CN105535302A - 药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种药物组合物，其包含人参-远志药对或其提取物，和/或石菖蒲-茯苓药对或其提取物。本申请还涉及上述药物组合物的制备方法，以及该药物组合物在制备用于增强记忆或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

Description

药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及中药复方组合物及其制备方法。本发明还涉及上述药物组合物在神经相关病变中的应用。

背景技术

抑郁症与老年痴呆症(又名阿尔茨海默症)，是神经病变中较受社会关注的两大类疾病。抑郁症是一种以显著而持久的心境低落为主要临床特征的病症，同时伴有失眠，记忆缺失，饮食失调等症状，严重者可出现自杀念头和行为。多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。据报道，人群中有16％的人在一生的某个时期会出现抑郁症症状。若患者出现这些症状持续两周以上，并且没有明显改善，可确诊为抑郁症。据世界卫生组织统计，抑郁症已成为世界第4大疾患，并且预计到2020年，可能成为仅次于冠心病的第二大疾病。最为严重的是，抑郁症患者不能适应社会，注意力下降，是自杀的高危人群。老年痴呆症是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。全世界有2400万病患，早期最显著的症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失。随着病情的加重，病人的语言能力、空间辨别能力、认知能力会逐步衰退。调查显示，80岁以后15％的人有罹患痴呆性疾患的危险。家族中若有阿兹海默病患者，则后代患该病的几率也相对要高。目前临床研究发现，在老年患者中，经常出现抑郁症与老年痴呆症并发的现象，多表现为发病初期以抑郁症状为主，随着疾病的发展，出现记忆缺失等老年痴呆症的症状。这两种疾病，不仅严重影响了老年人的生活质量，还给老龄化社会带来沉重的经济负担与社会负担。现代医学研究发现，相应脑区神经元的凋亡是这两大疾病发病的共同病理机制。据此，科学家提出可通过促进神经细胞的分化，补充凋亡之神经元，从而达到防治抑郁症与老年痴呆症的目的。因此，探寻具有促进神经细胞分化的药物已成为抗老年痴呆与抗抑郁新药研究的重点和热门。

中医理论认为，抑郁症与老年痴呆症的共同病机可概括为：心脾两虚，气滞血淤，肝郁脾虚导致情绪抑郁，气机不畅，思虑过度，心神失养，表现为情绪低落、多愁善感，悲观厌世、失眠健忘、思维联想缓慢，运动迟缓等症状。

迄今为止，并未有可通过促进神经细胞分化，发挥抗老年痴呆与抗抑郁作用的药物组合物或中药复方的报道。

发明内容

第一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含人参(PanaxginsengC.A.Mey.)-远志(PolygalatenuifoliaWild.)药对或其提取物，和/或石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)-茯苓(Poriacocos(Schw.)Wolf)药对或其提取物。

在一些实施方案中，人参-远志药对提取物以及石菖蒲-茯苓药对提取物分别为其相应的水提物。

在一些实施方案中，人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对的重量比为8:1-1:8或2:1-1:8，优选为1:5。在具体的实施方案中，固定人参-远志药对重量，改变石菖蒲-茯苓药对重量，得到比例为8:1-1:8的药对组合，其中优选的比例为1:5。在另一具体的实施方案中，固定石菖蒲-茯苓药对重量，改变人参-远志药对重量，得到比例为2:1-1:8的药对组合，其中优选的比例为1:5。

在另一些实施方案中，人参-远志药对提取物和石菖蒲-茯苓药对提取物的重量比为8:1-1:8或2:1-1:8，更优选为1:5。在具体的实施方案中，固定人参-远志药对提取物重量，改变石菖蒲-茯苓药对提取物重量，得到比例为8:1-1:8的药对提取物组合，其中优选的比例为1:5。在另一具体的实施方案中，固定石菖蒲-茯苓药对提取物重量，改变人参-远志药对提取物重量，得到比例为2:1-1:8的药对提取物组合，其中优选的比例为1:5。

在一些实施方案中，人参-远志药对中人参与远志原料的重量比为1:1。在其他实施方案中，石菖蒲-茯苓药对中石菖蒲与茯苓原料的重量比为1:2。在优选的实施方案中，人参与远志原料的重量比为1:1，以及石菖蒲与茯苓原料的重量比为1:2。在更优选的实施方案中，人参与远志原料的重量比为1:1；石菖蒲与茯苓原料的重量比为1:2；以及上述两个药对或其提取物的重量比为1:5。在更优选的实施方案中，上述复方药物组合物由人参-远志和石菖蒲-茯苓的水提物组成。

