CN105555955A - 成骨细胞和制备成骨细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从哺乳动物的体细胞制备成骨细胞的方法以及通过所述方法制备的成骨细胞，所述方法包括向体细胞中导入骨相关基因或骨相关基因的表达产物以及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，或者独立地向体细胞中导入重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，所述骨相关基因包括选自Runx2(R)、Osterix(O)和Dlx5(D)中的至少一种，所述重编程相关基因包括选自Oct家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
Description
技术领域
本发明涉及成骨细胞和制备成骨细胞的方法,并且更具体地涉及通过直接重编程制备成骨细胞的方法.
发明背景
可以期望将成骨细胞移植至受累区域以修复由骨肿瘤、创伤、骨髓炎等导致的骨缺损或者骨肿瘤等的刮除术之后的骨缺损能够促进骨形成并改善功能和形态学预后。事实上，已经实施了通过收集自例如患者的松质骨的骨髓细胞的自体移植进行的治疗，并且治疗的效果是已知的。在此类情况下，通过自体骨髓细胞中包含的间充质干细胞的分化诱导获得的成骨细胞被认为有助于骨形成和骨重塑。同时，骨质疏松症患病率的增加与人口老龄化相一致，并且老年人骨折可能导致长期卧床。成骨细胞的移植被认为能够促进由骨质疏松症、创伤等导致的骨折，难治性骨折以及假骨折的治愈。此外，成骨细胞的移植也可以用于例如：类风湿性关节炎、特发性股骨头坏死、变形性关节病、变形性腰椎关节强硬(lumbarspondylosisdeformans)、椎管狭窄症、椎间盘突出、脊椎滑脱、崩裂性脊柱滑脱、脊柱侧凸、脊髓型颈椎病、后纵韧带骨化、脊髓损伤、髋关节病、膝关节病、股骨头骨骺滑脱、骨软化症、术后骨修复(如心脏手术之后的胸骨修复)、与人工踝关节手术相关的缺损修复、骨髓炎以及骨坏死。
另一方面，牙周病可被称作第四生活方式相关疾病，在人群中发病率很高，并且引起各种全身性疾病。随着牙周病的进展，发生牙槽骨的骨吸收。因此，当高效地向局部骨吸收部位提供成骨细胞时，可以再生并治疗牙槽骨。
当将成骨细胞的移植与骨移植、人工骨移植、人工关节和埋植剂组合时，可以增强治疗效果。
迄今为止已经将骨髓间充质干细胞、包括骨髓间充质干细胞的骨髓细胞等用作此类成骨细胞用于移植。然而，骨髓的收集存在问题。例如，收集对于患者具有高度侵害性，并且在一些情况下不能提供足量的骨髓细胞。另一方面，使用人胚胎干细胞(ES细胞)不需要从患者身上收集骨髓，并且可以提供足量的成骨细胞，但是除伦理问题外，可能会引起移植之后剩余的ES细胞的肿瘤发生的风险。此外，使用iPS细胞不需要从患者身上收集骨髓，并且可以提供足量的成骨细胞，但是可能会引起移植之后剩余的iPS细胞的肿瘤发生的风险。
在非专利文献1中，公开了向人ES细胞中导入包括Osterix的慢病毒载体，以及在成骨细胞培养基中分化诱导为成骨细胞。
在非专利文献2和非专利文献3中，公开了通过在成骨细胞培养基中分化诱导将小鼠iPS细胞转化为MSC来制备成骨细胞。
在非专利文献4中，公开了通过向小鼠iPS细胞中导入包括Runx2的腺病毒载体并在成骨细胞培养基中将细胞进行分化诱导来制备成骨细胞。
如在非专利文献1至非专利文献4中公开的，通过分化诱导从多能干细胞如ES细胞和iPS细胞制备成骨细胞，因此该方法需要长期培养并存在致癌作用的风险。
例如，基于当将组织特异的转录因子的基因群组导入体细胞时，可以在不转变为iPS细胞的情况下实现直接分化诱导为组织细胞(直接重编程(直接转化))这一事实，已经做出了下述报导：
小鼠成纤维细胞→软骨细胞(导入SOX9+Klf4+c-Myc基因)，
小鼠成纤维细胞→心肌细胞(导入GATA4+Mef2c+Tbx5基因)，
小鼠成纤维细胞→肝细胞(导入Hnf4α+(Foxa1、Foxa2或Foxa3)基因)，
小鼠成纤维细胞→神经干细胞(导入例如Sox2+FoxG1基因)和小鼠细胞或人细胞→造血干细胞。
然而，没有体细胞直接转化为成骨细胞的报导。
引用列表
非专利文献
[NPL1]KarnerEetal.JCellPhysiol.2009.
[NPL2]LiFetal.JCellBiochem.2010.
[NPL3]BiloussovaGetal.Stemcells.2011.
[NPL4]TashiroKetal.Stemcells.2009.
发明概述
技术问题
本发明的目标是提供制备成骨细胞的方法，所述成骨细胞适用于修复由各种肿瘤、损伤、手术等导致的骨缺损以及治疗以牙周病、骨折、骨质疏松症等为典型的骨吸收，并且具有较低的致癌作用风险。
解决方案
本发明的发明人发现在不转化为多能干细胞，如ES细胞和iPS细胞的情况下，可以通过向哺乳动物的体细胞中导入组合的特异性基因直接获得成骨细胞(直接重编程)。
根据本发明的实施方案，提供了下述成骨细胞及其制备方法。
项1.从哺乳动物的体细胞制备成骨细胞的方法，所述方法包括向体细胞中导入重编程相关基因或其表达产物，所述重编程相关基因包括选自Oct家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28以及Sox2中的至少一种。
项2.从哺乳动物的体细胞制备成骨细胞的方法，所述方法包括向体细胞中导入骨相关基因或骨相关基因的表达产物以及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，所述骨相关基因包括选自Runx2(R)、Osterix(O)和Dlx5(D)的至少一种，所述重编程相关基因包括选自Oct家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
项3.如项1或项2所述的方法，其中所述体细胞包括成纤维细胞或牙龈细胞。
项4.如项1至3中任一项所述的方法，其中所述重编程相关基因或其表达产物包括Oct4。
项5.如项4所述的制备成骨细胞的方法，其中待被导入所述体细胞的重编程相关基因或其表达产物包括Oct4、Oct4L、Oct4M、Oct4LM、Oct4LGlis1和Oct4LMGlis1之一，其中M代表“c-Myc”，以及L代表“L-Myc”。.
项6.如项1至3中任一项所述的方法，其中待被导入体细胞的骨相关基因或骨相关基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述的一种组合：Oct4、Oct4LMGlis1、RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML、DOct4ML、RODOct4M、ODOct4L、OOct4ML、OOct4L、OOct4M、ODOct4、DOct4L、Oct4ML、RODOct4ML、RDOct4ML、ODOct4ML、OOct4MLGlis1、RDOct4M、ROct4LGlis1、ROct4ML、ODOct4M、OOct4LGlis1、RODOct4、ROOct4M、ROOct4L、ROOct4、OOct4Glis1、RDOct4、Oct4LGlis1、DOct4M、DOct4Glis1、OOct4、Oct4L、Oct4M、DOct4、ROOct4K、ROOct4Sox2、以及ROOct4Lin28，其中R代表“Runx2”，O代表“Osterix”，D代表“Dlx5”，M代表“c-Myc”以及L代表“L-Myc”。
项7.如项1至3中任一项所述的方法，其中待被导入体细胞的骨相关基因或骨相关基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述的一种组合：RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML、DOct4ML、RODOct4M、ODOct4L、OOct4ML、OOct4L、OOct4M、ODOct4、DOct4L以及Oct4ML，其中R代表“Runx2”，O代表“Osterix”，D代表“Dlx5”，M代表“c-Myc”，以及L代表“L-Myc”。
项8.如项2或3所述的方法，其中待被导入体细胞的骨相关基因或骨相关基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述的一种组合：RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML和DOct4ML。
项9.成骨细胞，其来源于哺乳动物的体细胞，并且其包括重编程相关基因或其表达产物，所述重编程相关基因包括选自Oct4、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
项10.成骨细胞，其来源于哺乳动物的体细胞，并且其包括骨相关基因或骨相关基因的表达产物以及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，所述骨相关基因包括选自Runx2(R)、Osterix(O)和Dlx5(D)中的至少一种，所述重编程相关基因包括选自Oct4、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
本发明涉及通过导入重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，或者骨相关基因或骨相关基因的表达产物以及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，从体细胞制备成骨细胞的技术。可将选自Runx2(R)、Osterix(O)和Dlx5(D)的至少一种作为那些基因中的骨相关基因。所述基因可取地包括Oxterix和Dlx5中的至少一种。此外，可将选自下述基因的至少一种选择作为重编程相关基因：Oct4家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、Glis家族、Klf家族(KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17)、Lin-28以及Sox2。所述重编程相关基因可取地包括Oct4家族中的至少一种，更可取地包括Oct4家族和L-Myc和/或c-Myc中的至少一种。在Oct4家族中，Oct4是可取的。因此，所述重编程相关基因最可取地包括Oct4和L-Myc和/或c-Myc。
可以以与如上文所述相同的方式使用Oct家族的其它基因来代替Oct4。通常，Oct4可以表示为Oct3/4，但是在本说明中将其表示为“Oct4”。在该说明中，虽然“Oct4”被用于描述为Oct家族的代表，但是也可以以与Oct4相同的方式使用Oct家族的其它基因(Oct1A和Oct6)。
Oct4是用于通过与Sox2、Klf4和c-Myc一起基因导入体细胞而重编程体细胞以诱导专能性的因子(TakahashiK,YamanakaS.Cell,126(4):663-76,2006；TakahashiK,TanabeK,OhnukiM,NaritaM,IchisakaT,TomodaK,YamanakaS.Cell.131(5):861-72,2007)。已知将GATA3、GATA6、SOX7、PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a、GRB2等中的任何一种而非Oct4与Sox2、Klf4和c-Myc一起基因导入体细胞能够重编程体细胞以诱导专能性(Shuetal.Cell153:963,2013)。在本发明中也可以使用既非重编程因子又不属于Oct家族但是可以具有可替代重编程中的Oct的功能的因子来代替Oct4，所述因子如GATA3、GATA6、SOX7、PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a和GRB2。换言之，在该说明中，术语“Oct4”被用于描述为能够具有重编程中的Oct4的功能的代表性因子，但是也可以以与Oct4相同的方式使用具有可替代重编程中的Oct的功能的因子，如：GATA3、GATA6、SOX7、PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a和GRB2。
也可以用Klf家族的任何其它基因(KLF1、KLF2、KLF3、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16或KLF17)来替代KLF-4。在该说明中，术语“KLF-4”被用于描述为Klf家族的代表，但是也可以以与KLF-4相同的方式使用Klf家族的其它基因。
