CN105555794A

CN105555794A - 涉及核酸-蛋白质复合物的组合物和方法

Info

Publication number: CN105555794A
Application number: CN201480045714.2A
Authority: CN
Inventors: M·A·库萨; W·P·翁
Original assignee: Harvard College; Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Harvard College; Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2016-05-04
Also published as: CA2917435A1; EP3019514A1; WO2015006626A1; US20160279257A1; JP2016523978A; US10876177B2; EP3019514A4; AU2014287071A1

Abstract

提供了涉及在维持蛋白质活性的条件下缀合核酸与目标蛋白质的方法和组合物。核酸-蛋白质缀合物可用于核酸纳米结构诸如使用DNA折叠法产生的那些核酸纳米结构中。

Description

涉及核酸-蛋白质复合物的组合物和方法

相关申请

本申请要求2013年7月10日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSRELATINGTONUCLEICACID-PROTEINCOMPLEXES”的美国临时申请号61/844,818的权益，其完整内容通过引用并入本文。

联邦政府资助的研究

本发明是在美国国立卫生研究院授予的DC002281下由美国政府资助进行的。美国政府具有本发明的某些权利。

发明背景

DNA已成为所选择的用于构建自组装纳米结构的支架。随着用于这些结构的程序图形化的技术已取得进展，现在可能产生复杂的组装体(LinkoandDietz,Curr.Opin.Biotechnol.24:555-561,2013)。为了利用这些结构元件并将它们制成功能性纳米机器，常常需要在非常特异的位点上掺入蛋白质(Niemeyer,TrendsinBiotech20:395-401,2002)。遇到的阻碍是将目标蛋白质偶联于DNA的成功方法。常规用于将蛋白质连接于寡核苷酸(寡聚物)的化学过程包括二硫键联和硫醇-伯胺键联(CecconiC.等,Eur.Biophys.J.37(6):729-38,2008)；Halvorsen等,Nanotechnol.22:494005-494012,2011；NiemeyerandSacca,Chem.Soc.Rev.40:5910-5921,2011)。虽然这些化学过程有时是有效的，但它们与生物学中常见的官能团反应。因此当目标蛋白质具有内源半胱氨酸时或当想要附接于特定的伯胺(除了N末端以外，每个赖氨酸提供伯胺)时，不能使用这些技术。为了克服许多的这些问题，研究小组已着手开发生物正交技术诸如无铜点击化学(Gordon等，J.Am.Chem.Soc.134:9199-9208,2012)。虽然这些技术克服了特异性和化学计量的问题，但它们遭受面向所有3种技术的问题。所有这些技术需要在亚最佳的生理条件下进行反应。由于长期处于室温、氧化/还原条件或高/低pH条件下，当利用许多在这些条件下不是非常热稳定的并且具有聚集和/或从溶液沉淀出来的倾向的蛋白质进行作用时这些化学过程开始失效。除了关于这些化学过程的障碍以外，必需针对不同的蛋白质谨慎地改变条件，并且不存在选择性纯化出所需产物的方法。

发明概述

本公开内容部分地提供用于将核酸缀合于蛋白质的新型和稳健的方法，所述方法克服了现有技术的缺点。这些方法前置待对核酸(包括寡核苷酸)和小(通常合成的)肽进行的化学过程。这样的核酸和肽对于可用于进行本公开内容中涉及的某些化学过程的非生理条件通常是更加耐受的。

本公开内容提供了两步法及其变型，其包括首先将核酸(例如，DNA)缀合于短的通常合成的肽，以形成核酸-肽缀合物，随后使用转肽酶(例如，分选酶)反应将核酸-肽缀合物缀合于目标蛋白质。两步法的至少一个有利方面是将蛋白质与不利的反应环境分离的能力，所述不利的反应环境可能降低所述蛋白质的活性。通过该两步法，在第一步骤中使用这些不利的反应条件，并在第二步骤中引入所述蛋白质。

因此，在一些情况下，本公开内容的方法包括将核酸(诸如寡核苷酸)缀合于包含一个或多个连续的N-末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列包含3个连续的N末端甘氨酸残基。氨基酸序列通常被包含在短肽(通常为合成肽)中。N-末端GGG基序由本公开内容的方法中使用的分选酶识别。

氨基酸序列还可包含可用于纯化目的的额外氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中可被称为纯化标签或亲和标记，并且包括但不限于His-标签和Flag序列(或Flag标签)，其氨基酸序列在本领域中是已知的并且提供于本文中。

寡核苷酸至肽的缀合可使用例如生物正交铜催化点击化学反应来实现。待缀合于肽的寡核苷酸可包含叠氮化物。叠氮化物可位于3'末端或5'末端，或者它可以是内部的叠氮化物。待被缀合的肽可包含炔烃，其用作互补点击试剂。或者，所述肽可包含叠氮化物并且所述寡核苷酸可包含炔烃。应当理解，可使用其它缀合方法来实现核酸至肽的缀合。例如，该第一步骤还可使用磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)将胱氨酸(肽中的)偶联于胺官能化的寡核苷酸来实现。

该第一反应步骤的所得产物是缀合于包含一个或多个(例如3个)甘氨酸残基和任选地纯化标签诸如(但不限于)Flag氨基酸序列的氨基酸序列(即，肽)的核酸(例如，寡核苷酸)。偶联于肽的核酸可以被移除(例如，与其它反应物分离)和任选地通过利用纯化标签从反应混合物中纯化。一种方法是使用珠粒诸如磁珠，或基于柱的珠浆体，其中的任一种包含结合纯化标签的针对纯化标签的结合伴侣(例如，所述结合伴侣可以是特异于所述纯化标签的抗体)。

氨基酸序列还可含有额外的可切割序列。这样的序列可在酶存在的情况下或通过另一种机制被切割。这样，将缀合的核酸与其它反应物分离后，可从缀合的核酸除去纯化标签，只留下随后可接近第二步骤中所使用的分选酶的一个或多个(例如3个)末端甘氨酸残基。在一些实施方案中，酶可切割的氨基酸序列可由烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割。可由TEV蛋白酶切割的氨基酸序列的实例是包含ENLYFQ(SEQIDNO：1)的氨基酸序列。或者，可切割的序列可通过非酶促方法(例如，光)切割。可切割的序列通常位于纯化标签与一个或多个(例如3个)甘氨酸残基之间。

在方法的第二步骤中，所得的缀合于一个或多个(例如，3个)末端甘氨酸残基的核酸随后与目标蛋白质反应。目标蛋白质可天然地含有还是分选酶或另一种转肽酶的靶序列的氨基酸序列，或者可选择地所述蛋白质可被工程化以含有这样的氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中可被称为分选酶(或转肽酶)靶序列。

分选酶靶序列的一个实例为LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)，其中X和X’是独立选择的氨基酸，并且n为大于0的任何数值或任何数值的范围，包括例如1-90、1-99或1-100。X’_n从而意欲表示所述氨基酸序列可在一个末端含有任意数目的氨基酸残基(即，n个数目的X’氨基酸残基，其中每个X’氨基酸残基独立地选自每个其它X’氨基酸残基，其中n可以为1-100，或1-99或1-90，或其间的任何数值)。一个这样的序列为LPETGX’_n(SEQIDNO:3)，其中X’为氨基酸并且n为大于0的任何数值或任何数值的范围，包括例如1-90、1-99或1-100。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可互换使用。还应理解，X和X’可以是本文中所述的任何实施方案中的任何氨基酸。如本文中所述，分选酶靶序列还可包含纯化标签。

目标蛋白质与寡核苷酸-肽缀合物之间的反应在分选酶或另一种转肽酶存在的情况下发生。在一些实施方案中，所述分选酶为分选酶A。在一些实施方案中，所述分选酶为分选酶A的进化变体，诸如由Chen等,PNAS108:11399-11404,2011所描述的。术语“分选酶”和“分选酶类”在本文中可互换使用。分选酶执行缀合于核酸(通过缀合的肽)的甘氨酸残基与存在于目标蛋白质中或缀合于目标蛋白质的分选酶靶序列中的甘氨酸残基的换位。

该第二反应的产物是通过氨基酸接头缀合于目标蛋白质的核酸。所述氨基酸接头可具有LPXTG_n(SEQIDNO:17)的序列，其中n表示G残基的数目并且是大于0的任何数值或任何数值的范围。在一些实施方案中，所述氨基酸接头可具有LPXTGGG(SEQIDNO:9)的序列。在一些实施方案中，所述氨基酸接头可具有LPETG_n(SEQIDNO:4)的序列，其中n表示G残基的数目并且是大于0的任何数值或任何数值的范围。在一些实施方案中，所述接头具有LPETGGG(SEQIDNO:5)的序列。

随后可使用例如珠粒或其它基于亲和力的方法纯化该最终的缀合产物。这样的纯化可使得将核酸-蛋白质缀合物与其它反应组分诸如分选酶、TEV酶和/或在分选酶介导的换位后从蛋白质释放的任何氨基酸序列分离。此情形通过在分选酶介导的作用后纯化标签的差异使用或存在来实现。例如，可将反应组分诸如分选酶、TEV酶和/或在分选酶介导的换位后从目标蛋白质释放的氨基酸序列缀合于纯化标签，并且该标签可用于从最终的目标缀合产物除去这些组分。在优选实施方案中，将待例如从终产物除去的所有组分缀合于相同的纯化标签。适合的纯化标签包括His-标签(例如，6His残基，(SEQIDNO:6))或包含DYKDDDDK(SEQIDNO:7)或由其组成的Flag氨基酸序列。这样的纯化步骤可用于使目标核酸-蛋白质缀合物/复合物不含任何副产物和反应物。