本申请的发明人研究发现，人参-远志和石菖蒲-茯苓两个药对按一定的配比进行组合(例如为8:1-1:8，优选为1:5)能够显著地促进神经突触生长、提高神经丝蛋白表达及增加神经丝蛋白启动子的活性，这表明其具有增强记忆、预防老年痴呆的作用和抗抑郁的功效。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在优选的实施方案中，将人参-远志和/或石菖蒲-茯苓或其提取物与上述赋形剂配制成药学上可接受的剂型，例如片剂、胶囊、丸剂、口服液等剂型。

第二方面，本申请提供了上述药物组合物的制备方法，其包括将人参与远志、和/或石菖蒲与茯苓原料处理后，按一定重量比称取人参-远志药对和/或石菖蒲-茯苓药对，任选地将所述人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对再按一定重量比合并；或者将称取的人参-远志药对和/或石菖蒲-茯苓药对进一步用合适的溶剂提取，将提取液干燥后得到人参-远志药对提取物和/或石菖蒲-茯苓药对提取物，任选地将人参-远志提取物和石菖蒲-茯苓提取物按一定重量比合并。

在优选的实施方案中，提取人参-远志和石菖蒲-茯苓的溶剂为水。在优选的实施方案中，用水提取人参-远志药对及石菖蒲-茯苓药对1-3次，每次1-3小时，然后将几次提取得到的提取液合并。

在一些实施方案中，人参与远志按重量比为1:1的比例混合得到人参-远志药对。在另一些实施方案中，石菖蒲与茯苓原料按重量比为1:2的比例混合得到石菖蒲-茯苓药对。在优选的实施方案中，人参-远志药对与石菖蒲-茯苓药对，或者两个药对的提取物按重量比8:1-1:8或2:1-1:8，优选为1:5的比例混合得到本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，首先固定人参-远志药对重量或其提取物重量，改变石菖蒲-茯苓药对或其提取物的重量，将两者按比例8:1-1:8进行混合，优选为1:5。在另一具体的实施方案中，固定石菖蒲-茯苓药对重量或其提取物重量，改变人参-远志药对重量或其提取物重量，将两者按比例2:1-1:8进行混合，优选为1:5。

本申请的发明人发现，对药对人参-远志，石菖蒲-茯苓的剂量进行优化后得到的药物组合可有效地促进神经细胞的分化。本发明的药物组合物可以用于增强记忆、预防老年痴呆和抗抑郁，其作用机制明确，疗效确切。

第三方面，本申请提供了药物组合物在制备用于增强个体记忆或治疗个体神经退行性疾病的药物中的用途。在优选的实施方案中，所述神经退行性疾病包括抑郁症和老年痴呆症等神经病变疾病。

在一些实施方案中，包含本发明药对组合的药物为片剂、胶囊、丸剂或口服液等的口服制剂。在一些实施方案中，所述药物经口给药。

本发明的药物能够显著增强记忆、预防老年痴呆或抗抑郁。在一些实施方案中，本发明的药物还具有给药方便、给药剂量小或副作用小等特点。

第四方面，提供了本发明的药物组合物用于增强记忆或治疗神经退行性疾病的用途。在优选的实施方案中，所述神经退行性疾病包括抑郁症和老年痴呆症等神经病变疾病。

第五方面，提供了增强个体记忆或治疗个体神经退行性疾病的方法，该方法包括将包含本发明药对组合的药物给予个体，优选为经口给予。所述神经退行性疾病包括抑郁症和老年痴呆症等神经病变疾病。本发明的药物能够通过显著地促进个体的神经细胞分化，发挥抗老年痴呆和抗抑郁等神经病变疾病的作用。

附图简要说明

图1显示了实施例1制备的各水提物中相关化学成分的含量测定，A图为提取物液相质谱图；以及B图为提取物液相色谱图。

图2显示了实施例1制备的各水提物对PC12细胞生长的影响。

图3显示了四味药混合后的水提物和单味药水提物混合物对神经丝蛋白表达的影响。

图4显示了四味药混合后的水提物和单味药水提物混合物对神经丝蛋白启动子活性的影响。

图5显示了药对人参-远志和石菖蒲-茯苓增加神经丝蛋白启动子的活性。

图6显示了人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对按不同比例组合后对神经丝蛋白启动子活性的影响。