作为GLIS家族，给出了GLIS1(GLIS家族锌指1)等。
作为可以具有可替代体细胞的重编程(iPS细胞的诱导)中的KLF-4的功能的基因，已知的不仅有KLF家族的基因，还有例如IRX家族的成员(如IRX6(易洛魁(iroquois)同源框蛋白6))、PTX家族成员(如PITX2(成对样同源结构域转录因子2))以及DMRTB1(具有富含脯氨酸的C末端1的DMRT样家族B)(WO2010/098419(2010年9月2日))。在该说明中，术语“KLF-4”被用于描述，但是可以以与KLF-4相同的方式使用可具有可替代在体细胞的重编程(iPS细胞的诱导)中的KLF-4的功能的基因。也可以使用那些基因的产物，即mRNA。
可以以与SOX2相同的方式使用SOX家族的其它基因来代替SOX2。在该说明中，术语“SOX2”被用于描述为SOX家族的代表，但是也可以以与SOX2相同的方式使用SOX家族的其它基因。
在本发明中，为方便起见，所有基因都被称作SOX2。
可将骨相关基因和重编程相关基因的表达产物用作代替骨相关基因和重编程相关基因中的一种或多种的替代物。此外，可以将能够诱导或模拟基因的分子试剂等用作代替骨相关基因和重编程相关基因中的一种或多种的替代物。作为可以具有可替代iPS细胞的诱导中的Oct4的功能的基因，已知的有，例如GATA3、GATA6、SOX7、PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a和GRB2(JianShuetal.,Cell153,963–975,2013)，因此可以使用此类化合物来代替导入Oct4基因。作为可以具有可替代神经前体细胞的重编程中的Oct4的功能的小分子化合物，BIX-01294是已知的(BoFengetal.,CellStemCell4:301,2009)，因此可以使用此类化合物来代替导入Oct4基因。作为可以具有可替代iPS细胞的诱导中的Klf-4的功能的化合物，kenpaullone是已知的(Lyssiotis,CA,etal.,ProcNatlAcadSciUSA.2009June2；106(22):8912–8917.)，因此可以使用此类化合物来代替导入Klf-4基因。在该说明中，为了方便起见，有时将基因和其表达产物统称为“基因”。在此类情况下，术语“导入基因”被术语“添加分子”、“添加药物”、“添加化合物”、“施用分子”、“施用药物”、“施用化合物”等替代。
还可以向本发明的基因组合中添加其它基因。
本发明包括从体细胞诱导成骨细胞的方法。本发明还包括通过所述方法制备的成骨细胞。本发明还包括用于治疗的细胞制备物，其包括成骨细胞或包含成骨细胞的移植材料。
当将该技术应用于体内的体细胞时，可以在体内直接产生成骨细胞。本发明还包括该方法和用于直接诱导的制备物。
发明的有益效果
根据本发明的实施方案，可以通过直接重编程在短期内由体细胞提供成骨细胞。可以由待移植的个体的体细胞容易地诱导成骨细胞。因此，即使当移植成骨细胞自身或由细胞制备的骨组织时，也不会发生如免疫排斥反应的问题。此外，在不转化为iPS细胞或ES细胞的情况下，可以由体细胞直接诱导成骨细胞，因此可以避免由多能干细胞导致的如致癌作用的问题。
附图简要说明
图1为编码目的基因的pMXs载体的制备的图示。
图2为实验提纲的图示。
图3A为茜素红S染色的结果。图3A为皿的肉眼图(macrograph)。钙化的骨基质被染成红色，这表明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字“1”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染)。
图3B为茜素红S染色的结果。图3B为皿的肉眼图。钙化的骨基质被染成红色，这表明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字“1”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染)。
图3C为茜素红S染色的结果。图3C为皿的肉眼图。钙化的骨基质被染成红色，这表明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字“1”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染)。
图3D为茜素红S染色的结果。图3D为皿的肉眼图。钙化的骨基质被染成红色，这表明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字“1”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染)。
图3E为茜素红S染色的结果。图3E为皿的肉眼图。钙化的骨基质被染成红色，这表明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字“1”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染)。
图3F为茜素红S染色的结果。图3F为皿的肉眼图。钙化的骨基质被染成红色，这表明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字“1”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染)。
图3G为96孔板的肉眼图(对于孔的数量参见图3H)。
图3H为利用酶标仪得到的反应溶液的吸光度(550nm至650nm)的测量结果。该图的纵轴表示吸光度，以及该图显示，随着吸光度变高，产生的钙化的骨基质的量增加，即转化为功能性成骨细胞的成纤维细胞的量增加。
图3I为通过与图3H中所示的相同的实验，利用酶标仪得到的反应溶液的吸光度(490nm至650nm)的测量结果。表中的数字“1”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染。例如，该图显示第27个孔包含这样的细胞：其被含有Osterix、Runx2、Oct4、L-Myc和Dlx5基因的逆转录病毒载体感染，且未被含有c-Myc、Glis1和EGFP基因的逆转录病毒载体，并且产生了大量钙化的骨基质感染。
图4为ALP活性测试的结果。
图5为ALP染色的图像。
图6为免疫染色的结果。(a)对照，(b)ROOct4M，(c)ROOct4L：×100。
图7为茜素红S染色的结果。(a)对照，(b)ROOct4M，(c)ROOct4L：×1，(d)对照，(e)ROOct4M，(f)ROOct4L：×40。
图8为冯库萨(vonKossa)染色的结果。
图9为三维培养实验的提纲的图示。
图10为三维培养的吉姆萨染色的结果。(a)背景，(b)ROOct4L：×1。
图11为三维培养的茜素红S染色的结果。(a)背景，(b)对照，(c)ROOct4M，(d)ROOct4L：×1。
图12为ALP染色的图像(aHDF)。(a)对照，(b)ROOct4G，(c)ROOct4L：×1，(d)对照，(e)ROOct4G，(f)ROOct4L：×40。
图13a为茜素红S染色的结果(aHDF)。
图13b包括ALP染色的图像和冯库萨染色的图像。
图14为茜素红S染色的结果。
图15为显示通过直接重编程诱导的人成骨细胞的特性的图。
图16为通过直接重编程诱导的人成骨细胞的分析结果。
图17为通过实时RT-PCR分析定量基因表达水平的结果。
图18为位于骨缺损部位的体内骨再生的结果。a：微型CT(连续断层扫描图像)，b：组织学图像(连续切片)，c：荧光免疫组织化学(抗人抗体)。
图19为显示位于骨缺损部位的体内骨再生的图(机械强度)。
图20为位于骨缺损部位的体内骨再生的结果。
图21为通过图18a中所示的微型计算机断层扫描(μCT)的数据的三维重建获得的图像。
图22为通过与图18中示出的相同实验获得的μCT透射图像。箭头表示骨缺损部位。与移植有人牙龈成纤维细胞的骨相比，移植有通过直接重编程诱导的成骨细胞(dOB)的骨在骨缺损部位具有较高的射线不透性。
图23为用于RT-PCR的引物列表。
图24为用于测序的引物列表。
图25为用于实时RT-PCR的引物列表。
图26为利用附加型载体直接重编程为成骨细胞的图示。
图27为直接重编程为小鼠成骨细胞的结果。
图28a为通过实时RT-PCR获得的骨桥蛋白(□)和骨钙蛋白(■)的mRNA表达水平的测量结果，并且将导入的各基因表示为“+”。
图28b为通过实时RT-PCR获得的骨钙蛋白(■)和APL(□)的mRNA表达水平的测量结果，并且将导入的各基因表示为“+”。
图28c为冯库萨染色的结果。将导入的各基因表示为“+”。
图29a为通过实时RT-PCR获得的基因的mRNA表达水平的测量结果。
图29b为用于测序的引物列表。
图30为通过直接重编程由人成纤维细胞诱导的成骨细胞的详尽的基因表达特征的结果。
图31为通过直接重编程诱导的人成骨细胞的分析结果。(a)免疫染色，(b)直接重编程的效率。
图32为显示在无多能干细胞样阶段的情况下，由直接转化引起的人成纤维细胞重编程为成骨细胞的结果。(a)免疫染色，(b)实时RT-PCR。
图33为核型分析的结果。
图34为显示不包含掺入的间充质干细胞(MSC)的人成纤维细胞的结果。
图35为通过直接重编程由人成纤维细胞诱导的人成骨细胞的染色结果。
图36为通过实时RT-PCR获得的基因的mRNA表达水平的测量结果。
图37为位于骨缺损部位的体内骨再生的结果。
图38为位于骨缺损部位的体内骨再生的结果。
图39a为显示利用质粒载体通过基因导入将人成纤维细胞重编程为成骨细胞的图示。
图39b为利用质粒载体通过基因导入将人成纤维细胞重编程为成骨细胞的结果。
图40a为显示利用质粒载体通过基因导入将人成纤维细胞重编程为成骨细胞的图示。
图40b为利用质粒载体通过基因导入将人成纤维细胞重编程为成骨细胞的结果。
图41为在不含外源蛋白的培养基中将人成纤维细胞重编程为成骨细胞的结果。
图42为显示在不含外源蛋白的培养基中，通过直接重编程由人成纤维细胞诱导的人成骨细胞在冻融之后的活力的结果。
实施方案说明
根据本发明，可以制备前成骨细胞、未成熟的成骨细胞、成熟的成骨细胞、骨细胞等。在该说明中，为了方便起见，将全部细胞都称作“成骨细胞”。
作为待用通过本发明获得的成骨细胞(移植材料)治疗的疾病，给出的有，例如由骨肿瘤、创伤、骨髓炎等导致的骨缺损，骨肿瘤等的刮除术之后的骨缺损，骨折，骨质疏松症，牙周病，牙槽骨吸收，类风湿性关节炎，特发性股骨头坏死，变形性关节病，腰椎变形性椎关节强硬，椎管狭窄症，椎间盘突出，脊椎滑脱，崩裂性脊柱滑脱，脊柱侧凸，脊髓型颈椎病，后纵韧带骨化，脊髓损伤，髋关节病，膝关节病，股骨头骨骺，骨软化症，由复杂性骨折所损坏的骨折部位的重建如下颌重建、术后骨修复(心脏手术之后的胸骨修复)、与人工踝关节手术相关的缺损部位的修复，骨髓炎以及骨坏死。此外，当将成骨细胞与骨移植、人工骨移植以及人工关节或植入物的使用组合移植时，可以提高治疗效果。此外，当移植通过利用三维支架等培养成骨细胞(以具有不同的形状)而在体外制备的骨组织时，可以治疗以上所提及的疾病。除所述疾病之外，也靶向涉及成骨细胞功能的丧失、缺乏或下降的各种疾病。
在该说明中，除非另有说明，否则术语“治疗”指的是对患有特定疾病或病症的患者的治疗，并且意为治疗缓解了疾病或病症的严重性，缓解了疾病或病症的一种或多种症状，或者延迟或降低了疾病或病症的发展速度。在该说明中，“治疗”包括“预防”。
本发明中获得的成骨细胞不仅可以用于疾病的治疗，而且还可以用于美容。例如，当将成骨细胞或由成骨细胞形成的骨组织移植至由手术事故等导致的缺损部位时，细胞可以产生骨基质以修复缺损部位并通过三维修复掩盖缺损部位。在此类情况下，为了方便起见，在该说明中，针对人的治疗也被称作治疗。可用术语“健康对象”或“人”来替代术语“患者”，并且可用术语“美容”替代术语“疾病”。
本发明不仅还可用于人类疾病的治疗，也可用于哺乳动物的疾病的治疗，所述哺乳动物包括宠物如犬和猫，以及家畜如牛、马、猪、羊和鸡。在此类情况下，可用术语“家畜”或“哺乳动物”替代术语“患者”。
移植材料指待导入活体用于骨组织的修复和重建的含有成骨细胞的材料。移植材料包括在体外部分或完全再生骨组织并被移植进同一个体或其它个体的材料。可将本发明中获得的成骨细胞用于移植材料的制备。成骨细胞自身也可被用作移植材料。因此，成骨细胞可以作为细胞制备物移植至患者，可以与人工材料(如羟磷灰石或生物可吸收性陶瓷)形成的基质(支架)一起移植，或者可与支架共同培养，然后移植。在此类情况下，取决于移植目的，支架可以形成各种三维形状。