因此，在一个方面，本公开内容提供了方法，所述方法包括在分选酶存在的情况下，将(1)缀合于包含一个或多个N末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸(例如，DNA)与(2)包含LPXTGX’n(其中X和X’是任意独立选择的氨基酸并且n为范围1-99内的任何数值)(SEQIDNO:8)的C末端氨基酸序列的蛋白质反应，以形成包含通过具有LPXTGGG(SEQIDNO:9)的氨基酸序列的氨基酸接头共价缀合于蛋白质的核酸的复合物，其中X为任意氨基酸。接头和核酸可存在于缀合后的目标蛋白质的C末端上或其附近。

在另一个方面，本公开内容提供了方法，所述方法包括在分选酶存在的情况下，将(1)缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸(例如，DNA)与(或用)(2)包含LPETGX_n(其中X是氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围)(SEQIDNO:10)的末端氨基酸序列的蛋白质反应，以形成包含通过具有LPETGGG(SEQIDNO:5)的氨基酸序列的氨基酸接头共价缀合于蛋白质的核酸的复合物。在一些实施方案中，“n”在长度上可以是1-99个氨基酸。在一些实施方案中，“n”为大于1的数值。

在一些实施方案中，分选酶和包含LPETGX_n(SEQIDNO:10)的末端例如C末端氨基酸序列的蛋白质各自包含His-标签。在目标蛋白质的情况下，可将His标签提供在分选酶靶序列的X_n(或X’_n)氨基酸序列中或作为其部分。

在一些实施方案中，通过核酸与包含一个或多个优选3个G残基的肽之间的生物正交铜催化的点击化学反应形成缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，所述生物正交铜催化的点击化学反应形成缀合物(其在本文中可被称为核酸中间产物)，其包含缀合于包含一个或多个甘氨酸(G)残基和任选纯化标签(诸如但不限于Flag序列)以及还任选地可切割的氨基酸序列(诸如但不限于TEV靶(切割)序列，优选地位于G残基与纯化标签之间)的氨基酸序列的核酸。

所述方法从而还可包括从核酸中间产物切割纯化标签，以使得甘氨酸残基可接近分选酶。例如，在一些实施方案中，所述方法还包括将核酸中间产物与TEV蛋白酶反应。在一些实施方案中，将TEV蛋白酶缀合于His-标签。His-标签可以是包含6个组氨酸残基或由其组成的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。

在另一个方面，本发明提供了包含通过具有LPETGGG(氨基至羧基)或GGGTEPL(羧基至氨基)(SEQIDNO:5)的氨基酸序列的氨基酸接头共价缀合于蛋白质的核酸的复合物。在附图中举例说明了该接头在核酸与目标蛋白质之间的放置。

在一些实施方案中，所述蛋白质是天然存在的蛋白质并且所述分选酶靶序列或接头序列诸如如上定义的LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)或LPETGGG(SEQIDNO:5)不存在于天然存在的蛋白质中。

在一些实施方案中，所述核酸的长度为1-100个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸在缀合至肽之前包含DNA或由其组成。

在另一个方面，本发明提供了包含分离形式的任何前述复合物或缀合物的组合物，无论这样的复合物或缀合物是中间产物还是终产物。因此，本公开内容提供了各自包含缀合于肽的核酸的一种或多种缀合物，其中所述肽包含一个或多个(例如，3个)甘氨酸。这些缀合物可在它们的核酸序列上彼此相异，但可具有相同的氨基酸序列。本公开内容类似地提供了各自包含分选酶靶序列诸如上文中定义的LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)的一种或多种不同的蛋白质。本公开内容类似地提供了用于制备核酸-蛋白质复合物或缀合物的多种前述核酸-肽缀合物和蛋白质。本公开内容还提供了各自包含通过具有LPXTGGG(SEQIDNO:9)的氨基酸序列的氨基酸接头缀合于蛋白质的核酸的一种或多种缀合物。这些缀合物可在它们的核酸序列和/或它们的氨基酸序列上彼此不同。因此，它们可具有相同的核酸序列，或它们可具有相同的氨基酸序列，或它们可具有不同的核酸和氨基酸序列。因此，本公开内容提供了各自呈分离形式的多个任何前述复合物或该群体为分离形式(任选地文库形式)。

在另一个方面，本发明提供了包含以下的两种或更多种的任意组合的组合物：缀合于包含末端甘氨酸(G)残基(包括3个G残基)的氨基酸序列的核酸、包含LPXTGX’_n(其中X和X’是独立选择的氨基酸并且n为大于0的任何数值或任何数值的范围，包括例如1-90、1-99或1-100)(SEQIDNO:2)的末端氨基酸序列的蛋白质、分选酶和TEV蛋白酶。

在另一个方面，本发明提供了包含以下的两种或更多种的任意组合的组合物：缀合于包含末端甘氨酸(G)残基(包括3个G残基)的氨基酸序列的核酸、包含具有LPETGX’_n(其中X’为氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围，优选地1-99)(SEQIDNO:10)的末端氨基酸序列的蛋白质、分选酶和TEV蛋白酶。在一些实施方案中，n为大于1的数值。

在一些实施方案中，将蛋白质、分选酶和TEV蛋白酶的任一种或任何组合缀合于纯化标签，诸如但不限于His-标签。在一些实施方案中，His-标签被包含在蛋白质的或缀合于蛋白质的分选酶靶序列的X_n(或X’_n)氨基酸序列中。在一些实施方案中，所述组合物还包含特异性结合His-标签的珠粒(抗-His珠粒)。

在一些实施方案中，n为1至100或1至99或1至90的任何数值或任何数值的范围。在一些实施方案中，His-标签为6个组氨酸残基的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。

随后可将核酸-蛋白质复合物或缀合物与核酸纳米结构诸如但不限于DNA折叠(origami)纳米结构一起使用，或掺入所述核酸纳米结构中。这可通过将缀合物的核酸部分与核酸纳米结构杂交，包括杂交至DNA折叠结构中的应变支架(scaffoldstrain)来实现。或者，可将核酸-肽中间产物掺入核酸纳米结构中，并可在形成核酸纳米结构后缀合蛋白质。

在一些情况下，根据本文中提供的方法形成的核酸-蛋白质复合物或缀合物的比活性为未缀合和未操作形式的蛋白质的比活性的至少75％、至少85％、至少95％或约100％。因此，本文中提供的缀合方法不显著影响进行操作的蛋白质的活性。

应当理解，前述概念和下文中更详细论述的另外概念的所有组合(前提是这样的概念不是相互矛盾)预期为本文中公开的本发明的主题的部分。具体地，在本公开内容末尾出现的所要求保护的主题的所有组合预期为本文中公开的本发明的主题的部分。

附图概述

图1.产生三-甘氨酸(GGG)寡核苷酸前体的点击化学。通过铜(I)催化的点击化学将定制肽(DYKDDDDKENLYFQGGG-Pra,SEQIDNO:12)连接于具有叠氮化物修饰的合成寡核苷酸。

图2.用于除去催化Cu(I)和过量未偶联的肽的QiagenPCR清除试剂盒。通过Qiagen试剂盒运行反应产物允许偶联的和未偶联的寡聚物的分离。如图中所提供的，随后可通过其纯化标签将偶联的寡核苷酸与未偶联的寡核苷酸分离。过量的肽和铜将保留在膜上和/或在洗涤步骤中被除去。

图3.通过纯化标签除去未偶联的寡核苷酸。将Qiagen核苷酸去除试剂盒的产物结合于商购可得的抗-Flag珠粒除去未偶联的寡核苷酸，从而仅留下所需的三-甘氨酸寡核苷酸前体(或寡核苷酸-肽缀合物)。利用Flag肽的洗脱从亲和基质释放寡核苷酸。

图4.TEV切割和举例说明过量的未偶联的寡核苷酸的去除的有效性和TEV切割的效率的聚丙烯酰胺凝胶。可将TEV蛋白酶(月牙形)用于切割Flag纯化标签，从而导致具有分选酶相容性GGG-肽的寡核苷酸。凝胶的脉道如下：B为结合于抗-Flag珠粒后的上清液；W1-W6为洗涤物1至6；E1和E2为洗脱物1和2；并且最左边的泳道为Bio-Rad20bp分子标尺。TEV-前和-后分别指TEV切割之前和之后。

图5.蛋白质-DNA杂合体的分选酶催化产生。举例说明由矩形指示的两个甘氨酸残基的换位的分选酶偶联方案。将含LPETG的蛋白质(LPETG为SEQIDNO:4)(在此情况下为CDH23EC1+2)通过分选酶偶联于Gly–Gly–Gly-寡核苷酸。分选酶将由矩形突出显示的两个甘氨酸残基换位，从而导致蛋白质与Gly–Gly–Gly-寡聚物之间的肽键形成。分选酶首先结合LPX₁TGX₂(SEQIDNO:2)序列。在此情况下，蛋白质上的C末端最后一个甘氨酸之后的序列为His-标签(SEQIDNO:6)。所得的缀合物包含LPETGGG接头(SEQIDNO:5)。

图6.反应物和催化剂的去除。在完成核酸至目标蛋白质的偶联后，最终的缀合物与TEV蛋白酶、分选酶和过量的未反应的目标蛋白质一起存在。在此实例中，所有反应物含有相同的纯化标签(即，His-标签)，从而它们可使用抗-His珠粒来捕获和除去，从而在上清液中仅留下最终的所需核酸-蛋白质缀合产物。作为换位反应的一部分，分选酶选择性地从终产物切除His-标签。LPETG为SEQIDNO:4；LPETGGG为SEQIDNO:5。

