CN105566430A - 三萜皂苷类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,公开了三萜皂苷类化合物及其制备方法和用途,所述三萜皂苷类化合物为:6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-17α(H)-20(22)(E)–烯-3β,6α,12β,24S,25-五醇,其结构式为:本发明采用质谱和一维、二维核磁共振波谱技术,以及化学方法确定三萜皂苷类化合物的化学结构。经过体外抗肿瘤活性试验,表明具有明显的抗肿瘤活性,为制备抗肿瘤药物提供了新的来源。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,特别涉及三萜皂苷类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
三七Panaxnotoginseng为五加科植物三七的干燥根及根茎,别名山漆、金不换、田漆、田三七、田七、参三七、血参、人参三七、滇三七等,主产于我国云南、广西等地。本品性温,味甘、微苦,无毒。三七生品能消肿止痛,散瘀止血,熟品能补血活血。三七用于治疗疾病已有悠久的历史,为我国常用的传统名贵药材之一。数千年来为中华民族的繁荣作出了巨大的贡献,并深受世界人民的关注与重视。
如今现代科学技术飞速发展,导致了传统中医药理论的研究手段相对落后,从而与现代科学理论相脱节,使三七的药效资源开发较局限。皂苷作为三七的主要药效物质成分,往往很难以初级皂苷形式直接被人体吸收,而是要经过人体代谢成次级皂苷尤其是稀有人参皂苷,才能被吸收进入血液,发挥药效作用。
生物转化手段具有反应较快、专属性较强、副反应较少的特点,利用了微生物体内复杂的酶系促使三七中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变,获得活性更好、毒性更小、药用价值更大的先导化合物,用于新药开发,从而更好地发挥三七药材资源优势,对开发具有自主知识产权的新药具有了十分重要的研究意义和社会效益。
三七作为我国传统名贵中药材,同人参一样作为早期的药食同源植物,素有“参中之王”的美誉。具有多种药效物质成分及较强的药理作用,已被广泛开发成多种产品用于临床疾病的治疗。但是同时,三七作为一种传统的中草药,其中多种成分的用途都没有被开发利用。三七皂苷为其主要的活性成分,但依据人参皂苷在体内的代谢规律及其构效关系可知,“人参皂苷”是通过胃肠道吸收后被肠道菌逐级代谢为次级皂苷及苷元吸收进入血液循环后发挥药理作用的,表明,天然人参皂苷结构并不是结构最佳状态。综上所述,如何通过合理的结构修饰手段,将三七中原有的含量较高的人参皂苷进行结构修饰转化成低糖链或新的侧链结构的稀有人参皂苷成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明为解决上述问题,提供了三萜皂苷类化合物及其制备方法和用途。
本发明的首要目的在于提供一种新的三萜皂苷类化合物。
本发明的另一目的是提供化合物作为制备抗肿瘤药物的用途。
本发明的再一目的是解决现有技术中所存在的问题,提供一种上述三萜皂苷类化合物的制备方法。
为解决上述问题,本发明采取如下技术方案:
三萜皂苷类化合物,所述三萜皂苷类化合物的结构式为:
所述三萜皂苷类化合物为:6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-17α(H)-20(22)(E)–烯-3β,6α,12β,24S,25-五醇。
进一步的,所述的三萜皂苷类化合物是从三七转化产物中提取得到的。
一种上述的三萜皂苷类化合物的制备方法,具体步骤如下:
步骤一:三七转化产物的制备:
A种子液制备:
取灵芝种子培养液液体培养基于压力蒸汽灭菌器中于121℃灭菌处理30分钟,冷却后在无菌操作台中接入斜面菌种,于恒温振荡培养箱中于27~29℃,160转/分钟下培养,得澄清星芒状菌球,即得种子液备用;
B转化产物的制备:
取三七药材粉末,加入碳酸钙生长因子和水,混匀,密封并灭菌,于室温下冷却,在无菌操作台内接入所述步骤A制备的所述种子液,避光培养,至容器底部布满菌丝体为止,取出干燥,即得三七转化产物;
步骤二:提取:
取所述步骤B制备的所述三七转化产物,加入4~8倍重量份的70%的乙醇,回流提取3-5次,每次1~3小时,过滤并合并提取液,压缩得稠膏;将所述稠膏加水分散,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液萃取,共萃取6~8次,后对萃取液分别减压干燥,得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水饱和正丁醇部分;
步骤三:分离纯化:
取所述步骤二制备的所述乙酸乙酯部分上硅胶柱色谱,以体积比100:0~0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱,薄层色谱检识,收集二氯甲烷-甲醇100:10部分的洗脱液,合并含所述三萜皂苷类化合物的流分为157~165的洗脱液,回收溶剂至干,所得物再经反相RP-C18柱层析,以体积比100:50的甲醇-水混合溶剂洗脱,减压回收溶剂至干,得到含有所述三萜皂苷类化合物粗品,再经半制备型高效液相色谱分离纯化,用58%甲醇-水洗脱,得到所述三萜皂苷类化合物纯品。
进一步的,三萜皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,所述灵芝种子培养液液体培养基包括以下重量百分数的组分:葡萄糖为1%~4%,蛋白胨为0.2%~1%,酵母粉为0.1%~0.3%,磷酸二氢钾为0.1%~0.3%,硫酸镁为0.1%,水为95%~99%。
进一步的,所述灵芝种子培养液液体培养基包括以下重量百分数的组分为:葡萄糖为2%,蛋白胨为0.5%,酵母粉为0.2%,磷酸二氢钾为0.1%,硫酸镁为0.1%,水为97.1%。
进一步的,所述步骤B中:所述三七药材粉末过10目筛;加入的所述碳酸钙生长因子的重量为所述三七药材粉末重量的0.01倍量,加水量为所述三七药材粉末重量的1.5倍;混均后的所述三七药材粉末中含水量为60%。
进一步的,所述步骤B中:灭菌条件为:于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌处理1小时;避光培养条件为:29~31℃,65%RH。
进一步的,所述步骤B中,所述种子液与所述三七药材的重量比为:2:1。
上述的三萜类化合物的用途,所述三萜皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种抗肿瘤药物,包含上述的三萜皂苷类化合物。
本发明的有益效果为:
(1)提供了一种新的三萜皂苷类化合物;更好地发挥三七药材资源优势,对开发具有自主知识产权的新药具有了十分重要的研究意义和社会效益。
(2)运用体外抗肿瘤活性筛选体系对此新的三萜皂苷类化合物进行活性评价,结果表明,所述的化合物具有较好的抗肿瘤作用。经过体外抗肿瘤活性试验,表明具有明显的抗肿瘤活性,为制备抗肿瘤药物提供了新的来源。
附图说明
图1是本发明所述三萜皂苷类化合物的1H-NMR谱图;
图2是本发明所述三萜皂苷类化合物的13C-NMR谱图;
图3是本发明所述三萜皂苷类化合物的HMQC谱图;
图4是本发明所述三萜皂苷类化合物的HMBC谱图;
图5是本发明所述三萜皂苷类化合物的GC色谱图(D-Glu);
图6是本发明所述三萜皂苷类化合物的GC色谱图(Sample)。
具体实施方式
下文将结合具体实施例详细描述本发明内容。应当注意的是,下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的,它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1:
一、本发明涉及的一种三萜皂苷类化合物结构式如下:
其化学名称为:所述三萜皂苷类化合物是从三七转化产物中首次分离得到的新化合物,命名为人参皂苷:6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-17α(H)-20(22)(E)–烯-3β,6α,12β,24S,25-五醇。本发明三萜皂苷类化合物的命名为人参皂苷ST-7。
本发明所述三萜皂苷类化合物物理化学常数如下:
白色粉末(甲醇),ESI-MS:m/z677.42([M+K]+),结合氢谱与碳谱推测其分子式为C36H62O9。10%硫酸乙醇溶液显紫红色,Molish反应阳性,Liebermann-Burchard反应阳性。1H和13C-NMR数据见表1。
表1化合物的1H-NMR、13C-NMR数据归属信息
经体外抗肿瘤活性试验,化合物能显著抑制人宫颈癌细胞的扩增,且呈现剂量依赖关系,表明具有明显的抗肿瘤活性。因此,可用于制备新的抗肿瘤药物。
二、制备本发明三萜皂苷类化合物:
步骤一:三七转化产物的制备
A种子液的制备
按照微生物细菌生长优选的营养型培养基包括以下重量百分数的组分:葡萄糖2%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.2%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.1%,pH自然的条件配制灵芝种子液液体培养基。每100ml液体培养基分装于250ml倒三角瓶中,包扎后置于压力蒸汽灭菌器中于121℃灭菌处理30分钟。取出冷却后,在无菌操作台中接入保存好的斜面菌种。将接有斜面菌种的液体培养基放于恒温振荡培养箱中于27~29℃,160转/分钟下培养至容器中充满大量澄清星芒状菌球备用。
