CN105510287B - 一种信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法。所述检测方法主要包括以下步骤：先对磁性纳米颗粒进行合成与核酸探针修饰，并结合滚环扩增技术与磁性分离富集技术以构建检测方法体系，随后对PBS缓冲液中不同浓度Hg2+样品进行荧光强度的扫描，得到Hg2+浓度与荧光强度之间的线性区间；再将检测方法体系应用于实际环境水样样本中Hg2+含量的检测，采用标准加入法，计算回收率，从而评估检测方法的实际应用性。本发明方法不仅可以达到传统方法的检测效果，而且具有良好的选择性；响应速度快、操作简便和价格低廉；荧光信号强且稳定，保证了实验方法的重复性以及荧光信号在复杂环境中的可辨识度，使得检测方法的实际应用性得到了强有力的保证。

Description

一种信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法
技术领域
本发明属于化学分析和生物检测技术领域，具体涉及一种信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法。
背景技术
汞在自然界中主要以单质和化合物的状态存在。单质汞即元素汞亦称为金属汞。汞的化合物又可分为有机汞化合物和无机汞化合物两大类。
金属汞中毒常以汞蒸气的形式引起。由于汞蒸气具有高度的扩散性和较大的脂溶性，通过呼吸道进入肺泡，经血液循环运至全身。血液中的金属汞进入脑组织后，被氧化成汞离子，逐渐在脑组织中积累，达到一定的量，就会对脑组织造成损害。另外一部分汞离子转移到肾脏。甲基汞在人体肠道内极易被吸收并分布到全身，大部分蓄积到肝和肾中，分布于脑组织中的甲基汞约占15％，但脑组织受损害的则先于其它各组织，主要损害部位为大脑皮层、小脑和末梢神经。因此，甲基汞中毒主要为神经系统症状。日本著名的公害病——水俣病即为甲基汞慢性中毒。
汞离子(Hg2+)是无机汞存在的最常见和最稳定的形式之一，由于其具有良好的水溶性和生物累积性，因而对水生生物以及人类健康具有严重的危害。为了防止汞中毒事件发生，《中华人民共和国环境保护法》所制定的生活饮用水和农田灌溉水的水质标准中都规定汞含量不得超过0.001mg/L。
目前，国内外已经有许多灵敏度和特异性较好的Hg2+检测方法逐渐运用到实践中。传统的Hg2+检测方法主要有原子(吸收、发射、荧光)光谱法、高效液相色谱法及电感耦合等离子质谱仪等。尽管这些检测方法能够得到比较精确的检测结果，但这些方法依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处理，且需要专门的技术人员进行操作，检测成本高，很难满足现场快速检测的要求。
近年来研究表明，Hg2+能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)结合形成稳定的T-Hg2 +-T结构。基于Hg2+的这一特殊性质，已经发展了多种Hg2+检测方法，如荧光分析法、电化学分析法和比色法等。其中，电化学分析法具有灵敏度高、响应速度快等优势，但是存在检测方法容易受到环境介质等因素的干扰以及信号稳定性较差等问题；比色法操作简单、不需要大型仪器设备，但是其灵敏度较低。荧光分析法由于能够很好的解决信号干扰以及具有良好的选择性和灵敏度等特性，近年来受到了研究者的亲睐。传统的荧光分析法由于采用的是具有短寿命荧光性质的染料，因而在检测应用中容易受到检测体系本身荧光以及生物体内源荧光的干扰，使得检测方法的背景信号偏高，影响检测方法的信噪比。因此，目前而言，发展一种快速、简便、稳定性和特异性好的环境水体中Hg2+的检测方法是必要的。
发明内容
为了能够有效地降低在环境水体中Hg2+含量检测中存在的检测信号易受干扰、信号不稳定以及背景信号强等问题，并提高检测信号的可辨识度与稳定性，本发明的目的在于提供一种基于滚环扩增技术和磁性Fe3O4纳米颗粒的Hg2+含量检测方法。通过本发明方法，实现了缓冲液以及实际环境水体样本Hg2+含量的简单、快速、稳定和特异性的检测。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法，包括以下步骤：