图7A-F.用于形成二元DNA纳米开关的方法。线性化的M13单链DNA(每个图中的底部实线)、互补寡核苷酸(与实线相邻的较短的线)、CDH23EC1+2(在图C中引入的)和PCDH15EC1+2(在图E中引入的)。(A至B)官能化的和未官能化的寡核苷酸对M13ssDNA支架的退火。(B至C)将分选酶用于将含有LPETG(SEQIDNO:4)的CDH23片段(参见本文中第2.4.4节)连接于Gly–Gly–Gly-修饰的寡核苷酸。另一个寡核苷酸通过用Flag-TEV序列封闭N末端来进行保护(参见本文中的第2.1节)。(C至D)在成功偶联后，将TEV蛋白酶用于使第二Gly–Gly–Gly-寡聚物脱保护，从而引发其用于分选酶偶联(参见本文中的第2.4.4e节)。(D至E)随后将分选酶再次用于附接含有LPETG(SEQIDNO:4)的PCDH15片段(参见本文中的第2.4.4k节)。(E至F，且反之亦然)在CDH23与PCDH15结合后，DNA-纳米开关关闭。还可通过例如在将寡聚物与M13支架热退火之前单独地对个体寡核苷酸执行基于分选酶的偶联反应来将热稳定性蛋白质附接于DNA折叠支架，从而避免对保护性Flag-标签的需要(2.3)。

图8.蛋白质-DNA偶联的SDS–PAGE验证。本实验中的成功偶联需要包含LPETG序列(SEQIDNO:4)的蛋白质、GGG-寡聚物、分选酶和二价阳离子(主要地Ca²⁺)的存在。只有当所有必需组分存在(表格的最后两栏)时，偶联的产物才可被检测到。

发明详述

本公开内容提供了涉及核酸-蛋白质复合物(在本文中也可互换地称为核酸-蛋白质缀合物或寡核苷酸-蛋白质缀合物)的组合物和方法。本公开内容提供了合成这样的复合物的方法，使用这样的复合物的方法，和复合物自身的组合物，以及包含合成过程中的中间产物(包括中间复合物或缀合物)的组合物。

本文中提供的合成方法适合于将核酸诸如寡核苷酸缀合至目标蛋白质。这样的蛋白质缀合的核酸随后可用于纳米技术应用诸如但不限于可寻址纳米结构中。

本文中公开的是用于将蛋白质共价偶联于DNA而对蛋白质功能具有最小限度扰乱的基于分选酶的一般性方案。将两步骤法用于实现该目的。首先，使用点击化学将小的合成肽生物正交地及共价地偶联于DNA寡核苷酸。随后，使用分选酶在蛋白质-相容性条件下将DNA-肽嵌合物共价连接于目标蛋白质。所述方案允许功能性DNA-蛋白质杂合体的简单偶联和纯化。

作为示例性应用，将此技术用于形成具有钙粘蛋白-23的寡核苷酸和连接于原钙粘蛋白-15的寡核苷酸。在并入线性M13支架(通过例如DNA折叠技术)中后，蛋白质-DNA杂合体诸如此示例性杂合体用作二元纳米开关的门控，如在本文中更详细描述的。

所公开的方案是可靠的和模块化的，从而有利于官能化寡核苷酸(即，最少偶联于一个或多个(例如，3个)连续甘氨酸的寡核苷酸)和蛋白质(即，包含分选酶靶序列的蛋白质)的文库的构建，所述官能化寡核苷酸和蛋白质可被组合以形成功能性DNA-蛋白缀合物和在一些情况下纳米结构。这些结构将使得能够产生可用于治疗和工业过程的一类新的功能性纳米结构。

所公开的方案从而面临现有技术方法的各种挑战。为了保持蛋白质功能，在生理条件下进行蛋白质-DNA偶联。在公开的两步法中，首先将小的合成肽偶联于DNA寡核苷酸。随后，通过使用分选酶(Chen等,PNAS108:11399-11404,2011；Popp等,NatChemBiol3:707-708,2007)，将所选择的蛋白质在生理条件下偶联于DNA-肽嵌合物。此策略前置所有蛋白质不相容化学过程，以使得对寡核苷酸和合成肽进行其，所述寡核苷酸和合成肽对非生理条件耐受得多。

分选酶将一个蛋白质的N末端共价连接于另一个蛋白质的C末端附近的位置。分选酶识别N末端GGG和C末端LPXTGX’n(SEQIDNO:2)，其中X和X’可以是任何独立选择的氨基酸，并且n可以是任何数目的氨基酸，包括例如1-99个氨基酸。分选酶随后促进甘氨酸残基在两个蛋白质中的换位，从而导致两个蛋白质之间的共价键联和GX’n的释放。

分选酶的使用还可用于促进纯化，因为寡核苷酸的偶联可伴随亲和标签的去除。下文中详述的方案允许使用商购可得的纯化树脂来产生不含任何副产物和反应物的所选择的产物。此技术可用于产生寡核苷酸和蛋白质的文库，以使得文库中的任何蛋白质可在沿着DNA折叠支架诸如M13核酸的任何地方容易且可靠地附接。

本公开内容考虑了使用分选酶技术来产生用于自组装纳米结构的DNA-蛋白质杂合体。为了证明该技术的效用，二元DNA-纳米开关形式的简单DNA-蛋白质纳米机构(Halvorsen等,Nanotechnology22:494005-494012,2011)通过蛋白质钙粘蛋白-23(CDH23)与原钙粘蛋白-15(PCDH15)的相互作用对(Kazmierczak等,Nature449:87-91,2007；Sotomayor等,Nature492:128-132,2012)来进行门控。此自组装机械开关改变状态以报告生物分子键的形成或断裂(例如，当CDH23结合于PCDH15时，开关关闭，否则则打开)。CDH23共价地连接于与DNA支架(M13)中离支架的一个边缘1/3处杂交的寡核苷酸，并且PCDH15连接于与DNA支架中离支架的另一个边缘1/3处杂交的寡核苷酸(图7)。结果是具有3μm的末端-对-末端长度(当蛋白质不相互作用时)和2μm的末端-对-末端长度(当蛋白质相互作用时)的纳米开关。这两种状态可通过凝胶电泳来分辨，如由Halvorsen等,Nanotechnology22:494005-494012,2011所描述的。

所述合成方法描述于下文中。

在第一步骤中，将合成的寡核苷酸连接于小的合成肽(其两者都是商购可得的)。在一个实例中，使用生物正交铜(I)催化的点击化学反应(图1)来进行缀合。随后可使用例如商购可得的试剂盒和纯化树脂来除去催化铜和过量试剂(图2和3)。

可将小的合成肽的区域用于纯化目的。如果其存在，则随后可通过酶促或非酶促切割反应来除去其。如图4中举例说明的，在一个实例中，肽序列包含纯化标签、酶可切割序列和GGG序列。利用靶向可切割序列的蛋白酶诸如从烟草蚀纹病毒(TEV)分离的蛋白酶的温育产生共价地附接于三-甘氨酸氨基酸序列的寡核苷酸。

此寡聚物-肽杂合体(或复合物)随后可共价地连接于具有C末端LPXTGX’_n氨基酸序列诸如LPETGX’_n氨基酸序列的任何蛋白质，其中X和X’代表任何独立选择的氨基酸，并且n为大于0的数值，以使得X’_n代表一个或多个氨基酸，包括但不限于例如在1-90的范围内的任何数目的氨基酸(分别为SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)。在分选酶存在的情况下，图5中用矩形标示的两个甘氨酸残基(其中的一个在附接于目标蛋白质的肽序列中，并且其中的一个在附接于寡核苷酸的肽中)被换位，从而导致所述寡核苷酸与所述蛋白质的共价连接，以及甘氨酸-X’肽的切割。

如果X’被选择为6-组氨酸残基(His-标签)(SEQIDNO:6)(对于蛋白质纯化通常如此)，则系统具有内置纯化方案。如果目标蛋白质、TEV蛋白酶和分选酶全都具有His-标签，并且分选酶反应选择性地从终产物切掉His-标签，则在商购可得的抗His珠粒上洗涤反应产物导致仅含有所需产物的上清液(图6)。

本公开内容提供了包含通过氨基酸接头共价缀合于蛋白质的核酸的复合物。所述氨基酸接头可具有LPXTG_n(N至C的顺序)(SEQIDNO:17)的氨基酸序列，其中X为任意氨基酸，并且n为1个或多个。所述氨基酸接头可具有LPETG_n(N至C的顺序，SEQIDNO:4)的氨基酸序列，其中n为1个或多个。在优选实施方案中，n为3，并且所述接头具有LPETGGG(SEQIDNO:5)的氨基酸序列。所述复合物具有如下结构：

核酸–GGGTEPL–目标蛋白质–NH₂,

其中NH₂是指目标蛋白质的氨基末端。换句话说，所述蛋白质通过接头经由其羧基末端缀合于核酸。这在图中进行了举例说明。对于本领域普通技术人员很显然的是，如所举例说明的，GGGTEPL序列为C至N的方向(SEQIDNO:5)。在其它实施方案中，蛋白质可通过其氨基末端缀合于接头。