B转化产物的制备
取干燥的三七药材,适度粉碎,过10目筛,得到三七药材粉末,按照药材生长因子S/S的比例加入碳酸钙生长因子,加入适量水混合均匀,加水量为所述三七药材粉末重量的1.5倍;使混合后的三七药材粉末中含水量达到60%。取混合后的三七药材粉末每50g分装于500ml的倒三角瓶中,擦拭瓶口,用棉塞封住瓶口,用牛皮纸包扎,标注日期、操作者。置于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌处理1小时。待灭菌结束后,于室温下冷却,在无菌操作台内接入种子液,于29~31℃,65%RH条件下避光培养,至容器底部布满菌丝体为止,取出干燥,即得三七转化产物。
步骤二:提取
取三七转化产物干品5.0kg,加入4~8倍量70%的乙醇加热回流提取3-5次,每次1~3小时,过滤,合并提取液,减压浓缩得稠膏。将稠膏用适量水混悬分散,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液萃取6~8次,优选地萃取6次,萃取液分别减压干燥得石油醚部分14g,乙酸乙酯部分50g,水饱和正丁醇部分400g。
步骤三:分离纯化
取乙酸乙酯部分干膏45g上硅胶柱层析色谱,以体积比100:0~0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱,薄层色谱检识,收集二氯甲烷-甲醇100:10部分洗脱液,合并含所述三萜皂苷类化合物流分157~流分165的洗脱液,回收溶剂至干,所得物再经反相RP-C18柱层析,以体积比100:50的甲醇-水混合溶剂洗脱,减压回收溶剂至干,得到含有所述三萜皂苷类化合物粗品,再经半制备型高效液相色谱分离纯化,用58%甲醇-水洗脱,得到所述三萜皂苷类化合物纯品8.0mg。
所得新化合物物理化学常数如下:
白色粉末(甲醇),ESI-MS:m/z689.4039[M+Cl]-,结合氢谱与碳谱推测其分子式为C36H62O10。10%硫酸乙醇溶液显紫红色,Molish反应阳性,Liebermann-Burchard反应阳性。
D鉴定:采用化学方法,气相色谱分析及波谱学等方法进行结构鉴定。
1.0mol/L盐酸水解,加入L-半胱氨酸甲酯盐酸及1-三甲基硅烷基-1H-咪唑得到葡萄糖衍生物,经正己烷萃取后,采用GC色谱分析,结果如图5和图6所示可知,检出β-D-葡萄糖。
如图1所示可知,根据1H-NMR(CD3OD,500MHz)高场区给出7个甲基单峰信号,给出一个糖的端基质子信号。
如图2所示可知,根据13C-NMR(CD3OD,125MHz)谱中给出36个碳原子信号,高场区给出7个甲基单峰信号,低场区给出一对烯烃信号和一个羰基碳信号,中场区给出一组葡萄糖信号。
如图3和图4所示可知,通过解析化合物的HMQC谱及HMBC谱可知一分子葡萄糖与C-6位成苷,同时给出化合物的侧链连接关系。
化合物的1H-NMR、13C-NMR数据归属见上表1所示。
实施例2:本发明化合物抗肿瘤活性试验
一、试验材料
1、体外试验瘤株:
Helas人宫颈癌细胞,由长春中医药大学研发中心药理实验室提供。
2、体外试验用试剂:
新生牛血清,二甲基亚枫(DMSO)及MTT四哇盐(Sigma公司)。
3、体外试验用仪器:
酶标仪MultiskanAscent型号VL.23354-00541T。
二、试验方法
MTT液的配制:取250mgMTT,放入小烧杯中,加入50m1PBS(pH7.4,0.01M),搅拌30min,配制成浓度为5mg/ml溶液,用0.22um的微孔滤器滤菌,分装,4℃保存,两周内有效。
取对数生长期的肿瘤细胞,加入适量0.25%胰蛋白酶,使贴壁细胞脱落,作细胞计数,一般不着色的活细胞应在97%以上,配成6×104/ml细胞悬液。取96孔平板,每孔加细胞悬液100u1,将平板置37℃5%CO2温箱24h。孵育24h后,于96孔板加入100ul/孔不同浓度的待测化合物溶液。于96孔板每孔加入20ulMTT液,继续孵育4h,终止培养。小心吸取上清液,每孔加入150u1DMSO溶液,震荡溶解,用自动化分光光度平板读数计在570nm处测定每个小孔的光密度值。
试验结果表明,本发明提取的三萜皂苷类化合物,即人参皂苷ST-7对Helas人宫颈癌细胞具有一定的杀伤作用,结果见表2所示。
表2人参皂苷ST-7对Helas人宫颈癌细胞的影响。
