
将催化剂氯化亚铜(CuCl)、配体2,2-联吡啶(bpy)、苯乙烯单体(St)加入反应釜中，通氮气、抽真空反复循环3次，于室温条件下搅拌均匀后，加入步骤S1制备的氯代聚醋酸乙烯酯；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与氯化亚铜、2,2-联吡啶和苯乙烯单体的摩尔比分别为1∶2.0、1∶4.0和1∶6.0。将混合物加热到125℃，恒温搅拌反应5h；待反应液冷却后，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解粗产物，溶解后的溶液用中性三氧化二铝(Al2O3)色谱柱过滤以出去残留的铜离子，再用正己烷沉淀，抽滤后，重新沉淀3次，得淡黄色固体，真空干燥后得聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯；
S3合成聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St))：
将聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯嵌段产物溶解于四氢呋喃中，再加pH＝13的强碱氢氧化钠的甲醇溶液，加热至70℃回流反应2h。水解产物用甲醇沉淀析出，过滤2次，在60℃条件下真空干燥，得到聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S4合成硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NO2)：
将聚乙烯醇-b-聚苯乙烯溶解于四氢呋喃中，在0-3℃的冰水浴条件下缓慢滴加硝酸和浓硫酸的混合溶液；所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与硝酸、浓硫酸的摩尔比分别为1∶2.0和1∶3.0。反应6h后，加入冰块至其溶解，高速离心，蒸馏水洗涤3次，于常温下真空干燥，得到硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S5合成氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NH2)：
将硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯、氯化亚锡加入到pH＝2盐酸的甲醇溶液中；所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与氯化亚锡、盐酸的摩尔比分别为1∶5.0和1∶3.0。于室温条件下搅拌反应22h；高速离心，蒸馏水洗涤3次后，真空干燥后得到淡黄色氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S6合成聚乙烯醇重氮聚合物：
将氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯和磷酸溶液加入到反应釜中，冰水浴冷却至0-3℃后，滴加浓亚硝酸钠溶液0.25mol·L-1；所述的氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与盐酸、浓亚硝酸钠的摩尔比分别为1∶3.0和1∶3.0。用淀粉-KI试纸检测反应终点，再搅拌反应0.5h，即可生成聚乙烯醇重氮聚合物。
利用上述聚乙烯醇重氮聚合物在毛细管内壁涂层的方法，包括下述步骤：
将活化后的毛细管裸柱用浓度为4.0mg·ml-1的聚乙烯醇重氮聚合物溶液用注射器缓慢注入活化后的毛细管中，所述聚乙烯醇重氮聚合物溶液注射器的驱动力的作用下沿所述石英毛细管内壁生长完成自组装过程。将组装好的毛细管用蒸馏水冲洗，同时置于波长为248nm的紫外灯下曝光，曝光时间为30min，即可构筑具有感光性聚乙烯醇结构的抗蛋白吸附共价键合涂层。由于毛细管内壁上的硅羟基与涂层间发生光固化交联反应而被屏蔽，所以该共价键合涂层具有优异的抗蛋白吸附性能。图3所示为本实施例的毛细管对三种常见蛋白质1、溶菌酶，2、牛血清白蛋白，3、核糖核酸酶A。
本实施例提供的一种新型的共价键合聚乙烯醇毛细管涂层的制备方法，通过感光性重氮基将具有抗蛋白吸附性能的聚乙烯醇(PVA)键合在毛细管内壁，从而形成有效而稳定的聚合物涂层应用于毛细管电泳分离蛋白质。从图3可知，本实施例可以在短短的16min内实现分离，三种蛋白质的电泳分离曲线的峰与峰之间的间隔较大，因此本发明提供的带有的聚乙烯醇重氮聚合物涂层的毛细管能够使这三种常见蛋白质分离的更彻底。
实施例3
一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，包括下述步骤：
S1、合成氯代聚醋酸乙烯酯：
将干燥后的醋酸乙烯酯(VAc)溶于N，N-二甲基乙酰胺中，再将引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入圆底烧瓶内；其中醋酸乙烯酯与偶氮二异丁腈和四氯化碳的摩尔比分别为1∶0.003和1∶0.05。经通氮气、抽真空反复循环3次驱走空气形成惰性氛围后，并于80℃回流条件下反应8h，再将产物经甲醇溶解，水沉淀，反复2-3次，直至得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物大分子引发剂氯代聚醋酸乙烯酯；
S2、合成聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯(P(VAc-b-St))：