核酸可为任意长度。其长度可根据复合物的最终用途来指定。因此，在一些情况下，当需要较短的核酸时，所述核酸可以是长度在1-1000、1-500、1-100、1-50的范围内或其间的任何范围内的寡核苷酸。所述核酸可天然存在或非天然存在。可从天然来源，或通过使用例如自动化寡核苷酸合成仪合成来制备其。所述核酸可包含天然存在的核苷酸或非天然存在的核苷酸。它们可包含天然存在的主链键联或非天然存在的主链键联。所述核酸可包含DNA或由DNA组成。

目标蛋白质可以实际上是任何蛋白质，包括天然存在的蛋白质和非天然存在的蛋白质(诸如例如工程蛋白质)。所述蛋白质可天然地含有分选酶靶序列(其实例为LPETG_n(氨基至羧基序列)(或GnTEPL羧基至氨基序列(SEQIDNO:4))。另一个实例为LPETGGG序列(SEQIDNO:5)。所述蛋白质可附接于LPXTG_n序列，包括LPETG_n序列(分别为SEQIDNO:17和SEQIDNO:4)，包括LPETGGG(氨基至羧基)序列(SEQIDNO:5))。这些序列的取向示于图中。该附接可在合成后或在合成过程中发生。所述蛋白质可以是抗体、包含抗原结合抗体片段的抗体片段、细胞粘附蛋白诸如CAM、整联蛋白、钙粘蛋白等、转录因子、配体受体、配体、信号转导蛋白、激素、细胞因子、白细胞介素、趋化因子等。

本公开内容从而提供了包括将核酸与包含一个或多个且优选至少3个连续甘氨酸残基的肽反应的方法。在一些实施方案中，使用生物正交铜(I)催化的点击化学反应使核酸与肽反应。在一些实施方案中，所述核酸包含叠氮化物并且所述肽包含炔烃。或者，所述核酸可包含炔烃并且所述肽可包含叠氮化物。在另一个实施方案中，可使用磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)将含胱氨酸的肽与胺官能化的寡核苷酸反应。除了甘氨酸以外，所述肽还可包含纯化标签和位于纯化标签与甘氨酸之间的可切割的氨基酸序列。所述纯化标签可以是His-标签或Flag序列(或Flag-标签)。所述可切割的氨基酸序列可以是酶可切割的氨基酸序列诸如TEV酶靶序列。所述方法产生缀合于肽的核酸，和从而缀合于至少甘氨酸及任选地缀合于纯化标签和可切割的序列的核酸。该缀合物在本文中可被称为核酸-肽缀合物。所述方法还可包括从反应混合物分离核酸-肽缀合物。这样的分离可包括释放的Cu(I)和未偶联的肽的去除和/或偶联的寡核苷酸经由纯化标签的正选择。所述正选择可使用亲和方法诸如包含针对所述纯化标签的结合伴侣的珠粒、柱子、浆体等来实现。这样的结合伴侣可以是抗体或抗体片段。分离后，所述核酸-肽缀合物可在切割序列上被切割以释放纯化标签。这可通过将核酸-肽缀合物与酶诸如TEV蛋白酶反应来实现。所述核酸-肽缀合物随后将包含缀合于甘氨酸(其现在可接近分选酶)的核酸。随后如下所述，将缀合物与分选酶可接近的蛋白反应。

本公开内容还提供了方法，所述方法包括在分选酶存在的情况下将：

(1)将缀合于包含1个或多个(包括3个)末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸与

(2)缀合于LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)的末端氨基酸序列的蛋白质反应，其中X和X’是任何独立选择的氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围，

以形成包含通过具有LPXTGGG(N至C)或GGGTXPL(C至N)(SEQIDNO:9)的氨基酸序列的氨基酸接头共价缀合于所述蛋白质的核酸的复合物。在一些实施方案中，“n”为大于1的数值。

在一些实施方案中，所述方法包括在分选酶存在的情况下将

(1)缀合于包含一个或多个(包括3个)末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸与

(2)缀合于具有LPETGX_n(SEQIDNO:3)的末端氨基酸序列的蛋白质反应，其中X为氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围，

以形成包含通过具有LPETGGG(N至C)或GGGTEPL(C至N)(SEQIDNO:5)的氨基酸序列的氨基酸接头共价缀合于蛋白质的核酸的复合物。在一些实施方案中，“n”为大于1的数值。

分选酶和末端氨基酸可各自包含纯化标签诸如但不限于His-标签。

所述方法还可包括分离包含共价地缀合于蛋白质的核酸的复合物。这样的分离可通过使用亲和方法诸如本文所述的那些方法除去包含纯化标签(优选相同的纯化标签)的反应组分来实现。通常地，存在于分选酶靶序列中的任何纯化标签将在分选酶转位发生后被除去。因此，所述最终的核酸-蛋白质产物将在针对纯化标签的选择后存在于上清液中。

如上所述，可使用例如如本文中举例说明的生物正交铜催化的点击化学反应合成缀合于氨基酸序列的核酸。所述生物正交铜催化的点击化学反应形成包含缀合于一个或多个甘氨酸和任选地可切割的序列诸如酶可切割的序列(包括可被TEV蛋白酶(在本文中在一些情况下也称为TEV)切割的氨基酸序列)的核酸的核酸中间产物。所述TEV可切割序列在本文中可称为TEV靶序列。所述TEV靶序列可以是但不限于E-X1-X2-Y-X3-Q-(G/S)，其中X1、X2和X3代表独立地选择的氨基酸。切割通常在Q与G或Q与S之间发生。TEV靶序列的实例包括ENLYFQG(SEQIDNO:13)和ENLYFQS(SEQIDNO:14)。

可将中间产物与靶向可切割的序列的酶反应。在一个实例中，所述酶为TEV蛋白酶。可将TEV蛋白酶缀合于纯化序列诸如但不限于His-标签。

应理解，可进行本文中提供的方法而具有最少的试剂损失和从而最大的效率和产率。还可获得不含反应组分包括不含底物、中间产物、酶和副产物的复合物。

本文中提供的方法通过缀合方法维持或保持目标蛋白质的活性。在酶或具有可测量的活性的其它蛋白质的情况下，所述蛋白质维持为其原始比活性或接近所述活性的比活性。因此，核酸-蛋白质复合物或缀合物中的蛋白质的比活性为未缀合和未操作形式的蛋白质的比活性的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或约100％。可根据每mg蛋白质的活性单位定义比活性。在酶的情况下，所述活性单位可被称为酶单位，其为在针对pH和温度的特定反应条件下每单位时间被转化成产物的底物的量。

本文中提供的方法克服了现有技术的各种挑战和/或缺点。例如，本文中提供的方法不牵涉亚最佳的蛋白质反应条件，包括在室温、氧化/还原条件或非生理pH下的长时间温育。本文中提供的方法适合于非热稳定性蛋白质，所述蛋白质会另外地具有在现有技术条件下聚集和/或从溶液沉淀出来的倾向。另外，通过同时除去亲和标记而直接标记成功的反应，本文中提供的方法还促进从反应物纯化产物。这些方法还是通用的和强健的，并且可用于实际上任何蛋白质，不同于倾向于针对个体蛋白质进行优化的现有技术方法。

本公开内容还提供了分离形式的任何前述中间核酸-肽复合物或终核酸-蛋白质复合物。分离形式意指复合物与其它(包括在一些情况下所有其它)反应组分(包括底物、中间产物、副产物、酶等)是物理上分离的。

本公开内容还提供了包含以下的两种或更多种的任意组合的多种组合物：

(1)缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列诸如但不限于GGG氨基酸序列、GGG-TEV-Flag序列(其中在此上下文中的“TEV”是指TEV靶序列)或包含至少一个甘氨酸残基(和优选地3个这样的残基)、可切割的序列诸如但不限于TEV靶序列和纯化标签诸如但不限于标签诸如His-标签或Flag序列的的任何其它序列的核酸；

(2)缀合于具有LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)的末端氨基酸序列的蛋白质，其中X和X’为任何独立选择的氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围；

(3)分选酶；和

(4)TEV蛋白酶.

(1)缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列诸如但不限于GGG氨基酸序列、GGG-TEV-Flag序列(其中在此上下文中的“TEV”是指TEV靶序列)或包含至少一个甘氨酸残基(和优选地3个这样的残基)、可切割的序列诸如但不限于TEV靶序列和纯化序列诸如但不限于标签诸如His-标签或Flag序列的任何其它序列的核酸；

(2)缀合于具有LPETGX_n(SEQIDNO:3)的末端氨基酸序列的蛋白质，其中X为氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围；

(3)分选酶；和

(4)TEV蛋白酶。

在一些实施方案中，“n”为大于1的数值。

可将蛋白质、分选酶和TEV蛋白酶的任一种或任意组合缀合于纯化标签诸如但不限于His-标签或Flag-标签。可使用相同或不同的纯化序列。可将His-标签包含在缀合于目标蛋白质的X’_n氨基酸序列中。

组合物可与特异性结合于纯化标签或序列的珠粒或其它亲和基质接触。例如，所述珠粒可以是抗-His标签珠粒，因为它们在其表面上包含针对His-标签的抗体或抗体片段或其它结合伴侣。所述His-标签是包含连续组氨酸残基的氨基酸序列，包括但不限于6个组氨酸残基(SEQIDNO:6)。