图7显示了人参-远志和石菖蒲-茯苓药对组合增加神经丝蛋白启动子活性的作用(图7A和图7B)及该复方药物组合的协同效应分析(图7C和图7D)。

图8显示了蛋白激酶A抑制剂抑制人参-远志药对、四味药混合后水提物以及人参-远志和石菖蒲-茯苓药对组合增加神经丝蛋白启动子活性的效应。

具体实施方式

一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含人参-远志药对或其提取物，和/或石菖蒲-茯苓药对或其提取物。

在一些实施方案中，上述药物组合物包含人参-远志药对或其提取物。在另一些实施方案中，本申请的药物组合物包含石菖蒲-茯苓药对或其提取物。

在一些实施方案中，本申请的药物组合物包含人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对。在优选的实施方案中，本申请的药物组合物包含人参-远志药对提取物和石菖蒲-茯苓药对提取物。

在一些实施方案中，人参-远志药对提取物以及石菖蒲-茯苓药对提取物分别为其相应的水提物。

本申请所用的“药对”又称对药，是指临床上常用的、相对固定的两味药物的配伍组合。例如本申请的人参-远志药对、石菖蒲-茯苓药对。

在优选的实施方案中，上述复方药物组合物由人参-远志和石菖蒲-茯苓的提取物组成。在更优选的实施方案中，该复方药物组合物由人参-远志和石菖蒲-茯苓的水提物组成。

在一些具体的实施方案中，首先固定人参-远志药对重量或提取物重量，改变石菖蒲-茯苓药对或提取物重量，得到比例为8:1-1:8的药对组合，优选比例为1:5。在另一具体的实施方案中，固定石菖蒲-茯苓药对重量或提取物重量，改变人参-远志药对重量或提取物重量，得到比例为2:1-1:8的药对组合，优选比例为1:5。

在一些实施方案中，人参-远志药对中人参与远志原料的重量比为1:1。石菖蒲-茯苓药对中石菖蒲与茯苓原料的重量比为1:2。

本申请的发明人研究发现，人参-远志和石菖蒲-茯苓两个药对按一定的配比进行组合(例如为8:1-1:8，优选为1:5)能够显著地促进神经突触生长、提高神经丝蛋白表达或增加神经丝蛋白启动子的活性。发明人出乎意料地发现，人参-远志和石菖蒲-茯苓两药对以1:5的比例组合得到的药物复方增加神经丝蛋白启动子活性的作用最为显著，能更有效地促进神经细胞分化。

在一些实施方案中，本发明的复方药物组合具有以下至少一个优点：良好的促进神经细胞分化作用、安全无明显细胞毒性、以及可以用于增强记忆、预防老年痴呆和治疗抑郁症的中药新药开发。

本发明的药对组合对促进神经细胞分化具有协同作用，其中人参中的人参皂甙Rg1对Aβ诱导的记忆能力损害可能具有显著的记忆改善作用；远志脱脂醇提物对记忆获得障碍、巩固不良和再现缺失可能有改善作用；远志中的3，6-二酰基蔗糖酯可以促进CREB与BDNF的表达，具有抗抑郁的作用；石菖蒲水提取液和乙醇提取液具有明显的抗抑郁作用；以及茯苓对改善脑记忆功可能有明显作用。

协同效应研究中，周廷潮教授提出质量作用中效定理，并从单一物质推广到复方物质的系统，提出药物合并指数定理及电脑解析。合并指数(CombinationIndex,CI)可以定量协同作用(CI<1)，相加作用(CI＝1)，及拮抗作用(CI>1)。同时，另一个参数剂量减少指数(DRI,DoseReductionIndex)可以表征为达到同一效应，合用药物可以降低单独用药剂量的倍数。

本申请即应用上述原理开展药物协同作用的研究。结果表明，在神经丝蛋白68/200启动子的活性实验中，人参-远志和石菖蒲-茯苓这两个药对具有协同作用，特别是两者以1:5的比例组合时，其协同效应更为显著。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

“赋形剂”是指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。对赋形剂的一般要求是性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。

在一些实施方案中，本发明的赋形剂包括但不仅限于：填充剂或稀释剂、润滑剂或助流剂或抗粘着剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂或乳化剂等。粘合剂的例子包括例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素或其衍生物、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮，所述纤维素衍生物选自微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等；填充剂的例子包括例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物、无机钙盐、山梨醇或甘氨酸，优选地所述无机钙盐为硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙或沉降碳酸钙；润滑剂的例子包括例如微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油或聚乙二醇；崩解剂的例子包括例如淀粉或其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素，其中优选的淀粉衍生物为羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉或玉米淀粉；湿润剂的例子包括例如十二烷基硫酸钠、水或醇等。