体细胞可以来源于哺乳动物。当将成骨细胞移植至活体时，优选使用来源于经受移植的测试对象的体细胞(自体细胞)以降低感染、排斥反应等的风险。然而，可将从其它人体或其它动物的体细胞代替自体细胞预先制备的成骨细胞用于例如突发性骨折等的移植。可选地，可以从预先准备的其它人体或其它动物的体细胞制备成骨细胞，并将其用于移植。换言之，可以预先制备成骨细胞库或成骨细胞前体细胞库，并将它们用于移植。在此类情况下，为了降低如排斥反应的风险，可以预先进行MHC分型。此外，可以预先确认成骨细胞的特性和致肿瘤性。
在该说明中，哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、仓鼠、人、犬、猫、猴子、兔子、牛、马和猪，特别是人。
本发明还可用于例如，利用成骨细胞的各种研究和技术开发。例如，本发明可用于基础研究，如分析骨生成、骨老化、形态发生、重塑机制、针对因素的机械应力，以及营养素、免疫、神经和激素的影响。本发明还可用于，例如放射性物质(如锶-90)的内照射对骨的影响分析，以及开发从骨中去除锶-90的技术。
本发明的使用允许以简单、快速且廉价的方式，从患有各种疾病或遗传背景的人或动物中建立成骨细胞。因此，可以通过生物化学、分子生物学或免疫学技术等来分析与疾病或遗传背景相关的成骨细胞的异常。这可以促进阐明疾病等的致病机制的研究或者诊断方法的发展。利用此类成骨细胞的药物、药物的毒性测试等的发展可以促进各种疾病的新型治疗方法的发展。
作为本发明方法(直接重编程)的对象的体细胞的实例包括但不具体限于：成纤维细胞、角化细胞、口腔粘膜上皮细胞、呼吸道粘膜上皮细胞、胃粘膜上皮细胞、肠粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、牙龈细胞(牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞)、牙髓细胞、牙周膜细胞、白细胞、淋巴细胞、肌细胞、结膜上皮细胞以及破骨细胞，优选成纤维细胞、角化细胞、口腔粘膜上皮细胞、牙龈细胞、白细胞、淋巴细胞和破骨细胞。
在本发明的方法中，向体细胞内导入至少一种重编程相关基因，或者至少一种骨相关基因或者其表达产物，以及至少一种重编程相关基因或其表达产物。在该说明中，作为“表达产物”，给出基因(如骨相关基因和重编程相关基因)的mRNA或蛋白。
骨相关基因为被导入以允许通过重编程获得的成骨细胞作为成骨细胞发挥作用的基因，并且具体而言，至少一种骨相关基因可以选自：Runx2(在下文中有时缩写为“R”)、Osterix(在下文中有时缩写为“O”)和Dlx5(在下文中有时缩写为“D”)。骨相关基因优选地包括Osterix和Dlx5中的至少一种。如果需要，将骨相关基因中的一种或两种或更多种或者它们的表达产物与其它骨相关基因或其表达产物的组合优选地导入体细胞。
重编程相关基因为被导入体细胞以将所述体细胞转化为成骨细胞的基因。重编程相关基因的实例包括：Oct4、Oct1A、Oct6、c-Myc(在下文中有时缩写为“M”)、L-myc(在下文中有时缩写为“L”)、N-myc、Klf家族(KLF1、KLF2、KLF3、KLF4(在下文中有时缩写为“K”)、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17)、Lin-28、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17以及Sox18。将这些基因中的一种或两种或更多种导入体细胞。可以仅通过导入重编程相关基因而将体细胞诱导为成骨细胞。不希望受理论的约束，本发明的发明人认为这是由于通过导入重编程相关基因促进了固有的骨相关基因的表达而引起的。
已知骨相关基因如Runx2、Osterix和Dlx5参与骨细胞的分化、发育、增殖、存活等。然而，用于从体细胞如成纤维细胞直接诱导成骨细胞(不转化为多能干细胞)的技术还未知。此外，已知重编程相关基因的组合可以由体细胞诱导iPS细胞，但是诱导成骨细胞是未知的。本发明的发明人已经建立了通过利用一种或多种骨相关基因与一种或多种重编程相关基因的组合或者一种或多种重编程相关基因，由体细胞(如成纤维细胞)直接诱导成骨细胞的技术。迄今为止，该技术还是未知的。此外，非常重要的是，重编程相关基因包括Oct4，但是利用Oct4直接诱导成骨细胞的技术是未知的。此外，利用Oct4和L-Myc直接诱导成骨细胞的技术还是未知的。
待被导入体细胞的骨相关基因与重编程相关基因的优选组合如下：ROct4ML、OOct4ML、DOct4ML、ROOct4ML、RDOct4ML、ODOct4ML、RODOct4ML、ROct4L、OOct4L、DOct4L、ROOct4L、RDOct4L、ODOct4L、RODOct4L、ROct4M、OOct4M、DOct4M、ROOct4M、RDOct4M、ODOct4M、RODOct4M、ROct4、OOct4、DOct4、ROOct4、RDOct4、ODOct4、RODOct4、ROct4MLK、OOct4MLK、DOct4MLK、ROOct4MLK、RDOct4MLK、ODOct4MLK、RODOct4MLK、ROct4LK、OOct4LK、DOct4LK、ROOct4LK、RDOct4LK、ODOct4LK、RODOct4LK、ROct4MK、OOct4MK、DOct4MK、ROOct4MK、RDOct4MK、ODOct4MK、RODOct4MK、ROct4K、OOct4K、DOct4K、ROOct4K、RDOct4K、ODOct4K、RODOct4K、ROct4MLSox2、OOct4MLSox2、DOct4MLSox2、ROOct4MLSox2、RDOct4MLSox2、ODOct4MLSox2、RODOct4MLSox2、ROct4LSox2、OOct4LSox2、DOct4LSox2、ROOct4LSox2、RDOct4LSox2、ODOct4LSox2、RODOct4LSox2、ROct4MSox2、OOct4MSox2、DOct4MSox2、ROOct4MSox2、RDOct4MSox2、ODOct4MSox2、RODOct4MSox2、ROct4Sox2、OOct4Sox2、DOct4Sox2、ROOct4Sox2、RDOct4Sox2、ODOct4Sox2、RODOct4Sox2、ROct4MLLin28、OOct4MLLin28、DOct4MLLin28、ROOct4MLLin28、RDOct4MLLin28、ODOct4MLLin28、RODOct4MLLin28、ROct4LLin28、OOct4LLin28、DOct4LLin28、ROOct4LLin28、RDOct4LLin28、ODOct4LLin28、RODOct4LLin28、ROct4MLin28、OOct4MLin28、DOct4MLin28、ROOct4MLin28、RDOct4MLin28、ODOct4MLin28、RODOct4MLin28、ROct4Lin28、OOct4Lin28、DOct4Lin28、ROOct4Lin28、RDOct4Lin28、ODOct4Lin28、RODOct4Lin28、ROct4MLKSox2、OOct4MLKSox2、DOct4MLKSox2、ROOct4MLKSox2、RDOct4MLKSox2、ODOct4MLKSox2、RODOct4MLKSox2、ROct4LKSox2、OOct4LKSox2、DOct4LKSox2、ROOct4LKSox2、RDOct4LKSox2、ODOct4LKSox2、RODOct4LKSox2、ROct4MKSox2、OOct4MKSox2、DOct4MKSox2、ROOct4MKSox2、RDOct4MKSox2、ODOct4MKSox2、RODOct4MKSox2、ROct4KSox2、OOct4KSox2、DOct4KSox2、ROOct4KSox2、RDOct4KSox2、ODOct4KSox2、RODOct4KSox2、ROct4MLKLin28、OOct4MLKLin28、DOct4MLKLin28、ROOct4MLKLin28、RDOct4MLKLin28、ODOct4MLKLin28、RODOct4MLKLin28、ROct4LKLin28、OOct4LKLin28、DOct4LKLin28、ROOct4LKLin28、RDOct4LKLin28、ODOct4LKLin28、RODOct4LKLin28、ROct4MKLin28、OOct4MKLin28、DOct4MKLin28、ROOct4MKLin28、RDOct4MKLin28、ODOct4MKLin28、RODOct4MKLin28
ROct4KLin28、OOct4KLin28、DOct4KLin28、ROOct4KLin28、RDOct4KLin28、ODOct4KLin28、RODOct4KSox2、ROct4MLSox2Lin28、OOct4MLSox2Lin28、DOct4MLSox2Lin28、ROOct4MLSox2Lin28、RDOct4MLSox2Lin28、ODOct4MLSox2Lin28、RODOct4MLSox2Lin28、ROct4LSox2Lin28、OOct4LSox2Lin28、DOct4LSox2Lin28、ROOct4LSox2Lin28、RDOct4LSox2Lin28、ODOct4LSox2Lin28、RODOct4LSox2Lin28、ROct4MSox2Lin28、OOct4MSox2Lin28、DOct4MSox2Lin28、ROOct4MSox2Lin28、RDOct4MSox2Lin28、ODOct4MSox2Lin28、RODOct4MSox2Lin28、ROct4Sox2Lin28、OOct4Sox2Lin28、DOct4Sox2Lin28、ROOct4Sox2Lin28、RDOct4Sox2Lin28、ODOct4Sox2Lin28、RODOct4Sox2Sox2、ROct4MLKSox2Lin28、OOct4MLKSox2Lin28、DOct4MLKSox2Lin28、ROOct4MLKSox2Lin28、RDOct4MLKSox2Lin28、ODOct4MLKSox2Lin28、RODOct4MLKSox2Lin28、ROct4LKSox2Lin28、OOct4LKSox2Lin28、DOct4LKSox2Lin28、ROOct4LKSox2Lin28、RDOct4LKSox2Lin28、ODOct4LKSox2Lin28、RODOct4LKSox2Lin28、ROct4MKSox2Lin28、OOct4MKSox2Lin28、DOct4MKSox2Lin28、ROOct4MKSox2Lin28、RDOct4MKSox2Lin28、ODOct4MKSox2Lin28、RODOct4MKSox2Lin28、ROct4KSox2Lin28、OOct4KSox2Lin28、DOct4KSox2Lin28、ROOct4KSox2Lin28、RDOct4KSox2Lin28、ODOct4KSox2Lin28、RODOct4KSox2Lin28
RML、OML、DML、ROML、RDML、ODML、RODML、RL、OL、DL、ROL、RDL、ODL、RODL、RM、OM、DM、ROM、RDM、ODM、RODM、RMLK、OMLK、DMLK、ROMLK、RDMLK、ODMLK、RODMLK、RLK、OLK、DLK、ROLK、RDLK、ODLK、RODLK、RMK、OMK、DMK、ROMK、RDMK、ODMK、RODMK、RK、OK、DK、ROK、RDK、ODK、RODK、RMLSox2、OMLSox2、DMLSox2、ROMLSox2、RDMLSox2、ODMLSox2、RODMLSox2、RLSox2、OLSox2、DLSox2、ROLSox2、RDLSox2、ODLSox2、RODLSox2、RMSox2、OMSox2、DMSox2、ROMSox2、RDMSox2、ODMSox2、RODMSox2、RSox2、OSox2、DSox2、ROSox2、RDSox2、ODSox2、RODSox2、RMLLin28、OMLLin28、DMLLin28、ROMLLin28、RDMLLin28、ODMLLin28、RODMLLin28、RLLin28、OLLin28、DLLin28、ROLLin28、RDLLin28、ODLLin28、RODLLin28、RMLin28、OMLin28、DMLin28、ROMLin28、RDMLin28、ODMLin28、RODMLin28、RLin28、OLin28、DLin28、ROLin28、RDLin28、ODLin28、RODLin28、RMLKSox2、OMLKSox2、DMLKSox2、ROMLKSox2、RDMLKSox2、ODMLKSox2、RODMLKSox2、RLKSox2、OLKSox2、DLKSox2、ROLKSox2、RDLKSox2、ODLKSox2、RODLKSox2、RMKSox2、OMKSox2、DMKSox2、ROMKSox2、RDMKSox2、ODMKSox2、RODMKSox2、RKSox2、OKSox2、DKSox2、ROKSox2、RDKSox2、ODKSox2、RODKSox2、RMLKLin28、OMLKLin28、DMLKLin28、ROMLKLin28、RDMLKLin28、ODMLKLin28、RODMLKLin28、RLKLin28、OLKLin28、DLKLin28、ROL