如上使用的“n”可以是任何数值或任何数值范围，包括但不限于1至100或1至99，或1至90。

本公开内容还提供了在组合物中的任何上述核酸-蛋白质复合物。这些组合物和本文中提供的任何其它组合物还可包含载体，诸如但不限于药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”意指适合用于对人或由本公开内容考虑的其它受试者施用的一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。术语“载体”表示用其悬浮复合物以促进施用的有机或无机成分(天然的或合成的)。将药物组合物的组分以阻止会显著减弱它们的所需药物功效的相互作用的方式混合。所述载体可备选地为适合于体外工作但非药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本发明的组合物是无菌的，并且任选地可包含防腐剂。组合物可以是包含一个或多个容器或器皿、任选地具有说明书的试剂盒。组合物可用于体内或体外使用。

本文中提供的复合物可用于许多应用，包括例如，测量分子相互作用的动力学和在筛选测定中鉴定分子结合伴侣(从已知的或未知的候选者)。结合相互作用研究可使用许多方法来进行，所述方法包括但不限于凝胶电泳、单分子力探针诸如光镊、磁镊、绳系粒子运动、原子力显微镜(AFM)、离心力显微镜(CFM)和单分子荧光成像。应用进一步描述于公开的PCT申请WO2013/067489(其全部内容通过引用并入本文)中。

本公开内容还提供了将核酸-蛋白质复合物用于一种或多种纳米技术应用诸如但不限于核酸纳米结构中的方法。所述复合物还可用于研究结合相互作用和结合亲和力以及蛋白质-蛋白质相互作用的强度。所述复合物还可用于将蛋白质锚定于表面。

如本文中所用，“核酸纳米结构”是从个体核酸自组装的合理设计的人工(例如，非天然存在的)结构。这样的纳米结构可基于组成性核酸包括寡核苷酸的序列互补性来进行自组装。“自组装”是指核酸(以及，在一些情况下，核酸纳米结构)以序列特异性方式、以预测的方式并且在无外部控制的情况下彼此退火的能力。在一些实施方案中，核酸纳米结构自组装法包括在单个容器中组合核酸(例如，单链核酸或寡核苷酸)和使所述核酸基于序列互补性彼此退火。在一些实施方案中，该退火过程包括将核酸置于升高的温度下，随后逐渐降低温度以有利于序列特异性结合。各种核酸纳米结构或自组装方法是已知的并且在本文中进行了描述。

核酸纳米结构通常是纳米级结构(例如，具有1至1000纳米的长度尺度)，尽管在一些情况下，术语“核酸纳米结构”和“DNA纳米结构”在本文中可指微米级结构(例如，从多于一个纳米级或微米级结构组装的)。在一些实施方案中，核酸纳米结构具有1至1000nm、1至900nm、1至800nm、1至700nm、1至600nm、1至500nm、1至400nm、1至300nm、1至200nm、1至100nm或1至50nm的长度尺度。在一些实施方案中，核酸纳米结构具有大于1000nm的长度尺度。在一些实施方案中，核酸纳米结构具有1微米至2微米的长度尺度。

在一些实施方案中，核酸纳米结构从多个不同的核酸(例如，单链核酸)组装。例如，核酸纳米结构可从至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个核酸组装。在一些实施方案中，核酸纳米结构从至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个或更多个核酸组装。术语“核酸”包括“寡核苷酸”。在DNA纳米结构的上下文中，在一些实施方案中，寡核苷酸具有10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、10至40个核苷酸、10至50个核苷酸、10至60个核苷酸、10至70个核苷酸、10至80个核苷酸或10至90个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸具有20至50、20至75或20至100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸具有30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的长度。

这些核酸中的某些核酸可以是缀合于例如3个甘氨酸的、具有或不具有纯化标签的核酸。或者，这些核酸中的某些核酸可以是缀合于蛋白质的核酸。

在一些实施方案中，从单链核酸、双链核酸或单链与双链核酸的组合组装核酸纳米结构。

在一些实施方案中，核酸纳米结构可从多个异源核酸(例如，寡核苷酸)组装。“异源”核酸可在核苷酸序列上彼此不同。例如，在包括核酸A、B和C的异源多个核酸中，核酸A的核苷酸序列与核酸B的核苷酸序列不同，所述核酸B的核苷酸序列与核酸C的核苷酸序列不同。异源核酸还可在长度和化学组成上不同(例如，分离的相对合成的)。

用于设计自组装的核酸纳米结构的基本原则是：编码核酸链中的序列互补性，以使得通过配对互补区段，所述核酸链在适当的物理条件下自我组织成预定的纳米结构。在本领域中已描述了该技术。可参考例如SeemanN.C.J.Theor.Biol.99:237,1982；SeemanN.C.Nature421:427,2003；ShihW.M.等Curr.Opin.Struct.Biol.20:276,2010。此技术已被用于制备多种结构。这样的结构包括但不限于网格(参见，例如，WinfreeE.等Nature394:539,1998；YanH.等Science301:1882,2003；YanH.等Proc.Natl.Acad.ofSci.USA100；8103,2003；LiuD.等J.Am.Chem.Soc.126:2324,2004；RothemundP.W.K.等PLoSBiology2:2041,2004)、带(参见，例如，ParkS.H.等NanoLett.5:729,2005；YinP.等Science321:824,2008)、管(参见，例如，YanH.Science,2003；P.Yin,2008)、具有确定的形状的有限二维和三维物体(参见，例如，ChenJ.等Nature350:631,1991；RothemundP.W.K.,Nature,2006；HeY.等Nature452:198,2008；KeY.等Nano.Lett.9:2445,2009；DouglasS.M.等Nature459:414,2009；DietzH.等Science325:725,2009；AndersenE.S.等Nature459:73,2009；LiedlT.等NatureNanotech.5:520,2010；HanD.等Science332:342,2011)和肉眼可见晶体(参见，例如，MengJ.P.等Nature461:74,2009)。所有这些教导通过引用并入本文。

在一些实施方案中，使用核酸(例如，DNA)折叠法组装核酸纳米结构。例如，通过使用DNA折叠法，将长“支架”核酸链通过与相对较短的“钉(staple)”链的相互作用折叠成预先设计的形状。因此，在一些实施方案中，用于核酸纳米结构的组装的单链核酸具有至少500个碱基对、至少1千碱基、至少2千碱基、至少3千碱基、至少4千碱基、至少5千碱基、至少6千碱基、至少7千碱基、至少8千碱基、至少9千碱基或至少10千碱基的长度。在一些实施方案中，用于核酸纳米结构的组装的单链核酸具有500个碱基对至10千碱基或更多的长度。在一些实施方案中，用于核酸纳米结构的组装的单链核酸具有7至8千碱基的长度。在一些实施方案中，用于核酸纳米结构的组装的单链核酸包含M13病毒基因组。

在一些实施方案中，从单链块(single-strandedtile，SST)(参见，例如，WeiB.等Nature485:626,2012)或核酸“砖(brick)”(参见，例如，KeY.等Science388:1177,2012；2014年1月30日公布的国际公开第WO2014/018675A1号)组装核酸纳米结构。例如，单链2-或4-结构域寡核苷酸通过序列特异性退火以预定(例如，预测的)方式自组装成二维和/或三维纳米结构。因此，每个寡核苷酸在纳米结构中的位置是已知的。这样，可以例如通过在特定位置上添加、除去或替换寡核苷酸来修饰核酸纳米结构。还可例如通过在特定位置上附接部分(moieties)来修饰纳米结构。这可通过使用经修饰的寡核苷酸作为起始材料或通过在形成纳米结构后修饰特定寡核苷酸来实现。因此，已知每个起始寡核苷酸在所得的纳米结构中的位置为所述纳米结构提供了可寻址能力。

还可使用本公开内容的核酸缀合物，通过以受控和定向的方式放置一种或多种类型的蛋白质来修饰纳米结构。

本公开内容的一些方面涉及使用退火方法组装核酸纳米结构。在一些实施方案中，将核酸在单个容器诸如但不限于管、孔或小瓶中进行组合。所使用的核酸的摩尔量可取决于所需纳米结构中的每种核酸的频率和所需纳米结构的量。在一些实施方案中，所述核酸可以以等摩尔浓度存在。在一些实施方案中，每种核酸(例如，寡核苷酸)可以以约200nM的浓度存在。在一些实施方案中，将所述核酸置于溶液中。可对溶液进行缓冲，尽管退火反应也可在缓冲液不存在的情况下发生。所述溶液还可包含二价阳离子诸如，但不限于Mg2+。阳离子或盐浓度可变化。示例性浓度为约490mM。所述溶液还可包含EDTA或其它核酸酶抑制剂以防止核酸的降解。

在一些实施方案中，通过加热含有核酸的溶液，随后使该溶液缓慢冷却(例如，加热，随后在室温环境放置)来进行退火反应。反应的温度应当足够高以使任何不想要的二级结构诸如发夹结构解链并确保核酸不会不正确地结合于其它非互补核酸。因此，可最初将温度升高至低于或等于100℃的任何温度。例如，可最初将温度升高至100℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃或60℃。可通过将容器置于热水浴、加热块或能够控制温度的装置诸如热循环仪(例如，聚合酶链式反应(PCR)机器)中来升高温度。可将容器在该环境中保持数秒或数分钟。在一些实施方案中，约1-10分钟的温育时间是足够的。