将催化剂氯化亚铜(CuCl)、配体2,2-联吡啶(bpy)、苯乙烯单体(St)加入反应釜中，通氮气、抽真空反复循环3次，于室温条件下搅拌均匀后，加入步骤S1制备的氯代聚醋酸乙烯酯；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与氯化亚铜、2,2-联吡啶和苯乙烯单体的摩尔比分别为1∶2.5、1∶5.0和1∶8.0。将混合物加热到135℃，恒温搅拌反应2h；待反应液冷却后，加入N，N-二甲基乙酰胺溶解粗产物，溶解后的溶液用中性三氧化二铝(Al2O3)色谱柱过滤以出去残留的铜离子，再用正己烷沉淀，抽滤后，重新沉淀2-3次，得淡黄色固体，真空干燥后得聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯；
S3合成聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St))：
将聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯嵌段产物溶解于四氢呋喃中，再加pH＝11的强碱氢氧化钾的甲醇溶液，加热至80℃回流反应4h。水解产物用甲醇沉淀析出，过滤3次，在60℃条件下真空干燥，得到聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S4合成硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NO2)：
将聚乙烯醇-b-聚苯乙烯溶解于四氢呋喃中，在0-3℃的冰水浴条件下缓慢滴加硝酸和浓硫酸的混合溶液；所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与硝酸、浓硫酸的摩尔比分别为1∶3.0和1∶4.0。反应8h后，加入冰块至其溶解，高速离心，蒸馏水洗涤3次，于常温下真空干燥，得到硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S5合成氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NH2)：
将硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯、氯化亚锡加入到pH＝2盐酸的甲醇溶液中；所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与氯化亚锡、盐酸的摩尔比分别为1∶6.0和1∶5.0。于室温条件下搅拌反应24h；高速离心，蒸馏水洗涤3次后，真空干燥后得到淡黄色氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S6合成聚乙烯醇重氮聚合物：
将氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯和盐酸溶液加入到反应釜中，冰水浴冷却至0-3℃后，滴加浓亚硝酸钠溶液0.25mol·L-1；所述的氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与盐酸、浓亚硝酸钠的摩尔比分别为1∶4.5和1∶4.0。用淀粉-KI试纸检测反应终点，再搅拌反应3h，即可生成聚乙烯醇重氮聚合物。
利用上述聚乙烯醇重氮聚合物在毛细管内壁涂层的方法，包括下述步骤：
将活化后的毛细管裸柱用浓度为10.0mg·ml-1的聚乙烯醇重氮聚合物溶液用注射器缓慢注入活化后的毛细管中，所述聚乙烯醇重氮聚合物溶液注射器的驱动力的作用下沿所述石英毛细管内壁生长完成自组装过程。将组装好的毛细管用蒸馏水冲洗，同时置于波长为365nm的紫外灯下曝光，曝光时间为10min，即可构筑具有感光性聚乙烯醇结构的抗蛋白吸附共价键合涂层。由于毛细管内壁上的硅羟基与涂层间发生光固化交联反应而被屏蔽，所以该共价键合涂层具有优异的抗蛋白吸附性能。图4所示为本实施例的毛细管对三种常见蛋白质1、溶菌酶，2、牛血清白蛋白，3、核糖核酸酶A。
本实施例提供的一种新型的共价键合聚乙烯醇毛细管涂层的制备方法，通过感光性重氮基将具有抗蛋白吸附性能的聚乙烯醇(PVA)键合在毛细管内壁，从而形成有效而稳定的聚合物涂层应用于毛细管电泳分离蛋白质。从图4可知，本实施例可以在短短的16.3min内实现分离，三种蛋白质的电泳分离曲线的峰与峰之间的间隔较大，因此本发明提供的带有的聚乙烯醇重氮聚合物涂层的毛细管能够使这三种常见蛋白质分离的更彻底。
实施例4
一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，包括下述步骤：
S1、合成氯代聚醋酸乙烯酯：
将干燥后的醋酸乙烯酯(VAc)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再将引发剂过氧化苯甲酰、及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入圆底烧瓶内；其中醋酸乙烯酯与过氧化苯甲酰和四氯化碳的摩尔比分别为1∶0.001和1∶0.04。经通氮气、抽真空反复循环3次驱走空气，并于70℃回流条件下反应7h，再将产物经甲醇溶解，水沉淀，反复3次，直至得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物大分子引发剂氯代聚醋酸乙烯酯；
S2、合成聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯(P(VAc-b-St))：
将催化剂溴化亚铜、配体2,2-联吡啶(bpy)、苯乙烯单体(St)加入反应釜中，通氮气、抽真空反复循环3次，于室温条件下搅拌均匀后，加入步骤S1制备的氯代聚醋酸乙烯酯；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与溴化亚铜、2,2-联吡啶和苯乙烯单体的摩尔比分别为1∶2.0、1∶4.0和1∶7.0。将混合物加热到130℃，恒温搅拌反应4h；待反应液冷却后，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解粗产物，溶解后的溶液用中性三氧化二铝(Al2O3)色谱柱过滤以出去残留的铜离子，再用正己烷沉淀，抽滤后，重新沉淀3次，得淡黄色固体，真空干燥后得聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯；