本申请的药物组合物可以呈现为单位剂量形式，并且可以通过任一制药领域公知的合适方法制备。例如通过将中药复方组合与合适的赋形剂来制备组合物，随后根据需要来定型制备的产物。

在某些实施方案中，本申请的药物组合物被配制成药学上或临床上可接受的任一剂型，例如可以为口服制剂、外用制剂或注射剂，可采用本领域熟知的制剂技术手段来制备。所述口服制剂可以选自酒剂、口服液、片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、散剂、滴丸、糖浆剂、合剂、露剂或茶剂等，优选为片剂、胶囊、丸剂、口服液等口服制剂。

一方面，本申请提供了上述药物组合物的制备方法。

在一些实施方案中，上述制备方法包括将人参(例如其根或根茎)、远志(例如根部)、石菖蒲(例如根茎)和茯苓(例如茯苓菌核)处理后，按一定重量比分别称取人参-远志药对及石菖蒲-茯苓药对备用，或者进一步将所述人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对再按一定重量比合并混匀，得到本发明的人参-远志和石菖蒲-茯苓药对组合。

在另一些实施方案中，药物组合物的制备方法包括将人参(例如其根或根茎)、远志(例如根部)、石菖蒲(例如根茎)和茯苓(例如茯苓菌核)处理后，按一定重量比分别称取人参-远志药对及石菖蒲-茯苓药对，将其用合适的溶剂提取，提取液干燥后得到相应的提取物备用，或者进一步将人参-远志药对提取物和石菖蒲-茯苓药对提取物按一定重量比合并混匀，得到本发明的人参-远志和石菖蒲-茯苓药对提取物组合。

在一些优选的实施方案中，提取人参-远志和石菖蒲-茯苓的溶剂为水。

在一些实施方案中，人参与远志原料按重量比为1:1的比例混合得到人参-远志药对。在另一些实施方案中，石菖蒲与茯苓原料按重量比为1:2的比例混合得到石菖蒲-茯苓药对。在优选的实施方案中，首先固定人参-远志药对重量或提取物重量，改变菖蒲-茯苓药对重量或提取物重量，得到比例为8:1-1:8的药对组合，优选比例为1:5。在另外优选的实施方案中，固定石菖蒲-茯苓药对重量或提取物重量，改变人参-远志药对重量或提取物重量，得到比例为2:1-1:8的药对组合，优选比例为1:5。

在具体的实施方案中，药物组合物的制备方法包括以下步骤：

取人参、远志、石菖蒲、茯苓剪碎；分别称取人参-远志(重量比为1：1)及石菖蒲-茯苓(重量比为1：2)，用6-10倍水浸泡20-40分钟，提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，冷冻干燥得水提物粉末。按重量比1：5合并人参-远志药对水提物和石菖蒲-茯苓药对水提物，充分混匀。

在更具体的实施方案中，分别将人参、远志、石菖蒲、茯苓剪碎。取人参、远志两味(重量比为1：1)，置于500mL锥形瓶中，加水120-200g，浸泡20-40分钟，加热提取1-3小时，趁热过滤，残渣按上述方法加热提取1-2次，合并滤液。滤液冷冻干燥得水提物冻干粉I。再取石菖蒲、茯苓两味(重量比为1：2)，置于500mL锥形瓶中，加入180-300g水，浸泡20-40分钟后加热提取1-3小时，趁热过滤，残渣按上述方法加热提取1-2次，合并滤液。滤液冷冻干燥得水提物冻干粉II。取水提物冻干粉I、II，按重量比1：5组合，充分混匀，即得复方药物组合物。

发明人发现，当上述复方药物组合中人参-远志和石菖蒲-茯苓的水提物重量比为8:1-1:8或2:1-1:8，优选为1:5时，具有良好的促进神经元分化作用。发明人利用PC12细胞测定上述复方药物组合对促进神经细胞分化的效应，发现上述药物组合能促神经突起生长、提高神经丝蛋白表达及增加神经丝蛋白启动子活性。结合联合给药的中效原理(Median-effectPrinciple)和统计分析，结果表明上述药物组合对增加神经丝蛋白启动子活性具有协同作用，促进PC12细胞分化。这说明在发明人优选的组合比例下，低剂量的药对人参-远志及石菖蒲-茯苓组合药物可产生等同于高剂量单味药的药理效应，从而降低药物可能出现的毒副作用。