完成在升高的温度下的核酸温育后，可以以多种方法降低温度。例如，可以使用计算机算法(其使温度降低一定量并维持该温度一定时期随后再次降低温度)以自动化方式降低温度。这样的自动化方法可包括在每个步骤中使温度降低1度或在每个步骤中使温度降低多度。从而可在同一装置中加热和冷却容器。作为另一个实例，可将加热的溶液在室温下放置以进行冷却。用于降低温度的示例性方法如下所述。为了实现温度从约80℃至降低约24℃，在每度3分钟的速率下以1度的增量(例如，80℃持续3分钟，79℃持续3分钟，等)将温度从80℃改变至61℃。随后以1度的增量并在每度约120分钟的速率下(例如，60℃持续120分钟，59℃持续120分钟，等)将温度从60℃改变至24℃。该方法的总退火时间为约17小时。根据本公开内容，在这些条件下，核酸(例如，寡核苷酸)自组装成预定的和所需的形状和尺寸的纳米结构。

特定退火方法的实例使用在溶液(例如，5mMTris-1mMEDTA(TE),40mMMgCl2)中的100种不同的200nM的寡核苷酸，并且将溶液加热至约90℃，随后如上文中所述，以在80℃与61℃之间每度3分钟和在60℃与24℃之间每度120分钟，在约73小时的时间内冷却至约24℃。应理解，前述退火方法是示例性的，并且可根据本本开内容使用其它退火方法。

本公开内容的核酸包括DNA诸如D-型DNA和L-型DNA和RNA及其各种修饰。核酸修饰包括碱基修饰、糖修饰和主链修饰。下文中提供这样的修饰的非限定性实例。

可根据本公开内容使用的经修饰的DNA核酸(例如，DNA变体)的实例包括但不限于，L-DNA(文献中已知的DNA的主链对映体)、锁核酸(LNA)以及上述核酸的共核酸(co-nucleicacid)诸如DNA-LNA共核酸。因此，本公开内容考虑了包含DNA、RNA、LNA或其组合的纳米结构。应理解，本公开内容的方法和组合物中使用的核酸可在性质上是同质的或异质的。例如，核酸可在性质上是完全DNA或它们可包含DNA和非DNA(例如，LNA)单体或序列。因此，可使用核酸元件的任意组合。核酸修饰可使得核酸在某些条件下更稳定和/或较不易于降解。例如，在一些实施方案中，核酸是抗核酸酶的。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸具有同质主链(例如，完全磷酸二酯或完全硫代磷酸酯)或异质(或嵌合)主链。硫代磷酸酯主链修饰可使得寡核苷酸在某些条件下对核酸酶较不易感，从而更稳定(如与天然磷酸二酯主链核酸相比较)。可为本公开内容的核酸提供更大稳定性的其它键联包括但不限于，二硫代磷酸酯键联、甲基膦酸酯键联、甲基硫代磷酸酯键联、硼烷膦酸酯键联、肽键联、烷基键联和脱磷酸型键联。因此，在一些实施方案中，核酸具有非天然存在的主链。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸不编码产物(例如，蛋白质)。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸额外地或可选择地在其糖中包含修饰。例如，β-核糖单位或β-D-2'-脱氧核糖单位可被经修饰的糖单位替换，其中所述经修饰的糖单位例如选自b-D-核糖、a-D-2'-脱氧核糖、L-2'-脱氧核糖、2'-F-2'-脱氧核糖、阿拉伯糖、2'-F-阿拉伯糖、2'-O-(C1-C6)烷基-核糖、优选地2'-O-(C1-C6)烷基-核糖为2'-O-甲基核糖、2'-O-(C2-C6)烯基-核糖、2'-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2'-NH2-2'-脱氧核糖、b-D-呋喃木糖、a-阿拉伯呋喃糖、2,4-二脱氧-b-D-赤-吡喃己糖，以及碳环(参见，例如，FroehlerJ.Am.Chem.Soc.114:8320,1992，通过引用并入本文)和/或开链糖类似物(参见，例如，Vandendriessche等Tetrahedron49:7223,1993，通过引用并入本文)和/或二环糖类似物(参见，例如，TarkovM.等Helv.Chim.Acta.76:481,1993，通过引用并入本文)。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸在其碱基中包含修饰。经修饰的碱基包括但不限于，经修饰的胞嘧啶(诸如5-取代的胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶和未取代或取代的5-炔基胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(例如，N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环体系的胞嘧啶类似物(例如，N,N'-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪))，以及尿嘧啶及其衍生物(例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)、经修饰的鸟嘌呤诸如7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤(诸如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)8-取代的鸟嘌呤(例如，8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)，和6-硫鸟嘌呤。所述核酸可包含通用碱基(例如3-硝基吡咯、P-碱基、4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚和K-碱基)和/或芳香环体系(例如氟苯、二氟苯、苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸酰胺)。可被掺入到本发明的寡核苷酸中的特定碱基对是由Yang等NAR,2006,34(21):6095-6101报导的dZ和dP非标准核碱基对。dZ(嘧啶类似物)为6-氨基-5-硝基-3-(1'-β-D-2'-脱氧呋核亚硝脲)-2(1H)-吡啶酮，并且其沃尔森-克里克互补物dP(嘌呤类似物)为2-氨基-8-(1'-β-D-1'-脱氧呋核亚硝脲)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8H)-酮。

在一些实施方案中，体外合成本公开内容的核酸。因此，在一些实施方案中，核酸是合成的(例如，非天然存在的)。用于合成核酸的方法(包括自动化核酸合成)是已知的。例如，可使用利用磷酰胺酯或H-膦酸酯化学反应的自动化技术(参见，例如，F.E.Eckstein,“OligonucleotidesandAnalogues-APracticalApproach”IRLPress,Oxford,UK,1991；和MatteucciM.D.等TetrahedronLett.21:719,1980)来合成具有经修饰的主链诸如包含硫代磷酸酯键联的主链的核酸，包括包含嵌合的修饰主链的那些核酸。还考虑了具有芳基-和烷基-膦酸酯键联的核酸的合成(参见，例如，美国专利第4,469,863号)。在一些实施方案中，使用商购可得的试剂，通过自动化固相合成制备具有烷基磷酸三酯键联(其中带电荷的氧部分被烷基化，例如，如在美国专利第5,023,243号和欧洲专利第092,574号中描述的)的核酸。用于产生其它DNA主链修饰和取代的方法已被描述(参见，例如，UhlmannE.等Chem.Rev.90:544,1990；GoodchildJ.BioconjugateChem.1:165,1990；CrookeS.T.等Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107,1996；和HunzikerJ.等ModSynthMethods7:331,1995，其各自通过引用并入)，并且可按照本公开内容来进行使用。

在以下实施例中更详细地描述了本公开内容的各种示例性实施方案。

实施例

方法

提供了4个方案来描述：

2.1)具有分选酶相容性GGG-肽的DNA-寡核苷酸的形成，

2.2)蛋白质至DNA-肽嵌合物的分选酶催化的偶联，和

2.3/2.4)DNA-蛋白质杂合体至针对热稳定/非热稳定性蛋白质的自组装纳米结构的整合。

针对这些实验进行官能化的寡核苷酸为称为“寡聚物1”和“寡聚物2”的两个60碱基对(bp)的寡核苷酸。利用3’-叠氮化物合成寡聚物1以及利用5’-叠氮化物合成寡聚物2，并且两者可从IDT(一个定制寡核苷酸制造商)商购获得。用于这些实验的肽具有(氨基至羧基或N至C)Flag-TEV-GGG-Pra(即，DYKDDDDK-ENLYFQ-GGG-Pra)的序列，其中“Pra”为非天然氨基酸炔丙基甘氨酸(SEQIDNO:12)。这样的合成肽可从商业来源诸如NeoBioLab订购。Pra残基提供炔烃(互补点击试剂)。另外，为了促进纯化，将Flag-标签添加至肽的N末端(表示为序列中的“Flag”)。由于分选酶需要GGG在游离N末端上，因此，插入烟草蚀纹病毒切割位点(TEV)以允许除去Flag-标签。

2.1用于形成具有分选酶相容性GGG肽的寡核苷酸的方案

2.1.1试剂的制备

a.将肽在不含核酸酶的水中溶解至1mg/ml(0.5mM)。炔丙基甘氨酸减小肽的溶解度并且可添加少量碳酸氢铵以溶解肽。

b.将寡核苷酸以100μM溶解在不含核酸酶的水中。

c.制备94.2g/L(59mM)水性CuSO₄原液。无水CuSO₄是优选的。

d.制备264.2g/L(0.21M)水性抗坏血酸原液。抗坏血酸用于将Cu(II)(蓝色)还原成具有催化活性的Cu(I)(绿色)。

2.1.2肽至寡核苷酸的点击偶联(图1)

a.在250uLDNA-低-结合管中组合以下物质：

i.35μL的叠氮化物-寡聚物

ii.30μL的肽

iii.12μL的抗坏血酸

1.从碳酸氢铵产生CO₂(气体)

2.虽然肽在中性pH下是不溶性的，但其在微碱性碳酸氢铵条件和酸性抗坏血酸条件下都是可溶的

iv.8.5μL的CuSO₄。

b.使反应在室温下放置2小时以确保完成。

c.一些Cu将被还原成Cu(0)金属，其将沉淀出来。

2.1.3肽-寡核苷酸嵌合物的纯化

a.未偶联的肽的去除(可使用方法1或方法2)

方法1：中和

1.通过添加250μL的TBS(50mMTrisHCl,300mMNaClpH7.6)中和溶液将使未偶联的肽沉淀。

2.可通过以16,000g离心5分钟来沉淀铜金属和沉淀的肽。上清液将含有偶联的和未偶联的寡核苷酸并且可使用6-8kDa膜(MiniGeBAflex-tube,T070-6)透析掉过量的Cu(I)。

方法2：QiaQuick核苷酸去除试剂盒(Qiagen)