S3合成聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St))：
将聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯嵌段产物溶解于二氯甲烷中，再加pH＝12的强碱氢氧化钾的甲醇溶液，加热至60℃回流反应3h。水解产物用甲醇沉淀析出，过滤2次，在50℃条件下真空干燥，得到聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S4合成硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NO2)：
将聚乙烯醇-b-聚苯乙烯溶解于二氯甲烷中，在0-3℃的冰水浴条件下缓慢滴加硝酸和浓硫酸的混合溶液；所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与硝酸、浓硫酸的摩尔比分别为1∶2.0和1∶3.0。反应7h后，加入冰块至其溶解，高速离心，蒸馏水洗涤3次，于常温下真空干燥，得到硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S5合成氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NH2)：
将硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯、氯化亚锡加入到pH＝2盐酸的甲醇溶液中；所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与氯化亚锡、盐酸的摩尔比分别为1∶5.0和1∶4.0。于室温条件下搅拌反应28h；高速离心，蒸馏水洗涤3次后，真空干燥后得到淡黄色氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S6合成聚乙烯醇重氮聚合物：
将氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯和磷酸溶液加入到反应釜中，冰水浴冷却至0-3℃后，滴加浓亚硝酸钠溶液0.15mol·L-1；所述的氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与盐酸、浓亚硝酸钠的摩尔比分别为1∶2.5和1∶2.5。用淀粉-KI试纸检测反应终点，再搅拌反应1h，即可生成聚乙烯醇重氮聚合物。
利用上述聚乙烯醇重氮聚合物在毛细管内壁涂层的方法，包括下述步骤：
将活化后的毛细管裸柱用浓度为6.0mg·ml-1的聚乙烯醇重氮聚合物溶液用注射器缓慢注入活化后的毛细管中，所述聚乙烯醇重氮聚合物溶液注射器的驱动力的作用下沿所述石英毛细管内壁生长完成自组装过程。将组装好的毛细管用蒸馏水冲洗，同时置于波长为325nm的紫外灯下曝光，曝光时间为25min，即可构筑具有感光性聚乙烯醇结构的抗蛋白吸附共价键合涂层。由于毛细管内壁上的硅羟基与涂层间发生光固化交联反应而被屏蔽，所以该共价键合涂层具有优异的抗蛋白吸附性能。图5所示为本实施例的毛细管对三种常见蛋白质1、溶菌酶，2、牛血清白蛋白，3、核糖核酸酶A。
本实施例提供的一种新型的共价键合聚乙烯醇毛细管涂层的制备方法，通过感光性重氮基将具有抗蛋白吸附性能的聚乙烯醇(PVA)键合在毛细管内壁，从而形成有效而稳定的聚合物涂层应用于毛细管电泳分离蛋白质。从图5可知，本实施例可以在短短的17.5min内实现分离，三种蛋白质的电泳分离曲线的峰与峰之间的间隔较大，因此本发明提供的带有的聚乙烯醇重氮聚合物涂层的毛细管能够使这三种常见蛋白质分离的更彻底。
实施例5
一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，包括下述步骤：
S1、合成氯代聚醋酸乙烯酯：
将干燥后的醋酸乙烯酯(VAc)溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中，再将引发剂过氧化二苯甲酰、及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入圆底烧瓶内；其中醋酸乙烯酯与过氧化二苯甲酰和四氯化碳的摩尔比分别为1∶0.001和1∶0.03。经通氮气、抽真空反复循环3次驱走空气，并于60℃回流条件下反应6h，再将产物经甲醇溶解，水沉淀，反复2次，直至得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物大分子引发剂氯代聚醋酸乙烯酯；
S2、合成聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯(P(VAc-b-St))：
将催化剂氯化亚铜(CuCl)、配体2,2-联吡啶(bpy)、苯乙烯单体(St)加入反应釜中，通氮气、抽真空反复循环3次，于室温条件下搅拌均匀后，加入步骤S1制备的氯代聚醋酸乙烯酯；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与氯化亚铜、2,2-联吡啶和苯乙烯单体的摩尔比分别为1∶1.0、1∶3.0和1∶6.0。将混合物加热到130℃，恒温搅拌反应3h；待反应液冷却后，加入N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)溶解粗产物，溶解后的溶液用中性三氧化二铝(Al2O3)色谱柱过滤以出去残留的铜离子，再用正己烷沉淀，抽滤后，重新沉淀2-3次，得淡黄色固体，真空干燥后得聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯；