KLin28、RDLKLin28、ODLKLin28、RODLKLin28、RMKLin28、OMKLin28、DMKLin28、ROMKLin28、RDMKLin28、ODMKLin28、RODMKLin28、RKLin28、OKLin28、DKLin28、ROKLin28、RDKLin28、ODKLin28、RODKSox2、RMLSox2Lin28、OMLSox2Lin28、DMLSox2Lin28、ROMLSox2Lin28、RDMLSox2Lin28、ODMLSox2Lin28、RODMLSox2Lin28、RLSox2Lin28、OLSox2Lin28、DLSox2Lin28、ROLSox2Lin28、RDLSox2Lin28、ODLSox2Lin28、RODLSox2Lin28、RMSox2Lin28、OMSox2Lin28、DMSox2Lin28、ROMSox2Lin28、RDMSox2Lin28、ODMSox2Lin28、RODMSox2Lin28、RSox2Lin28、OSox2Lin28、DSox2Lin28、ROSox2Lin28、RDSox2Lin28、ODSox2Lin28、RODSox2Sox2、RMLKSox2Lin28、OMLKSox2Lin28、DMLKSox2Lin28、ROMLKSox2Lin28、RDMLKSox2Lin28、ODMLKSox2Lin28、RODMLKSox2Lin28、RLKSox2Lin28、OLKSox2Lin28、DLKSox2Lin28、ROLKSox2Lin28、RDLKSox2Lin28、ODLKSox2Lin28、RODLKSox2Lin28、RMKSox2Lin28、OMKSox2Lin28、DMKSox2Lin28、ROMKSox2Lin28、RDMKSox2Lin28、ODMKSox2Lin28、RODMKSox2Lin28、RKSox2Lin28、OKSox2Lin28、DKSox2Lin28、ROKSox2Lin28、RDKSox2Lin28、ODKSox2Lin28以及RODKSox2Lin28。在那些中，下述组合为可取的：
ROct4ML、OOct4ML、DOct4ML、ROOct4ML、RDOct4ML、ODOct4ML、RODOct4ML、ROct4L、OOct4L、DOct4L、ROOct4L、RDOct4L、ODOct4L、RODOct4L、ROct4M、OOct4M、DOct4M、ROOct4M、RDOct4M、ODOct4M、RODOct4M、ROct4、OOct4、DOct4、ROOct4、RDOct4、ODOct4、RODOct4、ROct4MLK、OOct4MLK、DOct4MLK、ROOct4MLK、RDOct4MLK、ODOct4MLK、RODOct4MLK、ROct4LK、OOct4LK、DOct4LK、ROOct4LK、RDOct4LK、ODOct4LK、RODOct4LK、ROct4MK、OOct4MK、DOct4MK、ROOct4MK、RDOct4MK、ODOct4MK、RODOct4MK、ROct4K、OOct4K、DOct4K、ROOct4K、RDOct4K、ODOct4K、RODOct4K、ROct4MLSox2、OOct4MLSox2、DOct4MLSox2、ROOct4MLSox2、RDOct4MLSox2、ODOct4MLSox2、RODOct4MLSox2、ROct4LSox2、OOct4LSox2、DOct4LSox2、ROOct4LSox2、RDOct4LSox2、ODOct4LSox2、RODOct4LSox2、ROct4MSox2、OOct4MSox2、DOct4MSox2、ROOct4MSox2、RDOct4MSox2、ODOct4MSox2、RODOct4MSox2、ROct4Sox2、OOct4Sox2、DOct4Sox2、ROOct4Sox2、RDOct4Sox2、ODOct4Sox2、RODOct4Sox2、ROct4MLLin28、OOct4MLLin28、DOct4MLLin28、ROOct4MLLin28、RDOct4MLLin28、ODOct4MLLin28、RODOct4MLLin28、ROct4LLin28、OOct4LLin28、DOct4LLin28、ROOct4LLin28、RDOct4LLin28、ODOct4LLin28、RODOct4LLin28、ROct4MLin28、OOct4MLin28、DOct4MLin28、ROOct4MLin28、RDOct4MLin28、ODOct4MLin28、RODOct4MLin28、ROct4Lin28、OOct4Lin28、DOct4Lin28、ROOct4Lin28、RDOct4Lin28、ODOct4Lin28、RODOct4Lin28、ROct4MLKSox2、OOct4MLKSox2、DOct4MLKSox2、ROOct4MLKSox2、RDOct4MLKSox2、ODOct4MLKSox2、RODOct4MLKSox2、ROct4LKSox2、OOct4LKSox2、DOct4LKSox2、ROOct4LKSox2、RDOct4LKSox2、ODOct4LKSox2、RODOct4LKSox2、ROct4MKSox2、OOct4MKSox2、DOct4MKSox2、ROOct4MKSox2、RDOct4MKSox2、ODOct4MKSox2、RODOct4MKSox2、ROct4KSox2、OOct4KSox2、DOct4KSox2、ROOct4KSox2、RDOct4KSox2、ODOct4KSox2、RODOct4KSox2、ROct4MLKLin28、OOct4MLKLin28、DOct4MLKLin28、ROOct4MLKLin28、RDOct4MLKLin28、
ODOct4MLKLin28、RODOct4MLKLin28、ROct4LKLin28、OOct4LKLin28、DOct4LKLin28、ROOct4LKLin28、RDOct4LKLin28、ODOct4LKLin28、RODOct4LKLin28、ROct4MKLin28、OOct4MKLin28、DOct4MKLin28、ROOct4MKLin28、RDOct4MKLin28、ODOct4MKLin28、RODOct4MKLin28、ROct4KLin28、OOct4KLin28、DOct4KLin28、ROOct4KLin28、RDOct4KLin28、ODOct4KLin28、RODOct4KSox2、ROct4MLSox2Lin28、OOct4MLSox2Lin28、DOct4MLSox2Lin28、ROOct4MLSox2Lin28、RDOct4MLSox2Lin28、ODOct4MLSox2Lin28、RODOct4MLSox2Lin28、ROct4LSox2Lin28、OOct4LSox2Lin28、DOct4LSox2Lin28、ROOct4LSox2Lin28、RDOct4LSox2Lin28、ODOct4LSox2Lin28、RODOct4LSox2Lin28、ROct4MSox2Lin28、OOct4MSox2Lin28、DOct4MSox2Lin28、ROOct4MSox2Lin28、RDOct4MSox2Lin28、ODOct4MSox2Lin28、RODOct4MSox2Lin28、ROct4Sox2Lin28、OOct4Sox2Lin28、DOct4Sox2Lin28、ROOct4Sox2Lin28、RDOct4Sox2Lin28、ODOct4Sox2Lin28、RODOct4Sox2Sox2、ROct4MLKSox2Lin28、OOct4MLKSox2Lin28、DOct4MLKSox2Lin28、ROOct4MLKSox2Lin28、RDOct4MLKSox2Lin28、ODOct4MLKSox2Lin28、RODOct4MLKSox2Lin28、ROct4LKSox2Lin28、OOct4LKSox2Lin28、DOct4LKSox2Lin28、ROOct4LKSox2Lin28、RDOct4LKSox2Lin28、ODOct4LKSox2Lin28、RODOct4LKSox2Lin28、ROct4MKSox2Lin28、OOct4MKSox2Lin28、DOct4MKSox2Lin28、ROOct4MKSox2Lin28、RDOct4MKSox2Lin28、ODOct4MKSox2Lin28、RODOct4MKSox2Lin28、ROct4KSox2Lin28、OOct4KSox2Lin28、DOct4KSox2Lin28、ROOct4KSox2Lin28、RDOct4KSox2Lin28、ODOct4KSox2Lin28以及RODOct4KSox2Lin28。在那些中，特别可取的是：RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML、DOct4ML、RODOct4M、ODOct4L、OOct4ML、OOct4L、OOct4M、ODOct4、DOct4L、Oct4ML、RODOct4ML、RDOct4ML、ODOct4ML、OOct4MLGlis1、RDOct4M、ROct4LGlis1、ROct4ML、ODOct4M、OOct4LGlis1、RODOct4、ROOct4M、ROOct4L、ROOct4、OOct4Glis1、RDOct4、Oct4LGlis1、DOct4M、DOct4Glis1、OOct4、Oct4L、Oct4M、DOct4、ROOct4K、ROOct4Sox2以及ROOct4Lin28。在那些中，RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML、DOct4ML、RODOct4M、ODOct4L、OOct4ML、OOct4L、OOct4M、ODOct4和DOct4L为更可取的。在那些中，RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML和DOct4ML为更优选的。可取的组合对于人体细胞的直接重编程特别有效。
作为待被导入体细胞以用单独的重编程相关基因诱导成骨细胞的重编程相关基因的优选组合，给出了Oct4、Oct4L、Oct4M、Oct4LM、Oct4LGlis1和Oct4LMGlis1。
所有这些基因在脊椎动物中都是高度保守的，并且在该说明中，指的是包括同源物的基因，除非描述了具体动物名称。基因还包括具有等同于那些野生型基因产物的功能的基因，即使所述基因包含含有多态性的突变。除选择特定基因之外，可以依照已知的直接重编程方法实施本发明的方法，例如可以依照下述文献中的任何一篇中所述的方法实施本发明的方法：
文献：
1DirectReprogrammingofFibroblastsintoFunctionalCardiomyocytesbyDefinedFactors；MasakiIeda,Ji-DongFu,PaulDelgado-Olguin,VasanthVedantham,YoheiHayashi,BenoitG.Bruneau,andDeepakSrivastavaCell142:375-386,2010.
2Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.ThomasVierbuchen,AustinOstermeier,ZhipingP.Pang,YukoKokubu,ThomasC.Sudhof&MariusWernig.Nature463:1035-1041,2010.
3Inductionofhumanneuronalcellsbydefinedtranscriptionfactors.PangZP,YangN,VierbuchenT,OstermeierA,FuentesDR,YangTQ,CitriA,SebastianoV,MarroS,SudhofTC,WernigM.Nature476:220-223,2011.