(1)合成氨基修饰磁性Fe3O4纳米颗粒NH2-Fe3O4，配制NH2-Fe3O4溶液；
(2)捕获探针H1修饰NH2-Fe3O4，配制H1-Fe3O4纳米颗粒溶液；
(3)配制不同浓度Hg2+的溶液；
(4)缓冲液中Hg2+含量检测；
(5)准备待测环境水体样本；
(6)标准加入法检测待测环境水体样本中Hg2+含量。
优选的，所述步骤(1)的具体步骤如下：将2.0质量份FeCl3·6H2O、14.0 质量份1,6-己二胺及4.0质量份无水醋酸钠溶解于60体积份乙二醇中形成混合溶液；然后将混合溶液在55℃条件下搅拌完全溶解形成透明溶液；随后将透明溶液转移到高压反应釜中，200℃反应6.0h；反应结束后将得到的产物(即氨基修饰磁性Fe3O4纳米颗粒NH2-Fe3O4)用超纯水和无水乙醇清洗以完全去除多余的溶剂与反应材料；最后将NH2-Fe3O4分散于超纯水中，4.0℃保存待用。
更优选的，所述FeCl3·6H2O、1,6-己二胺、无水醋酸钠、乙二醇、无水乙醇均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
更优选的，所述搅拌为机械搅拌，转速约为600rpm/min；所述高压反应釜为不锈钢内衬聚四氟乙烯反应釜(内衬容积为100mL)。
优选的，所述步骤(2)的具体步骤如下：取5.0体积份用PBS缓冲液分散的、浓度为0.02mg/mL的NH2-Fe3O4溶液，与2.0体积份用PBS缓冲液稀释配制的体积分数为2.5％的戊二醛溶液，室温(25℃～28℃)剧烈震荡反应3.0h，使纳米颗粒表面醛基修饰，即形成CHO-Fe3O4纳米颗粒；将CHO-Fe3O4纳米颗粒磁性分离并用PBS缓冲液洗涤去除多余的戊二醛；随后重新分散于5.0体积份PBS缓冲液中，并将0.02体积份浓度为1.0×10-5mol/L的捕获探针H1加入其中，震荡反应3.0h；反应完毕后，加入0.2体积份浓度为1.0×10-6mol/L的硼氢化钠溶液氧化封闭未反应的醛基；磁性分离、PBS缓冲液清洗，所得捕获探针H1修饰Fe3O4纳米颗粒(即H1-Fe3O4纳米颗粒)最终分散于PBS缓冲液 (pH＝8.0)中于4.0℃保存待用。
更优选的，所述PBS缓冲液的pH值为8.0，由Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl 配制而成。
优选的，步骤(3)所述的不同浓度Hg2+的溶液的配制：称取0.01713质量份Hg(NO3)2·H2O，加入1.0体积份硝酸溶液(硝酸溶液中硝酸与水的体积比＝1:1)，加少量水溶解，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，得到浓度为5.0×10-5mol/L的Hg2+溶液并贮存在密闭的玻璃瓶中。不同浓度Hg2+的溶液由此溶液稀释而来。
更优选的，所述不同浓度Hg2+的溶液浓度分别为：0、1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0nmol/L。
优选的，步骤(4)所述缓冲液中Hg2+含量检测的具体步骤为：准备一系列离心管，分别加入0.02体积份不同浓度Hg2+溶液、0.01体积份1.0μmol/L信号探针H2、H3，以及2.0体积份H1-Fe3O4纳米颗粒溶液；上述混合溶液室温 (25℃～28℃)反应20.0min，随后磁性分离去除上清液，PBS缓冲液洗涤去除未反应物质；洗涤完毕后，磁性纳米颗粒体系悬浮液加热到95℃后迅速在冰水混合物中冷却以有效释放信号探针H2和H3；最后磁性分离，测定上清液荧光强度变化以对Hg2+进行定量分析。
更优选的，所述信号探针H2和H3均为FAM修饰，所述FAM为5-羟基荧光素，H2为3端修饰FAM，H3为5端修饰FAM。FAM的最大激发波长约为 492～493nm，最大发射波长约为518～520nm。
更优选的，所述上清液荧光强度的测定仪器为Perkin-Elmer LS-55荧光磷光分光光度计，设定参数分别为最大激发波长493nm，最大发射波长520nm，激发和发射狭缝10nm。所述上清液荧光强度变化具体为：随着Hg2+含量从0到 15.0nmol/L逐渐升高，荧光强度从20.0逐渐升高到149.5。