此外，发明人还发现，将人参、远志、石菖蒲、茯苓四味中药混合后用溶剂进行提取得到的提取物促进神经元分化等的作用显著强于上述四味药单个提取物的混合物。例如，四味中药混合后的水提物能够提高神经丝蛋白表达、增加神经丝蛋白启动子活性等，而单个水提物的混合物则不具有显著提高神经丝蛋白表达、增加神经丝蛋白启动子活性的效应。

另一方面，提供了药物组合物在制备用于增强个体记忆或治疗个体神经退行性疾病的药物中的用途。在优选的实施方案中，所述神经退行性疾病包括抑郁症和老年痴呆症等神经病变疾病。

在一些实施方案中，所述药物可以经口、静脉内、肌注、经直肠或透皮的方式给药，优选为经口给药。在一些实施方案中，口服制剂为片剂、胶囊、丸剂或口服液等。

本发明的药物能够显著增强记忆、预防老年痴呆或抗抑郁症。在一些实施方案中，本发明的药物还具有给药方便、给药剂量小、副作用小等特点。

另一方面，提供了本发明的药物组合物用于增强记忆或治疗神经退行性疾病的用途。

再一方面，提供了增强个体记忆或治疗个体神经退行性疾病的方法，该方法包括将包含本发明药对组合的药物给予个体，优选为经口给予。所述神经退行性疾病包括抑郁症和老年痴呆症等神经病变疾病。本发明的药物组合物通过显著地促进个体的神经细胞分化，能够发挥抗老年痴呆和抗抑郁的作用。

本申请所述的“个体”，是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域技术人员所公知的方法和技术。

实施例

实施例1：复方药物组合的制备

分别取人参(五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根)10g、远志(远志科植物远志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵叶远志(PolygalasibiricaL.)的干燥根)10g、石菖蒲(天南星科植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根茎)10g、茯苓(多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核)20g剪碎。取人参、远志两味，置于500mL锥形瓶中，加水160g，浸泡30分钟，加热提取2小时，趁热过滤，残渣按上述方法加热提取1次，合并滤液。滤液冷冻干燥得水提物冻干粉I。再取石菖蒲、茯苓两味，置于500mL锥形瓶中，加入240g水，浸泡30分钟后加热提取2小时，趁热过滤，残渣按上述方法加热提取1次，合并滤液。滤液冷冻干燥得水提物冻干粉II。取水提物冻干粉I、II，按所需重量比(例如1：5)组合，充分混匀。以同样的方法制备单味药水提物冻干粉末以及四味药混合后的水提物冻干粉末(其中人参、远志、石菖蒲、茯苓的比例为1:1:1:2)。

实施例2：人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对的质量控制

基于人参、远志、石菖蒲、茯苓的化学成分和功能的研究，选取人参皂苷Rb₁，Rd，Re，Rg₁，远志中3，6-二芥子基蔗糖，石菖蒲中α-细辛醚和β-细辛醚和茯苓中茯苓酸为指标成分。

分别精密称取实施例1水提物冻干粉I、II和单味药水提物冻干粉以及四味药混合后的水提物冻干粉末1mg加入5mL的50％乙醇溶液中，超声30分钟，过220μM滤膜，即得供试品。

供试品经LC-MS系统(液-质联用系统)进行含量测定。HPLC系统(Agilent1290，二元泵，自动进样器，DAD检测器，柱温箱)，C18反向柱(AgilentZORBAXEclipseXDB-C18column(1.8mm,50mmΧ4.6mm))。流动相：乙腈(含0.1％甲酸)和水(含0.1％甲酸)。梯度洗脱：0-14min，20.0-42.0％乙腈(0.1％甲酸)；14–17min，42.0–75.0％乙腈(0.1％甲酸)；17-18min，75％乙腈(0.1％甲酸)；18–25min，75.0–85.0％乙腈(0.1％甲酸)。流速：0.4mL/min，柱温：25℃。进样体积：5μL。检测波长：3，6-二芥子基蔗糖，330nm；α-细辛醚和β-细辛醚，258nm。MS系统(AgilentQQQ-MS/MS(6410A)，ESI离子源)，样品测定采用负离子模式。气体温度：325℃；流速：10L/min；雾化器压力：35psig；毛细管电压：4000V；δ电子倍增器电压：400V。上述条件下，人参皂苷Rb₁，Rd，Re，Rg₁和茯苓酸可找出两对合适的子离子，以完成供试品的含量测定，结果参照图1和表1。图1A为通过液相质谱测定各提取物中指标成分含量，标准品为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷IV(内标物质)和茯苓酸；其中峰2、3、4、6、5和9分别代表人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷IV(内标物质)和茯苓酸。图1B为通过液相色谱测定各提取物中指标成分含量，标准品为3,6’-二芥子基蔗糖(330nm)、α-细辛醚(258nm)和β-细辛醚(258nm)；其中峰1、8和7分别代表3,6’-二芥子基蔗糖(330nm)、α-细辛醚(258nm)和β-细辛醚(258nm)。结果表明该试验的重复性好，药对、单味药水提物以及四味药混合后的水提物质量可控。