本发明提供了一种新的三萜皂苷类化合物;三萜皂苷类化合物的制备方法和用途,并运用体外抗肿瘤活性筛选体系对此新的三萜皂苷类化合物进行活性评价,结果表明,所述的化合物具有较好的抗肿瘤作用。经过体外抗肿瘤活性试验,表明具有明显的抗肿瘤活性,为制备抗肿瘤药物提供了新的来源。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例,但是本领域的技术人员应当理解,在不脱离本发明精神的情况下,可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的,不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (10)
1.三萜皂苷类化合物,其特征在于,所述三萜皂苷类化合物的结构式为:
所述三萜皂苷类化合物为:6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-17α(H)-20(22)(E)–烯-3β,6α,12β,24S,25-五醇。
2.如权利要求1所述的三萜皂苷类化合物,其特征在于,所述的三萜皂苷类化合物是从三七转化产物中提取得到的。
3.一种如权利要求1所述的三萜皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
步骤一:三七转化产物的制备:
A种子液制备:
取灵芝种子培养液液体培养基于压力蒸汽灭菌器中于121℃灭菌处理30分钟,冷却后在无菌操作台中接入斜面菌种,于恒温振荡培养箱中于27~29℃,160转/分钟下培养,得澄清星芒状菌球,即得种子液备用;
B转化产物的制备:
取三七药材粉末,加入碳酸钙生长因子和水,混匀,密封并灭菌,于室温下冷却,在无菌操作台内接入所述步骤A制备的所述种子液,避光培养,至容器底部布满菌丝体为止,取出干燥,即得三七转化产物;
步骤二:提取:
取所述步骤B制备的所述三七转化产物,加入4~8倍重量份的70%的乙醇,回流提取3-5次,每次1~3小时,过滤并合并提取液,压缩得稠膏;将所述稠膏加水分散,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液萃取,共萃取6~8次,后对萃取液分别减压干燥,得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水饱和正丁醇部分;
步骤三:分离纯化:
取所述步骤二制备的所述乙酸乙酯部分上硅胶柱色谱,以体积比100:0~0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱,薄层色谱检识,收集二氯甲烷-甲醇100:10部分的洗脱液,合并含所述三萜皂苷类化合物的流分为157~165的洗脱液,回收溶剂至干,所得物再经反相RP-C18柱层析,以体积比100:50的甲醇-水混合溶剂洗脱,减压回收溶剂至干,得到含有所述三萜皂苷类化合物粗品,再经半制备型高效液相色谱分离纯化,用58%甲醇-水洗脱,得到所述三萜皂苷类化合物纯品。
4.如权利要求3所述的三萜皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,所述灵芝种子培养液液体培养基包括以下重量百分数的组分为:葡萄糖为1%~4%,蛋白胨为0.2%~1%,酵母粉为0.1%~0.3%,磷酸二氢钾为0.1%~0.3%,硫酸镁为0.1%,水为95%~99%。
5.如权利要求4所述的三萜皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,所述灵芝种子培养液液体培养基包括以下重量百分数的组分为:葡萄糖为2%,蛋白胨为0.5%,酵母粉为0.2%,磷酸二氢钾为0.1%,硫酸镁为0.1%,水为97.1%。
6.如权利要求5所述的三萜皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,所述步骤B中:所述三七药材粉末过10目筛;加入的所述碳酸钙生长因子的重量为所述三七药材粉末重量的0.01倍量,加水量为所述三七药材粉末重量的1.5倍;混均后的所述三七药材粉末中含水量为60%。
7.如权利要求6所述的三萜皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,所述步骤B中:灭菌条件为:于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌处理1小时;避光培养条件为:29~31℃,65%RH。
8.如权利要求7所述的三萜皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,所述步骤B中,种子液与三七药材的重量比为:2:1。
9.如权利要求1所述的三萜类化合物的用途,其特征在于,所述三萜皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种抗肿瘤药物,其特征在于,包含权利要求1所述的三萜皂苷类化合物。
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