4GenerationofhyalinecartilaginoustissuefrommouseadultdermalfibroblastculturebydefinedfactorsKunihikoHiramatsu,SatoruSasagawa,HidetatsuOutani,KanakoNakagawa,HidekiYoshikawa,andNoriyukiTsumaki,JournalofClinicalInvestigation,121:640-657,2011.
5Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.PengyuHuang,ZhiyingHe,ShuyiJi,HuawangSun,DaoXiang,ChangchengLiu,YipingHu,XinWang&LijianHui,.Nature475:386-389,2011.
6Directconversionofmousefibroblaststohepatocyte-likecellsbydefinedfactors.SayakaSekiya&AtsushiSuzuki.Nature475:390-393,2011.
将文献1至6的内容以引用的方式并入本文。
具体而言，优选的是，将待被导入以转化为成骨细胞的基因(骨相关基因与重编程相关基因的组合或者单独的重编程相关基因)掺入表达载体，将表达载体导入靶向的体细胞，以及基因在细胞中表达。
作为导入基因的方法，也可以使用例如涉及用病毒载体感染的方法，所述病毒载体如逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体或仙台病毒载体，并且在导入基因和其表达产物的情况下，可以使用涉及用质粒载体、附加型载体进行转染的方法，或者通过非病毒载体如阳离子脂质体、阳离子聚合物或电穿孔导入基因表达产物(mRNA、蛋白)的方法。此外，可以导入mRNA。在该说明中，所有用于基因导入的手段统称为“载体”。
在使用之前，可以通过将用于治疗的基因与作为药物选择性标志物(具有嘌呤霉素抗性、杀稻瘟菌素S抗性、新霉素抗性、潮霉素抗性等)发挥作用的基因共同导入，并用药物选择细胞来选择表达用于治疗的基因的细胞。
当被导入的因子是骨相关基因的表达产物和重编程相关基因的表达产物(如蛋白)时，可将被称为“蛋白转导结构域(PTD)”的肽与作为表达产物获得的蛋白键合并添加至培养基中，以将肽导入体细胞。当骨相关基因中的一些在用作成骨细胞的材料的体细胞中表达时，不必从外部导入蛋白。此外，即使未导入重编程因子或重编程因子的基因时，可以利用用作替代物的小分子诱导成骨细胞。上述的实例包括“Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins.”ZhouH,WuS,JooJY,ZhuS,HanDW,LinT,TraugerS,BienG,YaoS,ZhuY,SiuzdakG,ScholerHR,DuanL,DingS.CellStemCell.2009May8；4(5):381-4或“Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsbydirectdeliveryofreprogrammingproteins.”KimD,KimCH,MoonJI,ChungYG,ChangMY,HanBS,KoS,YangE,ChaKY,LanzaR,KimKS.CellStemCell.2009Jun5；4(6):472-6中所述的方法。
用于成骨细胞分化的分化诱导培养基并不特别地受限，例如可以使用下述骨诱导性培养基。
骨诱导性培养基＝通过向正常培养基中添加50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸酯(盐)和100nM地塞米松(所有浓度都是终浓度)获得的培养基。
可以通过下述方法确认制备的成骨细胞的存在：ALP染色、通过实时PCR测量骨钙蛋白mRNA或骨桥蛋白mRNA、茜素红S染色(钙化的骨基质的产物)、冯库萨染色等。
在本发明中，可以利用质粒或病毒载体(例如逆转录病毒载体)导入基因。从导入效率和导入的基因的稳定性的维持的角度，优选使用病毒载体，而质粒优选用于降低致癌作用的风险。
可以利用LTR启动子来转录或者可以利用载体中的其它启动子来表达导入体细胞的基因。例如，可以利用组成型表达启动子(如CMV启动子、EF-1α启动子和CAG启动子)或者期望的诱导型启动子。此外，可以使用通过用其它启动子替换LTR的一部分获得的嵌合启动子。
实施例
下文显示了实施例。然而，本发明并不仅限于这些实施例。
应当注意图3至图11、图14至图16、图18至图22、图26、图28至图32、图34以及图37和图38是利用正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1的实验结果。图12和图13、图17、图33、图35和图36以及图39至图42是利用aHDF(正常的人皮肤成纤维细胞)的实验结果。图27是利用小鼠胎儿成纤维细胞的实验结果。
实施例1
(1)编码目的基因的pMXs载体的制备(图1)
利用编码区的引物(图23中显示了引物的碱基序列)通过PCR，从含有目的基因的质粒扩增目的基因(Runx2等)。此外，用EcoRI剪切pMXspuro载体。将得到的片段通过电泳分离，然后从电泳凝胶中提取基因和载体骨架。利用GeneArtsystem将提取的基因和载体骨架连接以制备编码目的基因的pMXs载体。利用图24中所示的引物确认那些载体的碱基序列。
(2)实验提纲(图2)
将3×106个PlatGP细胞接种至用角蛋白包被的10-cm皿，并在含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1％NEAA10％FBSDMEM(正常培养基)中培养。24小时后，通过脂质转染方法，利用X-tremeGENE9，以不同组合按1:3的比率将含有多个基因的pMXs载体与pCMVVSV载体一起导入作为包装细胞的PlatGP中(将通过混合5μg待导入的基因、2.5μgpCMV.VSV、500μlOpti-MEM以及22.5μlX-tremeGENE9获得的溶液添加至补充有10ml培养基的10-cm皿中)。24小时后，将培养基更换为不含抗生素的正常培养基。在同一天，将正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1和正常的人皮肤成纤维细胞株aHDF以2×104个细胞/ml至2×105个细胞/ml接种至培养皿或培养板中(例如，对于免疫染色，12-孔板或24-孔板；对于ALP活性或PCR，12-孔板；对于ALP染色，6-孔板；或者对于茜素红S染色，24-孔板、6-孔板、35-mm皿或60-mm皿)，并且将这一天定义为培养第-1天。一天之后(培养第0天)，使PlatGP的培养上清液通过具有0.45μm孔径的注射器式滤器，并将滤液与聚凝胺(终浓度4μg/ml)混合(病毒溶液)。在通过抽吸移出Gin-1和aHDF的培养上清液之后，立即向其中添加病毒溶液(对于24-孔板，500μl；对于12-孔板，1ml；对于6-孔板和35-mm皿，1.5ml；对于60-mm皿，2.5ml)，并且将细胞培养24小时(感染)。还制备未用所述病毒进行感染的细胞作为对照组。一天之后(培养第1天)，通过抽吸移出培养上清液，之后向其中添加骨诱导性培养基(通过向正常培养基中添加50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸酯(盐)和100nM地塞米松(所有浓度都为终浓度)制备)，然后培养。在那之后，每2天或3天更换培养基。导入基因之后14天，将细胞进行ALP染色、ALP活性测试和实时RT-PCR，导入基因之后20天进行免疫染色，导入基因之后20天或28天进行茜素红S染色，以及在导入基因之后28天进行冯库萨染色。将未用逆转录病毒载体感染的以相同方式培养的细胞用作对照。
(3)茜素红S染色(图3)
在24-孔板中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图2中所示的实验。导入基因之后28天，通过抽吸从培养皿中移出培养基，用PBS将细胞洗涤两次，并用95％的乙醇固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加茜素红S染色液，之后在室温静置15分钟。图3A至图3F是皿的肉眼图。钙化的骨基质被染成红色，表明功能性的成骨细胞被诱导。对于孔的数量，参见图3H和图3I(图3H和图3I的表中的数字“1”表示用含有基因的逆转录病毒载体感染细胞，以及空白表示未用含有基因的逆转录病毒载体感染细胞)。例如，如图3H中所示，用含有Osterix、Runx2、Oct4、L-Myc和Dlx5基因的逆转录病毒载体感染图3B第27孔中的细胞(第一行从左数第三个孔)，并产生了大量钙化的骨基质。此外，将茜素红S染色液从所有孔中移出，并用无菌蒸馏水洗涤孔。在那之后，向其中添加10％的TritonX，并允许所得物在室温反应1小时。从每孔中收集溶液，并置于96-孔板中。图3G显示了板的肉眼图(对于孔的数量，参见图3H)。利用酶标仪获得的反应溶液的吸光度的测量结果(图3H，550nm至650nm；图3I，490nm至650nm)显示于图3H和图3I的图中。图中的纵轴表示吸光度。该图显示，随着吸光度变高，产生的钙化的骨基质的量增加，即转变为功能性成骨细胞的成纤维细胞的量增加。例如，该图显示，用含有Osterix、Runx2、Oct4、L-Myc和Dlx5基因的逆转录病毒载体感染的第27孔中的细胞产生最大量的钙化的骨基质。
(4)ALP活性测试(图4)
在12-孔板中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图2中所示的实验。导入基因之后14天，通过抽吸从细胞培养皿中移出培养基，并用生理盐水将细胞洗涤两次。用含有1％NP-40的生理盐水裂解细胞，并将所得物在12,000rpm离心5分钟。收集上清液，允许其与含有对硝基酚磷酸盐的ALP缓冲液反应，并在405nm处，利用吸收光谱仪将所得物进行测量。同时，测量总蛋白量，并表示为通过ALP活性/总蛋白质量校正的量。结果显示于图4中。
与对照相比，在通过导入ROOct4、ROOct4M、ROOct4L、ROOct4G等获得的细胞中检测到了显著较高的ALP活性。在所有组中，在通过导入ROOct4L获得的细胞中，检测到了最高的ALP活性。
(5)ALP染色图像(图5)
在6-孔板中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，细胞如实施例2中所示并将细胞进行如图2中所示的实验。导入基因之后14天，通过抽吸从孔中移出培养基，用生理盐水将细胞洗涤两次，并用固定剂固定5分钟。用无菌蒸馏水将细胞洗涤两次。向其中添加ALP染色液，并在室温，在避光条件下将细胞静置1小时。用无菌蒸馏水将细胞洗涤两次，然后用肉眼以及在倒置相差显微镜下观察。结果显示于图5中。
通过导入ROOct4M、ROOct4L或Oct4L获得的一些细胞变为ALP阳性。具体而言，在通过导入ROOct4L获得的细胞中，在整个孔的底部都观察到了ALP染色阳性的细胞。
(6)免疫染色(图6)
在24-孔板中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图2中所示的实验。导入基因之后21天，通过抽吸从培养皿中移出培养基，用PBS将细胞洗涤两次，并用4％的多聚甲醛固定30分钟。将细胞洗涤三次，然后室温封闭1小时。允许细胞与第一抗体(抗h骨钙蛋白)在4℃反应24小时，洗涤三次，然后允许细胞与用FITC标记的第二抗体在室温反应1小时。将细胞洗涤三次，然后在荧光显微镜下观察。结果显示于图6中。
(a)对照，(b)ROOct4M，(c)ROOct4L：×100
在通过导入ROOct4M和ROOct4L获得的细胞中，观察到了骨钙蛋白的表达。在通过导入ROOct4L获得的细胞中，观察到了大量的骨钙蛋白阳性的细胞。
(7)茜素红S染色(图7)
在35-mm皿中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图2中所示的实验。导入基因之后28天，通过抽吸从培养皿中移出培养基，用PBS将细胞洗涤两次，并用95％的乙醇固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加茜素红S染色液，之后室温静置15分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后用肉眼以及在倒置相差显微镜下观察。结果显示于图7中。