表1提取物的含量测定

a)QQQ-MS/MS检测器用于人参皂苷Rb₁，Rd，Re，Rg₁和茯苓酸的检测，DAD用于3，6-二芥子基蔗糖，α-细辛醚和β-细辛醚的检测。

b)数值表示毫克/克的提取物干燥粉末,Means±SD,n＝3.

实施例3：四味药混合后的水提物增加神经丝蛋白表达和神经丝蛋白启动子活性的作用

1.细胞培养条件

将大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12，购买自ATCC,Manassas,VA)培养在DMEM(LifeTechnology)培养基中，所用DMEM培养基含6％胎牛血清和马血清、青霉素100U/mL、庆大霉素100μg/mL。培养箱温度37℃，含7.5％CO₂。实验前3小时，将上述培养基换成含1％胎牛血清和马血清的培养基。

2.对PC12细胞生长的影响

本实施例及以下实施例中使用的药物均是先将实施例1中得到的提取物粉末溶于DMSO中，得到浓度为50mg/mL的母液，然后再加入相应的细胞孔板中。

将PC12细胞接种在96孔板(Falcon,BDLabware,NJ,USA)上，每孔细胞密度为8×10³，培养过夜让细胞贴壁。实验前3小时，换成含1％胎牛血清和马血清的培养基。加入四味药混合后的水提物、药对和单味药水提物(1.5-150μg/mL)，37℃培养48小时后进行MTT测定。每孔加0.02mgMTT，37℃培养3小时，每孔加150μLDMSO溶解形成的呋喃结晶，在570nm处用OpsysMicroplateReader(ThermoLabsystems,MA,USA)测定光密度。取五次实验的平均值，每次平行做六个孔。试验结果见图2。通过实验结果选出合适的给药剂量，即四味药混合后的水提物、药对和单味药水提物安全给药范围为0-100μg/mL。

3.神经丝蛋白(NF)表达测定

将PC12细胞接种在6孔板(Falcon,BDLabware,NJ,USA)上，每孔细胞密度为12×10⁴，过夜培养让细胞贴壁。实验前3小时，换成含1％胎牛血清和马血清的培养基。分别给药四味药混合后的水提物(25μg/mL，其中人参、远志、石菖蒲、茯苓的混合比例为1:1:1:2)和单味药水提物混合物(25μg/mL，其中人参、远志、石菖蒲、茯苓的比例也为1:1:1:2)，37℃培养48小时。将收集的细胞用细胞裂解液(100mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)，其包含0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和1mM二硫苏糖醇)裂解后得到细胞溶解液，通过蛋白质免疫印迹(westernblot)表征蛋白表达。如图3的结果所示，四味药混合后的水提物可提高神经丝蛋白(NF)表达，而单个水提物混合物则不具有显著提高神经丝蛋白表达的效应，说明四味药混合后得到的水提物的功效不等同于单个水提物简单混合的结果，其中神经生长因子(AlomoneLabs,Israel)为阳性对照，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。在本实施例以及其他实施例中，使用的统计学方法如下：两组数据间采用t-检验(t-test)分析，多组结果比较采用单因素方差分析Tukey检验(One-wayANOVATukey'stest)进行分析，P<0.05为差异有显著性，其中*，P<0.05；**，P<0.01。