更优选的，所述Hg2+含量测定过程中，Hg2+含量在1.0～6.0nmol/L时与荧光强度呈现良好的线性关系。
优选的，步骤(5)所述待测环境水体样本为：河水、饮用水或自来水样本。环境水体样本先用定量滤纸过滤，然后在高速离心机(12000rpm/min，10min) 上离心去除可见的悬浮物。
优选的，步骤(6)所述标准加入法检测待测环境水体样本中Hg2+含量步骤与步骤(4)一致，只是将步骤(4)中不同浓度Hg2+的溶液换为加入标准浓度 Hg2+的待测环境水体样本；所用仪器及参数与步骤(4)一致。
更优选的，所述加入的标准浓度Hg2+浓度分别为2.0、4.0、6.0nmol/L。
本发明最终可以通过回收率来考察检测方法的可行性，所述回收率计算公式为R＝[(C1–C2)/C3]×100％；其中，R表示回收率，C1表示检测方法检测到的 Hg2+浓度，C2表示环境水体样本中的初始Hg2+浓度，C3表示加入的标准浓度。
本发明利用滚环扩增技术对检测信号进行放大，利用磁性Fe3O4纳米颗粒的超顺磁性对检测体系进行磁性分离与富集，通过汞离子特异性寡核苷酸探针的特异性识别捕获Hg2+，提出了一种信号放大的环境水体中Hg2+含量的稳定性好和灵敏度高的检测方法。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)灵敏度高，最低检测限为0.36nmol/L；
(2)选择性好，除了含有Hg2+的样品具有明显的荧光信号响应外，含有其它金属离子的样品响应低；
(3)可应用于实际环境水体中的Hg2+含量的检测；
(4)本发明采用“turn-on”模式，解决了采用“turn-off”模式的检测方法可能出现的假阳性情况；
(5)本发明采用滚环扩增及磁性分离富集技术，使得检测荧光信号有效增强且信号稳定，保证了实验方法的重复性以及荧光信号在复杂环境中的可辨识度，使得检测方法的实际应用性得到了强有力的保证。
通过该方法，实现了缓冲液以及实际环境水体样本Hg2+含量的快速、稳定、灵敏和特异性的检测。本发明提出的Hg2+含量的检测方法，在有其它金属离子干扰的情况下，体现出了出色的选择性，并且在复杂的实际环境水样样本中也取得了良好的结果。本发明优越于传统检测方法的特点在于，利用滚环扩增及磁性分离富集技术，提高了检测信号的强度以及稳定性，使得检测方法在实际应用中的使用得到了有效地保证。该Hg2+含量检测方法可以实现对Hg2+的便捷分析，且操作简单、灵敏度高、特异性强，对多种非特异性的干扰金属离子的响应非常小，适合推广于实际环境水样Hg2+的监测中。
附图说明
图1为本发明中Hg2+及磁性Fe3O4纳米颗粒对FAM荧光信号影响。
图2为本发明中Hg2+检测培育时间优化。
图3为本发明中不同浓度Hg2+条件下荧光强度曲线图以及线性范围图。
图4为本发明Hg2+检测原理及流程示意图
图5为本发明中检测方法的选择性研究结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
以下实施例中所用到的捕获探针H1、信号探针H2和H3的选择，NH2-Fe3O4溶液、H1-Fe3O4纳米颗粒溶液和不同浓度Hg2+的溶液的配制步骤如下：
(1)本发明选用的捕获探针H1序列为：5’NH2-(C)6-GCT AAG TTT GTG GTT TGT CGTTAGC-3’；选用的信号探针H2序列为：5’AGA CGC CTG GCA GCC CGT CTT TCC TCT TTC-FAM3’，信号探针H3序列为：5’FAM-GGC TGC CAG GCG TCT GAA AGA GGA AAG ACG 3’。所有探针均购买于生工生物工程 (上海)股份有限公司，并溶解于超纯水中，–20℃保存。
(2)将2.0质量份FeCl3·6H2O、14.0质量份1,6-己二胺及4.0质量份无水醋酸钠溶解于60体积份乙二醇中形成混合溶液；然后将混合溶液在55℃条件下搅拌完全溶解形成透明溶液；随后将透明溶液转移到高压反应釜中，200℃反应 6.0h；反应结束后将得到的NH2-Fe3O4用超纯水和无水乙醇清洗，然后分散于超纯水中，4.0℃保存待用。