(a)对照，(b)ROOct4M，(c)ROOct4L：×1
(d)对照，(e)ROOct4M，(f)ROOct4L：×40
在通过导入ROOct4M或ROOct4L获得的细胞的皿中，观察到了钙化的基质的沉积。具体而言，在通过导入ROOct4L获得的细胞的皿中，在整个培养皿的底部都观察到了大量的钙化的骨基质的沉积。
(8)冯库萨染色(图8)
在35-mm皿中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图2中所示的实验。导入基因之后28天，通过抽吸从培养皿中移出培养基，用PBS将细胞洗涤两次，并用10％的福尔马林固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加5％的硝酸银溶液，然后在UV光下静置30分钟。在那之后，用无菌蒸馏水洗涤细胞，并允许其与5％的硫代硫酸盐溶液反应2分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后用肉眼以及在倒置相差显微镜下观察。结果显示于图8中。
在通过导入ROOct4M获得的细胞中，观察到了磷酸钙的分散沉积。在通过导入ROOct4L和Oct4L获得的细胞中，在整个培养皿的底部都观察到了磷酸钙的密集沉积。
(9)三维实验培养方法的提纲(图9)
如图9中所示，在第-1天将体细胞接种于培养皿或培养板中，在第0天导入基因，并在第1天将培养基更换为骨分化诱导培养基。在第-1天接种细胞、在第0天导入基因以及在第1天更换培养基的细节与图2中所示的那些相同。在第4天，将细胞从皿上剥落，并将5×105个细胞接种于支架(3D插入-PCL)内，进行三维培养。在第28天，将细胞进行吉姆萨染色或茜素红S染色。将未用逆转录病毒载体感染，且以相同方式培养的细胞用作对照。此外，将仅利用支架，未添加细胞且以相同方式培养的样本用作背景。
(10)三维培养中的吉姆萨染色(图10)
在60-mm皿中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图9中所示的实验。导入基因之后28天，从培养皿中抽吸培养基，用PBS将细胞洗涤两次并用甲醇将其与支架一起固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加吉姆萨染色液，之后在室温静置15分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后用肉眼观察。结果显示于图10中。
(a)背景，(b)ROOct4L：×1
照片表明诱导的细胞实现了在支架中的移植和增殖。
(11)三维培养中的茜素红S染色(图11)
在60-mm皿中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图9中所示的实验。导入基因之后28天，从培养皿中抽吸培养基，将细胞用PBS洗两次，并用95％的乙醇将其与支架一起固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加茜素红S染色液，之后在室温静置15分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后用肉眼观察。结果显示于图11中。
(a)背景，(b)对照，(c)ROOct4M，(d)ROOct4L：×1
照片表明诱导的细胞显示出在支架上产生钙化的骨基质的能力。
此外，在通过导入ROOct4L获得的细胞中，显著产生了钙化的骨基质。
(12)ALP染色图像(图12)
在6-孔板中培养正常的人皮肤成纤维细胞株aHDF，细胞如图2中所示并对细胞进行如图2中所示的实验。导入基因之后14天，通过抽吸从孔中移出培养基，将细胞用生理盐水洗涤两次，并用固定剂固定5分钟。将细胞用无菌蒸馏水洗涤两次，向其中添加ALP染色液，并在室温在避光条件下将细胞静置1小时。用无菌蒸馏水将细胞洗涤两次，然后用肉眼以及在倒置相差显微镜下观察。结果显示于图12中。
(a)对照，(b)ROOct4M，(c)ROOct4L：×1
(d)对照，(e)ROOct4M，(f)ROOct4L：×40
通过导入ROOct4M或ROOct4L获得的一些细胞变为ALP染色阳性。具体而言，在整个孔的底部，通过导入ROOct4L获得的细胞包括许多ALP染色阳性的细胞。
(13)茜素红S染色(图13a和图13b)
(a)在6-孔板中培养正常的人皮肤成纤维细胞株aHDF，并进行如图2中所示的实验。导入基因之后28天，通过抽吸从孔中移出培养基，将细胞用PBS洗涤两次，并用95％的乙醇固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加茜素红S染色液，之后在室温静置15分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后用肉眼以及在倒置相差显微镜下观察。结果显示于图13a中。
(左)对照，(中间)ROOct4M，(右)ROOct4L：×1
在通过导入ROOct4M或ROOct4L获得的细胞的孔中，观察到了钙化的基质的沉积。具体而言，在通过导入ROOct4L获得细胞的孔中，在孔的整个底部都观察到了大量的钙化的骨基质的沉积。
(b)图13b中显示了进行与项(a)中的实验相同的实验并在导入基因之后14天进行ALP染色(上方)或在导入基因之后28天进行冯库萨染色(下方)的细胞的倒置相差显微镜的图像。放大率为40倍。
(14)茜素红S染色(图14)
在6-孔板中培养正常的人牙龈成纤维细胞Gin-1，并用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)，含有Runx2、Osterix、Oct4和c-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4M)或者含有Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(Oct4L)感染。感染之后，将细胞培养图14中所示的天数(1天至28天)。符号(-)表示未用逆转录病毒载体感染的牙龈成纤维细胞Gin-1。此外，人成骨细胞为购自LonzaWalkersville，Inc的NHost细胞。如下所述进行茜素红S染色。通过抽吸从培养皿中移出培养基，将细胞用PBS洗涤两次并用95％的乙醇固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加茜素红S染色液，之后在室温静置15分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后在倒置相差显微镜下观察并拍照。用ROOct4L和Oct4L感染的细胞产生了大量钙化的骨基质，甚至用ROOct4M感染的细胞产生的钙化的骨基质的量少于用ROOct4L感染的细胞中的钙化的骨基质的量。ND：未测定。
(15)由直接重编程诱导的人成骨细胞的特性(图15)
以与图14中所示的相同的方式，用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)或者含有Runx2、Osterix、Oct4和c-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4M)感染人牙龈成纤维细胞(Gin-1)，并培养28天。符号(-)表示未用逆转录病毒载体感染的牙龈成纤维细胞Gin-1。将购自LonzaWalkersville，Inc.的NHost细胞用作人成骨细胞。a：通过螯合法对钙沉积进行定量。将细胞用PBS充分洗涤，然后用刮刀剥落，用0.5M盐酸裂解，并进行超声。将裂解物在10,000rpm离心5分钟并收集上清液。将2μL裂解物与240μL偶氮氯膦-III溶液(LS-MPRCPZIII,AKJGlobalTechnology,Chiba,Japan)混合，并将细胞孵育10分钟。利用酶标仪测量690nm处的吸光度，并且与标准曲线进行比较以计算钙的浓度(mg/dL)。b-e：利用ISOGENII(NipponGene)从细胞中收集RNA，并利用ReverTraAceqPCRRT预混合物(TOYOBO)进行反转录。通过7300实时PCR系统(AppliedBiosystems)，利用各基因特异的引物(图25中所示)和实时PCR预混合物(Real-timePCRMasterMix)(TOYOBO)进行实时RT-PCR分析。通过β-肌动蛋白的mRNA水平将各样本的mRNA水平标准化，然后表示为人牙龈成纤维细胞的值的相对值。f：向细胞中添加2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二硫代苯)-2H-四唑单钠盐溶液(WST-8)(细胞计数试剂SF；NacalaiTesque)，并将细胞在37℃培养1小时。测量上清液在450nm和650nm处的吸光度，并且当将在未导入基因的情况下获得的牙龈成纤维细胞的值被定义为100％时，计算各细胞的活力。*P<0.05以及**P<0.01，(相对于在未导入基因的情况下获得的人牙龈成纤维细胞(Gin-1)有显著差异)。#P<0.05，##P<0.01。值为平均值±S.D.(n＝4)。
用ROOct4L感染的细胞可以引起比人成骨细胞更大量的钙沉积。即使是在用ROOct4M感染的细胞中，也可以沉积与在人成骨细胞中的钙相同水平的钙。用ROOct4L感染的细胞和用ROOct4M感染的细胞都表达成骨细胞特异的基因。此外，用ROOct4L感染的细胞具有足够的增殖能力。
(16)由直接重编程诱导的人成骨细胞的分析(图16)
a：人牙龈成纤维细胞(Gin-1)，用FITC-标记的抗人骨钙蛋白抗体和FITC-标记的抗骨桥蛋白抗体对用ROOct4L感染，然后培养了20天的人牙龈成纤维细胞(Gin-1)(在下述说明和附图中称作dOB)和人成骨细胞(购自LonzaWalkersville,Inc.的NHost细胞)进行免疫染色。放大率为100倍。b：如上所述从细胞中收集RNA，并利用GeneChip(商标)人类基因1.0ST(Affymetrix,Inc.)进行DNA微阵列分析。基于成骨细胞中的表达水平与人牙龈成纤维细胞中的表达水平的比率，将所有基因分为7组(小于0.2、0.2或以上但小于0.33、0.33或以上但小于0.5、0.5或以上但小于2.0、2.0或以上但小于3.0、3.0或以上但小于5.0、5.0或以上)(X轴)。属于各组的基因的数量显示于括号中。对于属于各组的基因，对dOB中的表达水平与人牙龈成纤维细胞中的表达水平的比率(平均值±S.D.)作图。发现与人牙龈成纤维细胞相比，在成骨细胞中强表达的基因在dOB中也是强表达的，而发现在成骨细胞中弱表达的基因在dOB中也是弱表达的，这显示出显著的相关性(相关性的相关系数R＝0.70，P<0.01)。c：如上所述从细胞中收集DNA，并对骨钙蛋白基因上游区域的CpG甲基化进行分析。利用基因组DNA纯化试剂盒(MagExtractor,ToyoboLifeScience,Tokyo,Japan)收集DNA，并利用EZDNA甲基化试剂盒(ZYMOresearch,Irvine,CA)对DNA进行亚硫酸氢盐处理，然后利用正义引物(5′-GTGTATTTGGTAGTTATAGTTATTTGG)和反义引物(5′-CCTCAAATTAAACACTAACTAAACTC)，通过PCR扩增骨钙蛋白基因上游区域的序列。将片段克隆至pTA2载体，然后利用T7和T3通用引物进行测序。黑色孔显示甲基化的CpG，以及白色孔显示未甲基化的CpG。d-e：用ROOct4L感染人牙龈成纤维细胞(Gin-1)，并在感染前(-)以及感染后7天、14天和21天从细胞中收集RNA。作为阳性对照，从人iPS细胞中收集RNA。反转录之后，利用REX-1(d)-和Nanog(e)-特异性引物进行实时RT-PCR。通过β-肌动蛋白的mRNA水平将各样本的mRNA水平标准化，然后表示为人牙龈成纤维细胞的值的相对值。**P<0.01，(相对于通过未导入基因获得的人牙龈成纤维细胞(Gin-1)有显著差异)。值为平均值±S.D.(n＝4)。
发现人dOB可以产生大量的骨钙蛋白和骨桥蛋白(a)。还发现人dOB具有与人成骨细胞的基因表达特征相似的详尽的基因表达特征(b)。发现人dOB具有染色体DNA的表观遗传标记，所述表观遗传标记不同于成纤维细胞的表观遗传标记，并且与人成骨细胞的表观遗传标记变得更加接近(c)。此外，在由感染ROOct4L引起的从成纤维细胞转化为dOB期间的任何时间点，都未观察到REX-1(d)和Nanog(e)基因的显著的mRNA表达，这表明转化不经由iPS细胞样细胞发生(d和e)。
(17)通过实时RT-PCR分析的导入人皮肤成纤维细胞的基因的表达水平的定量结果(图17)