4.神经丝蛋白(NF)启动子活性测定

将PC12细胞接种在24孔板(Falcon,BDLabware,NJ,USA)上，每孔细胞密度为8×10⁴，过夜培养让细胞贴壁。取12μLLipofectamin2000(LifeTechnology公司)加入600μLopti-MEM(LifeTechnology公司)，得到稀释的Lipofectamin2000溶液，室温孵育5分钟。取6μg神经丝蛋白68启动子质粒(pNF68-Luc,ActiveMotif,Carlsbad,CA)或神经丝蛋白200启动子质粒(pNF200-Luc,ActiveMotif,Carlsbad,CA)加入600μLopti-MEM中，得到稀释的质粒。然后将稀释的质粒加入Lipofectamin2000溶液中，孵育20分钟后，取50μL依次加入24孔板，37℃孵育16小时后，换成1％胎牛血清和马血清的培养基，3小时后给药(5-50μg/mL)，于37℃培养48小时。然后收集细胞，用细胞裂解液(100mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)，其包含0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和1mM二硫苏糖醇)裂解细胞后得到细胞溶解液样品。将样品进行荧光素酶活性测定(FluostarOptima,BMGLabtechnology)。取四次实验的平均值，每次平行做三个孔。图4A为所用启动子的结构示意简图。如图4B所示，四味药混合后的水提物可增强神经丝蛋白68和200启动子的活性，并呈剂量依赖性。然后用神经生长因子(AlomoneLabs,Israel)作为阳性对照，检测了四味药混合后的水提物(25μg/mL)与单味药水提物混合物(25μg/mL)相比，增加神经丝蛋白启动子活性的效应(图4C)，进一步说明了四味药混合后得到的水提物的功效不等同于单个水提物简单混合的结果。

实施例4：人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对增加神经丝蛋白启动子活性的作用

1.细胞培养条件

细胞培养条件同实施例3。

2.神经丝蛋白启动子活性测定

神经丝蛋白启动子活性测定方法同实施例3。分别给药人参-远志(5-100μg/mL)和石菖蒲-茯苓(5-100μg/mL)，然后将细胞收集并裂解后获取细胞溶解液样品。样品进行荧光素酶活性测定(FluostarOptima,BMGLabtechnology)。取四次实验的平均值，每次平行做三个孔。结果参照图5。药对人参-远志，石菖蒲-茯苓均可增强神经丝蛋白68启动子(图5A)和神经丝蛋白200启动子(图5B)的活性，并呈剂量依赖性，神经生长因子为阳性对照。

实施例5：药对不同比例组合对增加神经丝蛋白启动子活性的作用

细胞培养和实验方法同实施例3，根据实施例4得到的药对人参-远志和石菖蒲-茯苓对神经丝蛋白启动子活性的效应曲线，选取一个药对较小的给药剂量固定，然后再变化另一药对的剂量。具体地，首先固定药对人参-远志的给药剂量(15μg/mL)，改变石菖蒲-茯苓的给药量，制备不同比例的药对组合(8:1到1:8)，对细胞给药，从而得到不同比例的药对组合对神经丝蛋白68和200启动子活性的作用结果。然后再固定药对石菖蒲-茯苓的给药剂量(50μg/mL)，改变人参-远志的给药量，制备不同比例的药对组合(2:1到1:8)，对细胞给药，从而得到不同比例的药对组合对神经丝蛋白68和200启动子活性的作用结果。结果参照图6。根据图6的数据可知，药对人参-远志和石菖蒲-茯苓的比例在8:1到1:8(图A)或2:1到1:8(图B)时，均能增加神经丝蛋白启动子的活性。出人意料的是，上述两个药对的比例为1:5时，对神经丝蛋白启动子的活性的增加作用最为显著，明显强于上述两个药对在其他比例时的作用。

实施例6：药对组合增加神经丝蛋白启动子活性作用及药对组合的协同效应分析

细胞培养和实验方法同实施例3，根据实施例5的结果，进一步比较药对组合(其中人参-远志水提物和石菖蒲-茯苓水提物的比例为1:5)和四味药混合后的水提物增加神经丝蛋白启动子活性的效应曲线。如图7A和B所示，相比四味药混合后的水提物，药对组合更能显著增加神经丝蛋白68和200启动子的活性。药对组合的作用明显强于四味药混合后水提物的作用。

按照前文所述的周廷潮教授的质量作用中效定理，利用周廷潮教授开发的计算机软件CompuSyn确定本实验中药对人参-远志与石菖蒲-茯苓以1:5组合时的合并指数(CI)和剂量减少指数。结果表明在神经丝蛋白68/200启动子的活性实验中，药对人参-远志，石菖蒲-茯苓以1:5组合时，其合并指数分别为0.3240和0.3924，均远远小于<1，表明药对以1:5组合时发挥协同效应；剂量减小指数分别为4.917/3.805(人参-远志)和8.288/7.714(石菖蒲-茯苓)，进一步证实此作用。结果参照图7C和图7D。