S3合成聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St))：
将聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯嵌段产物溶解于三氯甲烷中，再加pH＝12的强碱氢氧化钠的甲醇溶液，加热至60℃回流反应3h。水解产物用甲醇沉淀析出，过滤2-3次，在70℃条件下真空干燥，得到聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S4合成硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NO2)：
将聚乙烯醇-b-聚苯乙烯溶解于三氯甲烷中，在0-3℃的冰水浴条件下缓慢滴加硝酸和浓硫酸的混合溶液；所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与硝酸、浓硫酸的摩尔比分别为1∶2.0和1∶4.0。反应5h后，加入冰块至其溶解，高速离心，蒸馏水洗涤3次，于常温下真空干燥，得到硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S5合成氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NH2)：
将硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯、氯化亚锡加入到pH＝2-3的磷酸的甲醇溶液中；所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与氯化亚锡、磷酸的摩尔比分别为1∶2.5和1∶4.0。于室温条件下搅拌反应24h；高速离心，蒸馏水洗涤3次后，真空干燥后得到淡黄色氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S6合成聚乙烯醇重氮聚合物：
将氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯和磷酸溶液加入到反应釜中，冰水浴冷却至0-3℃后，滴加浓亚硝酸钠溶液0.2mol·L-1；所述的氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与盐酸、浓亚硝酸钠的摩尔比分别为1∶4.0和1∶2.5。用淀粉-KI试纸检测反应终点，再搅拌反应2h，即可生成聚乙烯醇重氮聚合物。
利用上述聚乙烯醇重氮聚合物在毛细管内壁涂层的方法，包括下述步骤：
将活化后的毛细管裸柱用浓度为8.0mg·ml-1的聚乙烯醇重氮聚合物溶液用注射器缓慢注入活化后的毛细管中，所述聚乙烯醇重氮聚合物溶液注射器的驱动力的作用下沿所述石英毛细管内壁生长完成自组装过程。将组装好的毛细管用蒸馏水冲洗，同时置于波长为325nm的紫外灯下曝光，曝光时间为15min，即可构筑具有感光性聚乙烯醇结构的抗蛋白吸附共价键合涂层。由于毛细管内壁上的硅羟基与涂层间发生光固化交联反应而被屏蔽，所以该共价键合涂层具有优异的抗蛋白吸附性能。图6所示为本实施例的毛细管对三种常见蛋白质1、溶菌酶，2、牛血清白蛋白，3、核糖核酸酶A。
本实施例提供的一种新型的共价键合聚乙烯醇毛细管涂层的制备方法，通过感光性重氮基将具有抗蛋白吸附性能的聚乙烯醇(PVA)键合在毛细管内壁，从而形成有效而稳定的聚合物涂层应用于毛细管电泳分离蛋白质。从图6可知，本实施例可以在短短的18min内实现分离，三种蛋白质的电泳分离曲线的峰与峰之间的间隔较大，因此本发明提供的带有的聚乙烯醇重氮聚合物涂层的毛细管能够使这三种常见蛋白质分离的更彻底。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种聚乙烯醇重氮聚合物，其特征在于，其具有式(1)所示结构：
其中m为5-10的整数,n为8-15的整数。
2.一种聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
S1、合成氯代聚醋酸乙烯酯(PVAc-Cl)：
将单体醋酸乙烯酯(VAc)溶于第一有机溶剂中，引发剂及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入反应容器内，并在惰性气氛中于50-80℃回流条件下反应5-8h，再将产物洗涤，得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物氯代聚醋酸乙烯酯；
所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化苯甲酰或过氧化二苯甲酰中的一种或其中几种的混合物；
S2、合成聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯(P(VAc-b-St))：
将催化剂卤化亚铜、配体2,2-联吡啶(bpy)、苯乙烯单体(St)加入反应釜中，并在惰性气氛中于室温条件下搅拌均匀后，加入步骤S1制备的氯代聚醋酸乙烯酯，将混合物加热到125-135℃，恒温搅拌反应2-5h；待反应液冷却后，加入第二有机溶剂溶解粗产物，溶解后的溶液用色谱柱过滤以去除残留的铜离子，再将产物洗涤得淡黄色固体，真空干燥后得聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯；
S3合成聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St))：
将聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯溶解于第三有机溶剂中，并加入pH＝11-13的强碱型甲醇溶液，加热至60-80℃回流反应2-4h，水解产物用甲醇沉淀析出，过滤2-3次，在50-70℃条件下真空干燥，得到聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S4合成硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NO2)：