用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)或者含有Runx2、Osterix、Oct4和c-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4M)感染人皮肤成纤维细胞，并培养14天(d0)。符号(-)表示未用逆转录病毒载体感染的牙龈成纤维细胞Gin-1。以与图15b至图15e中相同的方式，通过实时RT-PCR分析定量基因的表达水平。通过β-肌动蛋白的mRNA水平将各样本的mRNA水平标准化，然后表示为人牙龈成纤维细胞(Gin-1)的值的相对值。*P<0.05，**P<0.01(相对于在未导入基因的情况下获得的人牙龈成纤维细胞有显著差异)。#P<0.05，##P<0.01。值为平均值±S.D.(n＝4)。
(18)骨缺损部位的体内骨再生(图18)
dOB(通过直接重编程制备的成骨细胞)有助于活体中的骨再生。
在京都府立医科大学的批准下进行动物实验。通过腹膜内注射戊巴比妥使八周龄的雄性NOD/SCID小鼠(CharlesRiver)麻醉。利用具有注水的牙钻在左股骨干形成具有约4mm直径的节段性骨缺损。将人牙龈成纤维细胞(Gin-1)和通过用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)感染Gin-1并将细胞培养14天而诱导的细胞(在下述说明和附图中称为dOB)在25μL的培养基和75μL的基质胶(BDBioscience,SanJose,CA)中重悬，并以5×105个细胞/小鼠的浓度移植至骨缺损部位。也准备了在未产生骨缺损及未移植的情况下进行了与上述操作相同操作的小鼠(假手术)。a：微型计算机断层扫描(μCT)图像。在移植之后21天，通过腹膜内注射戊巴比妥使小鼠麻醉。将大腿切除，用中性福尔马林固定，然后用X-射线CT装置(ScanXmate-L090,ComScanTechno,Yokohama,Japan)拍照。显示了10-μm的连续断层图像。三角形表示骨缺损，以及箭头表示再生的骨小梁。b:将骨缺损部位的组织包埋至SCEM(LeicaMicrosystem)化合物并快速冷冻。将组织切成6-μm的切片，然后用苏木精伊红(H&E)(上方)和茜素红S(下方)将连续切片染色。三角形表示骨缺损，以及箭头表示再生的骨小梁。放大率为40倍。c：用4％的多聚甲醛固定上文提及的6-μm切片，并用人细胞核特异的小鼠单克隆抗体(Cat：MAB1281；克隆：235-1；Millipore,Billerica,MA)进行免疫染色。符号“#”表示再生的骨小梁，以及符号“*”表示骨髓。放大率为100倍。
微型CT图像(a)和组织学图像(b)显示，在移植有人dOB的骨中，通过形成包含对齐的骨小梁的骨痂将缺损部位完全覆盖。在移植有成纤维细胞的骨中，仅形成很少的骨痂，并且骨缺损仍然存在。免疫荧光图像(c)显示，在移植有人dOB的骨中，在骨再生部位，许多移植的dOB移植成功。在移植有成纤维细胞的骨中，仅少数移植的成纤维细胞移植成功。
(19)骨缺损部位的体内骨再生(图19)
在与如图18所示的相同的移植实验之后，在移植之后21天，使小鼠安乐死，并收集股骨。进行三点弯曲试验以测量最大负荷值。与移植有牙龈成纤维细胞的组相比，在移植有通过感染ROOct4L诱导，然后培养了14天的成骨细胞(dOB)的组中，股骨的机械强度显著增强。术语“假手术”指在不产生骨缺损及未移植的情况下，对小鼠的股骨进行了与上述操作相同的操作。*P<0.05，**P<0.01。值为平均值±S.D.(n＝3)。
(20)骨缺损部位的体内骨再生(图20)
通过与图18中所示的相同实验移植人牙龈成纤维细胞(左)和dOB(右)之后21天，用立体显微镜拍摄股骨的骨缺损部位。照片为立体显微镜图像(上方)(放大率：10倍)和叠加有说明的立体显微镜图像(下方)。符号“*”表示骨缺损，以及符号“#”表示再生的骨。
在移植有人dOB的骨中，形成了包含对齐的骨小梁的骨痂，缺损部位被完全覆盖且不能从视觉上观察到。在移植有成纤维细胞的骨中，仅形成了很少的骨痂，并且骨缺损仍保持高比率。
(21)图18a中所示的微型计算机断层扫描(μCT)数据的三维重建图像(图21)。
三角形表示骨缺损，以及箭头表示再生的骨小梁。
在移植有人dOB的骨中，形成了包含对齐的骨小梁的骨痂，并且缺损部位被完全覆盖。在移植有成纤维细胞的骨中，仅形成很少的骨痂，并且骨缺损仍然存在。
(22)图18a中所示的实验的μCT透射图像(图22)。
显示了通过与图18a中所示的相同实验获得的μCT透射图像。箭头表示骨缺损部位。在移植有通过直接重编程诱导的成骨细胞(dOB)的骨中，骨缺损部位的射线不透性高于移植有人牙龈成纤维细胞的骨中的射线不透性。
(23)利用附加型载体直接重编程为成骨细胞(图26)
将人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因分别插入pG.oriPP9.EBNA1附加型载体的EcoRI位点(图26a中显示了在其中插入Runx2的pG.oriPP9.hRunx2.EBNA1)。将2×105个人牙龈成纤维细胞(Gin-1)重悬于如图1所示的实验中使用的正常培养基(含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1％NEAA10％FBSDMEM)中，接种至35-mm皿，并培养1天。将上述4种基因(各0.5μg)的附加型载体的混合物、ExtremeGENE9DNA转染试剂(6μL)和Opti-MEM(200μl)混合，并添加至上述细胞中以转染细胞。将细胞培养1天，然后弃去培养基并更换为骨诱导性培养基(通过向正常培养基中添加50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸酯(盐)和100nM地塞米松(所有浓度都是终浓度)获得)，然后培养。导入基因之后14天，将细胞进行ALP染色。显示了倒置相差显微镜的图像(b)。图26a中的缩写表示下述含义。CAGprom：CAG启动子，polyA：多聚A添加信号，oriP：爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒oriP序列，EBNA1：爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原1基因，KanR：卡那霉素抗性基因。
(24)小鼠成骨细胞中的直接重编程(图27)
用含有Runx2、Klf4和c-Myc的逆转录病毒载体的混合物(RKM)或者含有Runx2、Klf4和Glis1的逆转录病毒载体的混合物(RKG)感染小鼠胎儿成纤维细胞，然后培养x天。一些细胞未被感染。a：将细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色和冯库萨染色。放大率为40倍。b：从细胞中收集RNA，并通过实时RT-PCR分析对上述基因的表达水平进行定量。通过β-肌动蛋白的mRNA水平将各样本的mRNA水平标准化，然后表示为在未导入基因的情况下获得的小鼠胎儿成纤维细胞的值的相对值。*P<0.05以及**P<0.01，(相对于在未导入基因的情况下获得的小鼠胎儿成纤维细胞有显著差异)。#P<0.05，##P<0.01。值为平均值±S.D.(n＝4)。
(25)正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1的直接重编程(图28a、图28b和图28c)
在35-mm皿中培养正常的人牙龈成纤维细胞株Gin-1，并进行如图2中所示的实验。表中的符号“+”表示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，以及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染。
a：导入基因之后14天，从细胞中收集RNA，并通过实时RT-PCR对骨钙蛋白的mRNA(黑色条)和骨桥蛋白的mRNA(白色条)进行定量。每个条代表平均值±标准差。N＝3。*P<0.05以及**P<0.01(与未感染的细胞相比)。
b：导入基因之后14天，从细胞中收集RNA，并通过实时RT-PCR对骨钙蛋白的mRNA(黑色条)和ALP的mRNA(白色条)进行定量。每个条代表平均值±标准差。N＝3。**P<0.01(与未感染的细胞相比)。
c：导入基因之后28天，通过抽吸从培养皿中移出培养物，将细胞用PBS洗涤两次，并用10％的福尔马林固定。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后向其中添加5％的硝酸银溶液，之后在UV光下静置30分钟。在那之后，用无菌蒸馏水洗涤细胞，向其中添加5％的硫代硫酸盐溶液，并允许反应2分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞，然后用肉眼以及在倒置相差显微镜下观察。
发现用含有Osterix+Oct4+L-Myc基因和Runx2+Osterix+Oct4+L-Myc基因的逆转录病毒载体感染的细胞产生大量钙化的骨基质。此外，还发现用含有Oct4+L-Myc基因的逆转录病毒载体感染的细胞产生大量钙化的骨基质。
(26)通过直接重编程由人成纤维细胞诱导的人成骨细胞的特性(图29a和图29b)
用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)或者含有Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(Oct4L)感染人牙龈成纤维细胞(Gin-1)，并培养14天。符号(-)表示未用逆转录病毒载体感染的牙龈成纤维细胞Gin-1。将购自LonzaWalkersville,Inc.的NHost细胞用作人成骨细胞。以与图15b至图15e中相同的方式，利用ISOGENII(NipponGene)从细胞中收集RNA，并利用ReverTraAceqPCRRT预混合物(TOYOBO)进行反转录。利用各基因特异的引物(图29b中所示)、实时PCR预混合物(TOYOBO)和7300实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行实时RT-PCR分析。结果显示于图29a中。通过β-肌动蛋白的mRNA水平将各样本的mRNA水平标准化，然后表示为人牙龈成纤维细胞的值的相对值。*P<0.05以及**P<0.01，(相对于在未导入基因的情况下获得的人牙龈成纤维细胞(Gin-1)有显著差异)。#P<0.05，##P<0.01。值为平均值±S.D.(n＝4)。
用ROOct4L感染的细胞和用Oct4L感染的细胞都表达成骨细胞特异的基因。
(27)通过直接重编程由人成纤维细胞诱导的成骨细胞的详尽的基因表达特征(图30)。
从下述细胞中收集RNA。dOB：通过用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)感染人牙龈成纤维细胞(Gin-1)而诱导的成骨细胞。成纤维细胞：未用载体感染的牙龈成纤维细胞Gin-1。成骨细胞：购自LonzaWalkersville,Inc.的人成骨细胞(NHost细胞)。利用Affymetrix制造的GeneChip(商标)人类基因1.0ST对细胞进行详尽的基因表达分析。MSC：人骨髓间充质干细胞。MSC-OB：通过在成骨细胞的培养基中培养人骨髓间充质干细胞而诱导的成骨细胞。a)：与成纤维细胞相比，具有两倍或更多倍的增加和降低的表达水平的基因的热图和聚类分析。b)：所有基因的热图。结果显示dOB的基因表达特征与原始的成纤维细胞的基因表达特征明显不同，而与成骨细胞的基因表达特征类似。dOB与成骨细胞之间的相似性高于MSC-OB与成骨细胞之间的相似性。
(28)直接重编程的效率为约80％(图31)。
a)：用抗人骨钙蛋白和Alexafluor488-标记的第二抗体以及DAPI将通过用含有Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)感染人牙龈成纤维细胞(Gin-1)，然后将所述细胞培养21天而诱导的成骨细胞(dOB)染色。DAPI可以将所有细胞的细胞核染色，并且大部分DAPI阳性的细胞可以产生骨钙蛋白。
b)：对骨钙蛋白(+)DAPI(+)细胞和DAPI(+)细胞的数量进行计数。基于下述表述计算数量：
产生骨钙蛋白的细胞的比率＝骨钙蛋白(+)DAPI(+)细胞的数量/DAPI(+)细胞的数量×100。发现大约80％的成纤维细胞转化为成骨细胞。平均值±S.D.(n＝5)。**P<0.01。
(29)从人成纤维细胞重编程为成骨细胞是无多能干细胞样阶段的直接转化(图32)。