1.遵照试剂盒方案会除去铜金属、Cu(I)、Cu(II)和未偶联的肽。

2.应当如制造商所指示的进行所述方案，但应当重复洗涤步骤第二次。

3.利用200μL的TBS进行洗脱。

2.1.4未偶联的寡核苷酸的去除(图3)

a.用1ml的TBS洗涤1ml的抗-FlagM2磁珠(Sigma-Aldrich,M8823)3次。

b.应用Qiagen纯化柱的产物并使其在室温下旋转结合1-2小时。

c.用500μl的TBS洗涤珠粒至少4次，确保搅动珠粒以除去任何未缀合的寡聚物。当搅动珠粒时，宽的boar吸管可以是优选的。

d.用eTBS(50mMTrisHCl,150mMNaCl)中的1ml0.1mg/ml(Sigma)Flag肽洗脱。在室温下旋转1小时以进行洗脱。

e.可进行第二次洗脱，但>85％将在第一次洗脱中被回收。

2.1.5Flag-标签的TEV–切割(图4)

a.将2μL的2mg/mlTEV蛋白酶(Sigma-Aldrich,T4455)添加至每ml的洗脱产物中。

b.在30℃水浴中温育过夜。

c.使用结合、洗涤和洗脱(切割的和未切割的)上清液运行4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶，显示产物已被成功纯化而不含未偶联的寡核苷酸(60bp的条带被连续洗涤清除)，并且被切割(切割后条带迁移回60bp附近)。

2.1.6终产物将在本文中被称为GGG-寡聚物。

a.虽然不是必需的，但可如上所述通过重复Qiagen核苷酸去除试剂盒来除去TEV蛋白酶和切割的肽。此步骤未被证明是必需的。

2.2用于将LPETG-标记的蛋白质分选酶偶联至GGG-寡核苷酸的方案

2.2.1试剂的制备

a.浓度为～2μM的GGG-寡核苷酸，如通过聚丙烯酰胺凝胶上的条带强度判断的。

i.用SYBR-Gold(Invitrogen,S11494)对凝胶进行染色，使用GETyphoonFLA-9500成像，并使用ImageJ(NIH,1.46r)进行分析。

b.将两种蛋白质(蛋白质1和2)偶联于两个不同的寡聚物(寡聚物1和2)

i.在本实施例中蛋白质1为CDH23并且蛋白质2为PCDH15，两者都如(Sotomayor等,Nature,492:128-132,2012；Sotomayor等,Neuron,66:85-100,2010)中所述产生。

c.可以以0.1mM的最低浓度使用蛋白质。

i.CDH23和PCDH15原液分别为于TBS+5mMCaCl₂(～0.1mM)中的2.5和2.7mg/ml。

1.CDH23-LPETG(SEQIDNO:4)为含有用于晶体学研究的两个细胞外结构域的片段(Sotomayor等,Nature,492:128-132,2012)。通过在His-标签与蛋白质的C末端之间附加LPETG(SEQIDNO:4)来修饰所述蛋白质

2.PCDH15-LPETG(SEQIDNO:4)为含有用于晶体学研究的两个细胞外结构域的片段(Sotomayor等,Nature,492:128-132,2012)。通过在His-标签与蛋白质的C末端之间附加LPETG(SEQIDNO:4)来修饰所述蛋白质

d.分选酶原液为于TBS+10％-甘油中的1.5mg/ml。

i.使用分选酶的进化变体(Chen等,PNAS108:11399-11404,2011)

e.分选酶反应缓冲液由以下物质组成：

i.300mMTrisHClpH7.5

ii.5mMMgCl₂

iii.5mMCaCl₂

iv.150mMNaCl

2.2.2蛋白质1至寡聚物1的分选酶偶联(图5)

a.将以下物质在250μLminiGEBAflex-管中混合

i.140μL的2μMGGG-寡聚物1

ii.40μL的0.1mM蛋白质1-LPETG-HHHHHH(SEQIDNO:15)

1.远过量地添加所述蛋白质以驱动针对寡聚物的偶联完成

iii.5μL的分选酶

iv.65μL的分选酶Rxn缓冲液

b.将GEBAFlex管置于1L分选酶RXN缓冲液中，并使反应在RT下进行1小时或在4℃下进行4-5小时

i.透析柱将使任何Flag肽透析掉并且将除去分选酶反应副产物G-HHHHHH(SEQIDNO:16)，所述副产物可与所述寡聚物竞争

c.图8显示表明当所有组分存在时才形成蛋白质-寡核苷酸嵌合物的SDS-PAGE分析

2.2.3蛋白质-寡核苷酸嵌合物的纯化(图6)

a.TEV、分选酶、蛋白质1和蛋白质2全部具有His-标签。然而，分选酶反应选择性切割掉终产物的His-标签。因此，将产物在抗-His磁珠上通过将除去这些反应物，从而将终产物留在上清液中。

i.在一些情况下抗-His珠粒可替代Ni-NTA而是优选的。

Ni-NTA珠粒在一些情况下倾向于相当强地结合寡聚物，并且可需要极高的盐来除去它们。

b.用1ml的TBS洗涤1ml的抗-His磁珠(GenScript,L00275)2次

i.这是为了从贮存溶液除去任何磷酸盐以防止磷酸钙晶体形成。省略此步骤可在后续步骤中导致大量损失

c.用1ml的TBS+5mMCaCl₂再洗涤3次

d.应用分选酶反应的产物，并在4℃旋转2小时以进行结合

e.上清液含有不含任何其它蛋白质的DNA-蛋白质杂合体。

2.3用于将DNA-蛋白质杂合体杂交至支架(热稳定性蛋白质)的方案

如果目标蛋白质可经受住加热至40℃，则可通过以1:1的比率将寡聚物添加至支架，随后在热循环仪中以每分钟半度从40℃变温至20℃(Halvorsen等,Nanotechnol.22:494005-494012,2011)来将所述寡聚物杂交至支架，所述支架在本情况下为线性化的M13(Halvorsen等,Nanotechnol.22:494005-494012,2011)。

可以0.5度的阶梯从95℃至20℃对所有未官能化的寡聚物进行退火。可通过在热循环仪达到40℃后暂停热循环仪，添加官能化的寡聚物来在该运行过程中添加官能化的寡聚物。如果蛋白质不是热稳定性的，则可如下文第2.4节中所述采用替代方法。

2.4用于将DNA-蛋白质杂合体杂交至支架(非热稳定性蛋白质)的方案

在本实施例中，CDH23和PCDH15片段不是非常热稳定的并且通过温度退火的杂交不可取。针对此系统，将GGG-寡聚物杂交至支架上，并且在支架上直接原位进行分选酶偶联。在杂交之前对寡聚物进行偶联允许容易地控制将何种蛋白质附接于何种寡聚物。针对此系统，使用Flag-标签作为保护基团来实现选择性偶联。即，寡聚物1被完全加工，从而导致GGG-寡聚物，而寡聚物2不经历其Flag-标签的TEV切割。

另外的考虑是确保支架上的每个位点接受其互补寡聚物。为了实现此，以50倍过量添加寡聚物。然而，这导致大量过剩的游离的浮动寡聚物。如果存在过量的将与原位反应竞争的漂浮在周围的GGG-寡核苷酸，则这可以是个问题。为了克服此问题，必须从溶液除去过量寡聚物。

2.4.1试剂的制备

a.应当将GGG-和Flag-TEV-GGG-寡聚物浓缩至～10μM

i.这可通过使用真空离心蒸发浓缩器(Thermo-Savant,SC210A)或3kDa旋转柱(Vivaspin500,VS0191)来实现。如果使用真空离心蒸发浓缩器，则应当首先将寡聚物透析至水中以在浓缩之前除去盐。

2.4.2将寡聚物退火

a.在低-结合250μLPCR管中混合以下物质

ii.5μL的20nM折叠支架(在此情况下为线性M13)

iii.1.19μL的所有未官能化的寡聚物的100nM混合物(等份)

iv.0.5μL的10nMGGG-寡聚物1

v.0.5μL的10nMFlag-TEV-GGG-寡聚物2

b.使混合物经历以0.5度的增量从95℃至20℃的温变，以使寡聚物退火至支架。

2.4.3通过PEG-沉淀(改进自Hartley和Bowen,Focus,66:27-28,1996)除去过量寡聚物

a.在于30mMMgCl₂中的115μL4％(按重量计)8KPEG(Amresco,0159)中稀释退火的产物

b.充分混合

c.以16,000g在25℃离心30分钟

d.除去顶部的112μL，留下底部的10μL，其应当含有沉淀的支架

e.用另外的于30mMMgCl₂中的115μL4％(按重量计)8KPEG(Amresco,0159)稀释剩下的10μL

i.确保充分混合。

f.以16,000g在25℃离心30分钟

g.除去顶部的115μL上清液

h.剩余的10μL应当具有不含任何可检测量的未杂交的寡聚物的支架

2.4.4.1蛋白质1-LPETG-HHHHHH(SEQIDNO:15)至GGG-寡聚物的原位偶联

a.混合以下物质

i.40μL1MTrisHClpH7.5

ii.0.8μL1MCaCl₂

iii.8μL3MNaCl

iv.10μL的PEG-沉淀的支架

v.50μL的14mg/ml分选酶

vi.15μL的0.1M蛋白质1-LPETG-HHHHHH(SEQIDNO:15)

b.将混合物置于透析膜内(Spectra/PorMicroFloat-a-lyzer,F235053)