将聚乙烯醇-b-聚苯乙烯溶解于第三有机溶剂中，在0-3℃的冰水浴条件下缓慢滴加硝酸和浓硫酸的混合溶液；反应5-8h后，加入冷水和/或冰块至其溶解，高速离心，滤饼洗涤，于常温下真空干燥，得到硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S5合成氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯(P(VA-b-St)-NH2)：
将硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯、氯化亚锡加入到pH＝2-3的酸性甲醇溶液中，于室温条件下搅拌反应22-28h；高速离心，滤饼洗涤，真空干燥后得到氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯；
S6合成聚乙烯醇重氮聚合物：
将氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯和酸性溶液加入到反应釜中，冰水浴冷却至0-3℃后，滴加浓度为0.1-0.25mol·L-1的亚硝酸钠溶液，反应终点后再搅拌反应0.5-3h，即可生成聚乙二醇重氮聚合物。
3.根据权利要求1所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中单体醋酸乙烯酯与偶氮二异丁腈的摩尔比为1:0.001-1:0.003；所述的醋酸乙烯酯与四氯化碳的摩尔比为1:0.03-1:0.05。
4.根据权利要求1所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述氯代聚醋酸乙烯酯与氯化亚铜的摩尔比为1:1.0-1:2.5；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与2,2-联吡啶的摩尔比为1:3.0-1:5.0；所述的氯代聚醋酸乙烯酯与苯乙烯单体的摩尔比为1:4.0-1:8.0。
5.根据权利要求1所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述的聚醋酸乙烯酯-b-聚苯乙烯与氢氧化钠的甲醇溶液的摩尔比为1:2.5-1:5.0。
6.根据权利要求1所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，
所述步骤S4中所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与硝酸的摩尔比为1:1.5-1:3.0；所述的聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与浓硫酸的摩尔比为1:2-1:4.0；
所述步骤S5中所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与氯化亚锡的摩尔比为1:4.0-1:6.0；所述的硝基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与酸性甲醇溶液中的酸的摩尔比为1:2.5-1:5.0；
所述步骤S6中所述的氨基化聚乙烯醇-b-聚苯乙烯与酸性溶液的摩尔比为1:2.0-1:4.5；所述的端氨基苯基聚乙二醇与浓亚硝酸钠溶液的摩尔比为1:1.0-1:4.0。
7.根据权利要求1所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1为：
将单体醋酸乙烯酯(VAc)溶于第一有机溶剂中，引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、及链转移剂四氯化碳(CCl4)加入圆底烧瓶内，经通氮气、抽真空反复循环3次驱走空气，并于50℃-80℃回流条件下反应5-8h，再将产物经甲醇溶解，水沉淀，反复2-3次，至得到淡黄色固体，真空干燥至恒重，得产物大分子引发剂氯代聚醋酸乙烯酯；所述第一有机溶剂为丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)。
8.根据权利要求1所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述的第二有机溶剂为四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中的一种或其中几种的组合物；
所述步骤S2中的卤化亚铜为氯化亚铜(CuCl)和/或溴化亚铜；
所述的步骤S3中强碱甲醇溶液为氢氧化钾水溶液和/或氢氧化钠水溶液与甲醇的混合物；
所述的步骤S3和S4中的第三有机溶剂为四氢呋喃(THF)、二氯甲烷，三氯甲烷中的一种或其中几种的组合物；
所述的步骤S6中酸性甲醇溶液为盐酸水溶液和/或磷酸水溶液与甲醇的混合物。
9.根据权利要求1所述的聚乙烯醇重氮聚合物的制备方法，其特征在于，
所述的步骤S1的洗涤条件为：将产物经甲醇溶解后，再采用水沉淀，反复2-3次；
所述的步骤S2的洗涤条件为：将产物用正己烷沉淀，抽滤后，滤饼重新沉淀抽滤2-3次。
10.一种毛细管内壁涂层的制备方法，包括下述步骤：
将浓度为4mg·ml-1-10mg·ml-1的聚乙烯醇重氮聚合物溶液缓慢注入活化后的毛细管内，所述聚乙烯醇重氮聚合物溶液沿所述石英毛细管内壁生长完成自组装过程，经过紫外光照射后，聚乙烯醇重氮聚合物与毛细管内壁上的硅羟基发生光固化交联反应形成涂层，所述的紫外光光源波长在248nm-365nm，照射时间为10min-30min。
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