用含有Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)感染人牙龈成纤维细胞(Gin-1)。感染之后从第1天至第15天，每两天将细胞在4℃用多聚甲醛固定30分钟。在室温用0.2％的TritonX-100将细胞透化15分钟，然后用抗Nanog抗体和Alexafluor488标记的第二抗体以及DAPI染色。在荧光显微镜下观察细胞，并且在每个样本中都观察到了1,000或更多个DAPI阳性细胞。然而，在任何时间点都未观察到Nanog阳性的细胞。显示了代表性的荧光显微镜图像(放大率：100倍)。作为阳性对照，以与上文相同的方式将人iPS细胞染色，并且Nanog在所有细胞中都是强表达的。
(30)通过直接重编程由正常的人皮肤成纤维细胞诱导的成骨细胞不具有异常核型(图33)。
用含有Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)感染人成纤维细胞。在那之后14天，当对成骨细胞进行核型分析时，展示了正常的核型。
(31)人成纤维细胞不包含掺入的间充质干细胞(MSC)(图34)。
将人牙龈成纤维细胞(Gin-1)和作为阳性对照的来源于人脂肪组织的间充质干细胞(MSC)在下述培养基中单独培养：用于诱导分化为脂肪细胞的培养基(左)、用于诱导分化为成骨细胞的培养基(中间)、以及用于诱导分化为软骨细胞的培养基(右)。将细胞培养21天，然后进行油红O染色(左)、茜素红S染色(中间)和阿利新蓝染色(右)。与MSC的情况不同，不存在从Gin-1分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的细胞。
该结果可以排除由于将MSC掺入成纤维细胞产生的通过从MSC分化获得成骨细胞的可能性。
(32)通过直接重编程从人成纤维细胞诱导的人成骨细胞的特性(图35)
用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)或者含有Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(Oct4L)感染正常的人皮肤成纤维细胞，并进行培养。符号(-)表示未用逆转录病毒载体感染的正常的皮肤成纤维细胞。导入基因之后14天，以与图5中所示的相同的方式将细胞进行ALP染色。此外，导入基因之后28天，以与图14中所示的相同方式将细胞进行茜素红S染色。此外，导入基因之后28天，以与图8中所示的相同方式将细胞进行冯库萨染色。
(33)通过直接重编程，从人成纤维细胞诱导的人成骨细胞的特性(图36)
用含有人Runx2、Osterix、Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(ROOct4L)或者含有Oct4和L-Myc基因的逆转录病毒载体的混合物(Oct4L)感染正常的人皮肤成纤维细胞，并进行培养。以与图15b至图15e中相同的方式利用ISOGENII(NipponGene)，从细胞中收集RNA，并利用ReverTraAceqPCRRT预混合物(TOYOBO)进行反转录。利用各基因特异的引物(图25中所示)、实时PCR预混合物(TOYOBO)和7300实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行实时RT-PCR分析。通过β-肌动蛋白的mRNA水平将各样本的mRNA水平标准化，然后表示为正常的人皮肤成纤维细胞的值的相对值。**P<0.01(相对于在未导入基因的情况下获得的人皮肤成纤维细胞有显著差异)。值为平均值±S.D.(n＝4)。
用ROOct4L感染的正常的人皮肤成纤维细胞和用Oct4L感染的正常的人皮肤成纤维细胞都可以表达成骨细胞特异的基因。
(34)通过直接重编程，从正常的人牙龈成纤维细胞诱导的人成骨细胞的特性(图37)
以与图18中相同的方式，将人成纤维细胞和通过将ROOct4L导入人成纤维细胞，然后培养所述细胞而诱导的成骨细胞(dOB)移植至NOD/SCID小鼠股骨的人造骨缺损部位。三周之后，收集股骨，制备组织切片并进行HE染色。基于切片的组织学图像，测量缺损形成区域的长轴方向的距离和骨痂形成区域的距离以根据下述表述计算“骨痂形成的％”：骨痂形成的％＝骨痂形成区域的距离与缺损形成区域长轴方向的距离的比率(％)。值为平均值±S.D。**P<0.01。
(35)移植至活体的dOB产生骨基质并直接有助于骨再生(图38)。
利用逆转录病毒载体向通过向正常的人牙龈成纤维细胞导入ROOct4L，然后培养所述细胞而诱导的成骨细胞(dOB)中导入GFP基因。以与图18中相同的方式，将细胞移植至NOD/SCID小鼠股骨的人造骨缺损部位(右)。作为阴性对照，仅向NOD/SCID小鼠股骨的人造骨缺损部位移植基质胶(左)。三周之后，收集股骨，制备组织切片，并用抗人骨钙蛋白抗体(不与小鼠OC反应)和DAPI进行免疫染色。在移植有dOB的组中，在骨缺损部位观察到了骨痂的明显形成，并且移植的dOB在骨痂部位的骨边缘移植成功。此外，测定骨痂部位和骨痂部位的骨边缘中的人骨钙蛋白。前述表明与生理学上的骨再生相同，移植的人dOB在骨痂部位的骨边缘移植成功。此外，前述显示通过产生的人骨基质，dOB直接有助于骨痂的形成。
(36)利用质粒载体，通过基因导入，人成纤维细胞可以被重编程为成骨细胞(图39a和图39b)。
如下所述构建质粒载体pCX.OXL(图39a)。将嵌合蛋白的表达单元并入质粒载体pCX，所述嵌合蛋白的表达单元包含：从N端按照Oct4、Osterix和L-myc的顺序连接的三种基因；和在Oct4和Osterix之间以及Osterix和L-myc之间插入的自切割的2A肽。通过电穿孔(Neon)(中间)或脂质转染(X-tremeGene9)(右)方法将pCX.OXL导入正常的人皮肤成纤维细胞，并将细胞在诱导培养基中培养28天。将细胞和在未导入基因的情况下获得的正常的人皮肤成纤维细胞(左)进行茜素红S染色(上方)和冯库萨染色(下方)(图39b)。发现当利用质粒载体，通过基因导入将Oct4、Osterix和L-myc三种因子导入时，成纤维细胞转化为能够产生大量钙化的骨基质的成骨细胞。
(37)利用质粒载体，通过基因导入，人成纤维细胞可以被重编程为成骨细胞(图40a和图40b)。
如下所述构建质粒载体pCX.XLO(图40a)。将嵌合蛋白的表达单元并入质粒载体pCX，所述嵌合蛋白的表达单元包含：从N端按照Osterix、L-myc和Oct4的顺序连接的三种基因；和在Osterix和L-myc之间以及L-myc和Oct4之间插入的自切割的2A肽。通过电穿孔(Neon)方法，将pCX.XLO和pCX.OXL(图39a)导入正常的人皮肤成纤维细胞，并将细胞在诱导培养基中培养28天。将细胞和在未导入基因的情况下获得的正常的人皮肤成纤维细胞(左)进行茜素红S染色(图40b)。发现当利用质粒载体导入Oct4、Osterix和L-myc三种因子时，转化为成骨细胞的效率根据表达单元中三种基因的排列顺序而变化。在pCX.OXL情况下的效率高于pCX.XLO情况下的效率。
(38)在不含外源蛋白的培养基中，人成纤维细胞可以被重编程为成骨细胞(图41)。
通过电穿孔(Neon)方法，将如图39a所示构建的pCX.OXL导入正常的人皮肤成纤维细胞中。在那之后，在不含胎牛血清但含有2％的人血清的骨诱导性培养基中培养细胞。五天之后，以与图5中所示的相同方式将细胞进行ALP染色(图41)。发现在不含外源蛋白的培养基中，人成纤维细胞能够被重编程为成骨细胞。
(39)在不含外源蛋白的培养基中，通过直接重编程从人成纤维细胞诱导的人成骨细胞可以以冷冻状态保存(图42)。
通过电穿孔(Neon)方法，将如图39中所示构建的pCX.OXL导入正常的人皮肤成纤维细胞。培养14天之后，用液氮冷冻部分细胞，在冰箱中在-80℃保存，第二天解冻，并另外培养5天(右)。在不进行冻融的情况下培养其它部分细胞(中间)。利用WST8，将那些细胞和在未导入基因的情况下获得的正常的人皮肤成纤维细胞(左)进行四唑盐分析以量化细胞的活力(图42)。发现即使当将通过直接重编程从人成纤维细胞诱导的成骨细胞进行冻融时，活力未显著下降。
Claims (10)
1.从哺乳动物的体细胞制备成骨细胞的方法，所述方法包括向所述体细胞中导入重编程相关基因或其表达产物，
所述重编程相关基因包括选自Oct家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
2.从哺乳动物的体细胞制备成骨细胞的方法，所述方法包括向所述体细胞导入骨相关基因或骨相关基因的表达产物以及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，
所述骨相关基因包括选自Runx2(R)、Osterix(O)和Dlx5(D)中的至少一种，
所述重编程相关基因包括选自Oct家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述体细胞包括成纤维细胞或牙龈细胞。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述重编程相关基因或其表达产物包括Oct4。
5.如权利要求4所述的制备成骨细胞的方法，其中待被导入所述体细胞的重编程相关基因或其表达产物包括Oct4、Oct4L、Oct4M、Oct4LM、Oct4LGlis1和Oct4LMGlis1之一，其中M代表“c-Myc”，以及L代表“L-Myc”。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中待被导入所述体细胞的骨相关基因或骨相关基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述中的一种组合：Oct4、Oct4LMGlis1、RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML、DOct4ML、RODOct4M、ODOct4L、OOct4ML、OOct4L、OOct4M、ODOct4、DOct4L、Oct4ML、RODOct4ML、RDOct4ML、ODOct4ML、OOct4MLGlis1、RDOct4M、ROct4LGlis1、ROct4ML、ODOct4M、OOct4LGlis1、RODOct4、ROOct4M、ROOct4L、ROOct4、OOct4Glis1、RDOct4、Oct4LGlis1、DOct4M、DOct4Glis1、OOct4、Oct4L、Oct4M、DOct4、ROOct4K、ROOct4Sox2以及ROOct4Lin28，其中R代表“Runx2”，O代表“Osterix”，D代表“Dlx5”，M代表“c-Myc”，以及L代表“L-Myc”。
7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中待被导入所述体细胞的骨相关基因或骨相关基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述中的一种组合：RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML、DOct4ML、RODOct4M、ODOct4L、OOct4ML、OOct4L、OOct4M、ODOct4、DOct4L以及Oct4ML，其中R代表“Runx2”，O代表“Osterix”，D代表“Dlx5”，M代表“c-Myc”，以及L代表“L-Myc”。
8.如权利要求2或3所述的方法，其中待被导入所述体细胞的骨相关基因或骨相关基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自RODOct4L、RDOct4L、ROOct4ML和DOct4ML中的一种组合。
9.成骨细胞，其来源于哺乳动物的体细胞，并且其包含重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，
所述重编程相关基因包括选自Oct4、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
10.成骨细胞，其来源于哺乳动物的体细胞，并且其包含骨相关基因或骨相关基因的表达产物以及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，
所述骨相关基因包括选自Runx2(R)、Osterix(O)和Dlx5(D)中的至少一种，
所述重编程相关基因包括选自Oct4、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin-28和Sox2中的至少一种。
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