c.将Floatalyzer置于1L的分选酶反应缓冲液中

d.使此反应在RT下运行0.5-1小时，随后转移至4℃，进行另外2小时(在转移至4℃后，最好转移至预冷的1升分选酶反应缓冲液)

e.添加4μL的2mg/mlTEV，并使其在室温静置1小时

f.用1mlTBS洗涤1ml的抗-His磁珠(GenScript,L00275)2次。这是为了从贮存液体中除去任何磷酸盐，以防止磷酸钙晶体形成。省略此步骤可在后续步骤中导致大量损失。

g.用1mlTBS+5mMCaCl₂再洗涤3次

h.应用分选酶反应的产物，并在4℃下旋转2小时以进行结合

i.上清液含有DNA-蛋白质杂合体。不含TEV和过量的CDH23

j.向上清液中添加以下物质并置于新的Floatalyzer中

vii.15μL的0.1M蛋白质2-LPETG-HHHHHH(SEQIDNO:15)

viii.50μL的14mg/ml分选酶

k.重复步骤b、c、d、f、g和h

l.上清液含有纯的定点双官能化的DNA-蛋白质杂合体。

m.如先前在(Halvorsen等,Nanotechnol.22:494005-494012,2011)中所述，通过凝胶电泳测定纳米开关的功能性。

结论

本公开内容已提供用于将蛋白质可靠地连接于DNA-寡聚物同时保持蛋白质功能的详细方案。另外，提供了用于将这些嵌合物掺入自组装纳米结构的方法。这些技术对合成的寡核苷酸和肽前置所有严苛的化学反应，所述合成的寡核苷酸和肽更加适合于这些非生理条件。点击化学的使用确保键联是生物正交的、定点的以及高效的。进化分选酶的使用允许蛋白质偶联在有利于蛋白质稳定性的条件下发生。方案已被设计来适应目标蛋白质的变化，并且所有材料是商购可得的。内置纯化方案允许快速高效的纯化，从而允许直接使用嵌合产物。当与分选酶相容性寡聚物和肽的文库组合时，此灵活且模块化的方法使得能够根据需要产生宽范围的功能性纳米结构。此外，此方法扩展了可被构建的功能性DNA-蛋白质嵌合物的范围，从而使得能够掺入先前不可接近的蛋白质机构以产生具有先前不可获得的功能性的纳米结构。

等同物

虽然已在本文中描述和举例说明了几个本发明的实施方案，但本领域普通技术人员将容易设想用于执行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个有利方面的各种其它方法和/或结构，并且这样的变化和/或修改的每一种视为在本文所述的本发明的实施方案的范围内。更一般地，本领域普通技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构型意欲为示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构型将取决于本发明的教导内容所用于的具体应用。本领域普通技术人员将认可或能够确定使用不超过常规实验，许多实验等同于本文所述的本发明的特定实施方案。因此，应理解，前述实施方案仅以举例的方式提供，并且在所附权利要求和其等同物的范围内，可另外地不按明确描述和所要求的实施本发明的实施方案。本公开内容的发明实施方案涉及本文所述的每个个体性质、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这样的性质、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的性质、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合包括在本公开内容的发明范围内。

如本文中定义和使用的所有定义应当被理解为控制词典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或定义的术语的普通含义。

本文中公开的所有参照文献、专利和专利申请在针对引用其各自用于的主题方面通过引用并入，其在一些情况下可包括整个文献。

除非明确指明相反，否则如在本文中在说明书和权利要求中所用的不定冠词“一个”和“一种”应当被理解为意指“至少一个/一种”。

如在本文中在说明书和权利要求中所用，短语“和/或”应当被理解为意指所结合的元素的“任一个或两者”，即，元素在一些情况下结合地存在以及在其它情况下分离地存在。通过“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式解释，即这样结合的元素的“一个或多个”。除通过“和/或”从句明确确定的元素外的其它元素可任选地存在，无论与那些明确确定的元素相关还是不相关。因此，作为非限定性实例，关于“A和/或B”，当与开放式语句诸如“包含”结合使用时，可在一个实施方案中指仅有A(任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中，可指仅有B(任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，可指A和B(任选地包括其它元素)；等。

如本文中在说明书和权利要求中所用，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列表中的术语时，“或”或“和/或”应当被解释为是包含性的，即，包含许多元素或元素的列表中的至少一个但也包括多于一个，以及任选地另外的未列出的元素。只有术语被明确地指明相反时，诸如“…的仅一个”或“…的恰好一个”或当在权利要求中使用时，“由…组成”，将指包含许多元素或元素的列表中的恰好一个元素。一般地，如本文中所用，当前面冠有排他性的术语诸如“任一”、“…的之一”、“…的仅一个”或“…的恰好一个”时，术语“或”将仅被解释为表示排他性供选方案(即“一个或另一个而不是两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由…组成”应具有其如专利法领域中使用的普通含义。

如本文中在说明书中和权利要求中所用，关于一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应当被理解为意指选自元素的列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不必需地包括元素的列表内明确列出的每一个元素的至少一个以及不排除元素的列表中的元素的任意组合。此定义还允许除在短语“至少一个”所指的元素的列表内明确确定的元素外的元素可任选地存在，无论该元素与那些明确确定的元素是否相关。因此，作为非限定性实例，“A和B的至少一个”(或，等同地，“A或B的至少一个”，或，等同地“A和/或B的至少一个”)在一个实施方案中可指至少一个(任选地包括多于一个)A，其中B不存在(且任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中，可指至少一个(任选地包括多于一个)B，其中A不存在(且任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，可指至少一个(任选地包括多于一个)A和至少一个(任选地包括多于一个)B(且任选地包括其它元素)；等。

还应理解，除非明确地显示相反，否则在本文中所要求保护的包括多于一个步骤或行动的任何方法中，所述方法的步骤或行动的顺序不必需地限定于其中所述方法的步骤或行动被记载的顺序。

在权利要求中，以及在上述说明书中，所有过渡短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“包括”、“拥有”、“带有”等将被理解为是开放性的，即意指包括但不限于。只有过渡短语“由…组成”和“基本上由…组成”分别是封闭性的或半封闭性的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册(UnitedStatesPatentOfficeManualofPatentExaminingProcedures)第2111.03节中所示的。

Claims

1.一种包含通过氨基酸接头共价地缀合于蛋白质的核酸的复合物，所述氨基酸接头具有LPXTGGG(SEQIDNO:9)的氨基酸序列，其中X为任意氨基酸。

2.权利要求1的复合物，其中所述蛋白质是天然存在的蛋白质并且所述LPXTGGG(SEQIDNO:9)的氨基酸序列不存在于所述天然存在的蛋白质中，其中X为任意氨基酸。

3.权利要求1或2的复合物，其中所述氨基酸序列为LPETGGG(SEQIDNO:5)。

4.权利要求1-3的任一项的复合物，其中所述核酸在长度上为1-100个核苷酸。

5.一种组合物，其包含分离形式的权利要求1-4的任一项的复合物。

6.一种组合物，其包含以下的两种或更多种的任意组合：

缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸，

包含LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)的末端氨基酸序列的蛋白质，其中X为任意氨基酸，X’_n为长度n的一串独立选择的氨基酸，并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围，

分选酶，和

TEV蛋白酶。

7.权利要求6的组合物，其中所述末端氨基酸序列为LPETGX’_n(SEQIDNO:3)，其中X’为氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围。

8.权利要求6或7的组合物，其中将所述蛋白质、分选酶和TEV蛋白酶的任一种或任意组合缀合于His-标签。

9.权利要求8的组合物，其中所述His-标签包含在X’_n氨基酸序列中。

10.权利要求6-9的任一项的组合物，其还包含特异性结合His-标签的珠粒(抗-His珠粒)。

11.权利要求6-10的任一项的组合物，其中n为1至100、或1至99、或1至90的任何数值或任何数值范围。

12.权利要求8-11的任一项的组合物，其中所述His-标签为6个组氨酸残基的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。

13.权利要求6-12的任一项的组合物，其中n为大于1的数值。

14.一种方法，其包括

在分选酶存在的情况下，将缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸与包含LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)的末端氨基酸序列的蛋白质反应，其中X为氨基酸，X’_n为长度为n的一串独立选择的氨基酸，并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围，以形成包含通过氨基酸接头共价地缀合于所述蛋白质的核酸的复合物，所述氨基酸接头具有LPXTGGG(SEQIDNO:9)的氨基酸序列，其中X为任意氨基酸。

15.权利要求14的方法，其中所述分选酶和所述包含LPXTGX’_n(SEQIDNO:2)的末端氨基酸序列的蛋白质各自包含His-标签。

16.权利要求14或15的方法，其中所述末端氨基酸序列为LPETGX’_n(SEQIDNO:3)，其中X’_n为长度n的一串氨基酸并且n为大于0的数值或大于0的数值的范围，并且其中所述氨基酸接头的氨基酸序列为LPETGGG(SEQIDNO:5)。

17.权利要求14-16的任一项的方法，其中n为大于1的数值。

18.权利要求14-17的任一项的方法，其中通过生物正交铜催化的点击化学反应形成缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸。

19.权利要求18的方法，其中所述生物正交铜催化的点击化学反应形成包含缀合于一个或多个甘氨酸(G)残基和TEV靶氨基酸序列的核酸的核酸中间产物。

20.权利要求19的方法，其中将所述核酸中间产物与TEV蛋白酶反应。

21.权利要求20的方法，其中将所述TEV蛋白酶缀合于His-标签。

22.权利要求15-21的任一项的方法，其中所述His-标签为六个组氨酸残基的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。