(3)取5.0体积份用PBS缓冲液分散的、浓度为0.02mg/mL的NH2-Fe3O4溶液，与2.0体积份用PBS缓冲液稀释配制的体积分数为2.5％的戊二醛溶液，室温震荡反应3.0h，形成CHO-Fe3O4纳米颗粒；将CHO-Fe3O4纳米颗粒磁性分离并用PBS缓冲液洗涤；随后重新分散于5.0体积份PBS缓冲液中，并将0.02 体积份浓度为1.0×10-5mol/L的捕获探针H1加入其中，震荡反应3.0h；反应完毕后，加入0.2体积份浓度为1.0×10-6mol/L的硼氢化钠溶液；磁性分离、PBS 缓冲液清洗，所得H1-Fe3O4纳米颗粒分散于10.0mL PBS缓冲液中于4.0℃保存待用。
(4)称取0.01713质量份Hg(NO3)2·H2O，加入1.0体积份硝酸溶液(1+1)，加水溶解，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，得到浓度为5.0× 10-5mol/L的Hg2+溶液；将此溶液稀释得到不同浓度Hg2+的溶液。
实施例1：本发明中Hg2+及磁性Fe3O4纳米颗粒对FAM荧光信号影响
本发明提出的方法中，Hg2+本身是否对FAM的荧光强度有影响对本发明提出的方法至关重要，因此本发明首先探讨了不同浓度Hg2+对FAM荧光强度的影响研究，具体步骤为：在8支离心管中，首先分别加入2.0体积份浓度为0、5.0、 10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0nmol/L的Hg2+溶液，随后分别加入2.0体积份浓度为0.1μM的信号探针H2。混匀室温反应30.0min，反应完毕后，在 Perkin-Elmer LS-55荧光磷光分光光度计上测定溶液荧光强度以分析不同浓度 Hg2+对FAM荧光强度的影响。Perkin-Elmer LS-55荧光磷光分光光度计参数设定为最大激发波长493nm，最大发射波长520nm，激发和发射狭缝10nm。分析结果如图1中的A所示。结果表明，在Hg2+浓度小于80nmol/L时，对FAM的荧光强度几乎没有影响，即使是在Hg2+浓度上升到100nmol/L时，荧光淬灭率也小于9.0％，由于本发明提出的方法通常用于检测低浓度的Hg2+含量，因而 Hg2+的存在对FAM荧光强度的影响可以忽略。同时，本发明采用的是“turn-on”模式，可以有效避免假阳性现象。
磁性Fe3O4纳米颗粒对ssDNA的非特异性吸附现象在本发明中也需考虑，因而实验研究了Fe3O4纳米颗粒的用量问题。实验探讨了20mg/L和80mg/L两种Fe3O4纳米颗粒用量对荧光强度的影响，具体步骤为：在3支离心管中，首先分别加入1.0体积份的浓度为1.0μM的H2与H3溶液，随后在3支离心管中分别加入2.0体积份的浓度为0、20、80mg/L的Fe3O4纳米颗粒溶液。混匀室温反应，分别在反应0、1.0、5.0h后在Perkin-Elmer LS-55荧光磷光分光光度计上测定溶液荧光强度以分析不同浓度Fe3O4纳米颗粒是否对ssDNA有非特异性吸附。Perkin-Elmer LS-55荧光磷光分光光度计参数设定为最大激发波长493nm，最大发射波长520nm，激发和发射狭缝10nm。研究结果如图1中的B所示。从图中可以看出，当与20mg/L磁性Fe3O4纳米颗粒反应5.0h后，与对照组相比荧光强度几乎没有变化，而与80mg/L磁性Fe3O4纳米颗粒反应5.0h后，与对照组相比荧光强度下降了约15％。因而本发明采用的磁性Fe3O4纳米颗粒的浓度为20mg/L。
实施例2：本发明中Hg2+检测培育时间优化
本发明对Hg2+与识别探针H1，及信号探针H2和H3加入后的培育时间进行了研究，具体步骤为：在10支离心管中，分别加入0.02体积份10nmol/L Hg2+溶液、0.01体积份1.0μmol/L信号探针H2、H3，以及2.0体积份0.1μmol/L的 H1-Fe3O4纳米颗粒溶液，混匀室温反应，分别在反应2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、 12.0、14.0、16.0、18.0、20.0min后磁性分离去除上清液，PBS缓冲液洗涤去除未反应物质；洗涤完毕后，磁性纳米颗粒体系悬浮液加热到95℃后迅速在冰水混合物中冷却以有效释放信号探针H2和H3；最后磁性分离，测定上清液荧光强度变化以对Hg2+进行定量分析。所用仪器与仪器参数设置与实施例2一致。研究结果如图2所示。从图中可以看出，随着培育时间增加，荧光强度逐渐增强，当培育时间达到20min后，荧光强度趋于稳定。因而，20min为本发明检测方法的最佳培育时间。