实施例7：蛋白激酶A抑制剂抑制药对组合对神经丝蛋白启动子活性的作用

细胞培养同实施例3，将PC12细胞接种在24孔板上，每孔细胞密度为8×10⁴个细胞，过夜培养让细胞贴壁。取12μLLipofectamin2000(LifeTechnology公司)加入600μLopti-MEM(LifeTechnology公司)中得到稀释的Lipofectamin2000溶液，室温孵育5分钟。取6μg神经丝蛋白68启动子质粒(pNF68-Luc，ActiveMotif,Carlsbad,CA)或神经丝蛋白200启动子质粒(pNF200-Luc，ActiveMotif,Carlsbad,CA)加入600μLopti-MEM中得到稀释的质粒。然后把稀释的质粒加入Lipofectamin2000溶液中，孵育20分钟后，取50μL依次加入24孔板。37℃孵育16小时后，换成1％胎牛血清和马血清的培养基，3小时后分别加蛋白激酶A抑制剂H89(5μM，Sigma)和细胞外调节蛋白激酶抑制剂U0126(20μM，Sigma)，37℃孵育3小时后，分别给药人参-远志、石菖蒲-茯苓、四味药混合后的水提物以及药对组合(即人参-远志与石菖蒲-茯苓以1:5组合)，于37℃培养48小时，给药剂量均为25μg/mL。然后收集细胞，用细胞裂解液裂解后获取细胞溶解液样品。将样品进行荧光素酶活性测定(FluostarOptima,BMGLabtechnology)。取四次实验的平均值，每次平行做三个孔。结果参照图8。四味药混合后的水提物、人参-远志、药对组合(即人参-远志与石菖蒲-茯苓以1:5组合)增强神经丝蛋白68启动子(图8A)和神经丝蛋白200启动子(图8B)活性的作用可以被蛋白激酶A抑制剂部分抑制，这提示四味药混合后的水提物、人参-远志药对、以及人参-远志与石菖蒲-茯苓的药对组合增强神经丝蛋白68和200启动子活性的作用可能是通过蛋白激酶A信号途径介导的。

可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。

Claims (10)

1.药物组合物，其包含人参-远志药对或其提取物，和/或石菖蒲-茯苓药对或其提取物。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述提取物为水提物。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对的重量比，或者人参-远志药对提取物和石菖蒲-茯苓药对提取物的重量比为8:1-1:8或2:1-1:8，优选为1:5。

4.如前述权利要求任一项所述的药物组合物，其中所述人参-远志药对中人参与远志的重量比为1:1，和/或所述石菖蒲-茯苓药对中石菖蒲与茯苓的重量比为1:2。

5.如前述权利要求任一项所述的药物组合物，其还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂；优选地，人参-远志药对或其提取物、和/或石菖蒲-茯苓药对或其提取物与所述赋形剂被配制成药学上可接受的剂型，优选为片剂、胶囊、丸剂、口服液等剂型。

6.前述权利要求任一项所述的药物组合物的制备方法，其包括将人参与远志、和/或石菖蒲与茯苓原料处理后，按一定重量比称取人参-远志药对和/或石菖蒲-茯苓药对，任选地将所述人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对合并；

或者将称取的人参-远志药对和/或石菖蒲-茯苓药对用合适的溶剂提取，将提取液干燥后得到人参-远志药对提取物和/或石菖蒲-茯苓药对提取物，任选地将上述两个药对提取物合并。

7.如权利要求6所述的制备方法，其中所述溶剂为水，优选地用水提取人参-远志药对和/或石菖蒲-茯苓药对1-3次，每次1-3小时。

8.如权利要求6或7所述的制备方法，所述人参-远志药对中人参与远志的重量比为1:1；和/或所述石菖蒲-茯苓药对中石菖蒲与茯苓的重量比为1:2；以及优选地，所述人参-远志药对和石菖蒲-茯苓药对的重量比，或者人参-远志药对提取物和石菖蒲-茯苓药对提取物的重量比为8:1-1:8，或2:1-1:8，优选为1:5。

9.权利要求1-5所述的药物组合物在制备用于增强记忆或治疗神经退行性疾病的药物中的用途，优选地，所述神经退行性疾病为抑郁症和老年痴呆症。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述药物组合物经口给药。