实施例3：灵敏度分析
为了进一步研究本发明提出的Hg2+检测方法的灵敏度，本发明对一系列不同浓度的Hg2+进行了检测研究，具体步骤与上述实施例2的步骤(即本发明所述的步骤(4))一致。选择的Hg2+浓度分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、 7.0、8.0、9.0、10.0和15.0nmol/L。结果记录在图3中的A中，从图中可以看出，Hg2+浓度与荧光强度有着明显的对应关系，随着Hg2+浓度的升高，荧光强度值升高。从图中还可以看出，即使是很微小的Hg2+浓度的变化，也能引起荧光强度明显的变化。综上可以说明，本发明提出的方法对水溶液中Hg2+的含量变化具有很好的灵敏性。
Hg2+的浓度与荧光强度的总体关系如图3中的B所示，图3中的C表示的是线性区域图。从图中可以看出，当Hg2+的浓度在1.0～6.0nmol/L时，Hg2+浓度与荧光强度呈现良好的线性关系，线性方程为Y＝17.80X+5.27，其中Y表示荧光强度，X表示Hg2+浓度，相关系数R为0.9985，最低检测限为0.36nmol/L。此检测限远远低于美国环境保护署和世界卫生组织对于饮用水中Hg2+浓度的限值。
本发明中对于Hg2+检测的原理及流程示意图如图4所示。
实施例4：选择性分析
为了探索本发明提出的Hg2+的检测方法的选择性，选择Ca2+,Mn2+,Cd2+, Cr3+,Ag+,Co2+,Cu2+,Mg2+,Ni2+,Pb2+,Zn2+,Al3+,Fe3+和Fe2+作为干扰离子进行了研究分析，具体步骤与上述实施例2的步骤(即本发明所述的步骤(4))一致，只是将其中所述“不同浓度Hg2+溶液”样品分别换为Hg2+溶液样品、上述所有金属离子混合样品1(包含Hg2+)、上述所有金属离子混合样品2(不包含Hg2+)、其他不同金属离子样品。其中，Hg2+浓度为10nmol/L，其他金属离子浓度为1.0 μmol/L。分析结果如图5所示，除了含有Hg2+样本有明显响应外，其它金属离子样本的响应较小，所以，本发明提出的检测方法具有良好的抗干扰能力，保证了其在实际环境水样中的应用研究。
实施例5：实际环境水体样本Hg2+含量的检测研究
为了研究本发明提出的方法的实际应用性，对3种环境水样(河水、饮用水和自来水)中的Hg2+含量进行了检测研究，具体步骤与本发明所述的步骤(6) 一致。由于这3种环境水样样本中的Hg2+含量均低于本发明提出的方法的最低检测限，所以本发明中采用标准加入法对其进行分析研究。水样样本先定量滤纸过滤，然后在高速离心机(12000rpm/min，10min)上离心去除可见的悬浮物。每个环境水样都分为3个样本，每个样本加入不同浓度的Hg2+溶液。Hg2+浓度分别为：2.0、4.0和6.0nmol/L。结果如表1所示。从表中可以看出，本发明提出的方法的检出结果的回收率保持在96.5％～105.5％之间，结果令人满意。上述结果表明，本发明提出的检测方法具有很好的实际应用性。
表1 环境水体样本回收实验结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成氨基修饰磁性Fe3O4纳米颗粒NH2-Fe3O4，配制NH2-Fe3O4溶液；
（2）捕获探针H1修饰NH2-Fe3O4，配制H1-Fe3O4纳米颗粒溶液；
（3）配制不同浓度Hg2+的溶液；所述不同浓度Hg2+的溶液浓度分别为：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0 nmol/L；
（4）缓冲液中Hg2+含量检测，步骤为：准备一系列离心管，分别加入0.02体积份不同浓度Hg2+溶液，0.01体积份1.0 μmol/L信号探针H2、H3，以及2.0体积份H1-Fe3O4纳米颗粒溶液；然后将混合溶液室温反应20.0 min，随后磁性分离去除上清液，PBS缓冲液洗涤；洗涤完毕后，磁性纳米颗粒体系悬浮液加热到95℃后在冰水混合物中冷却；最后磁性分离，测定上清液荧光强度变化以对Hg2+进行定量分析；
（5）准备待测环境水体样本；所述待测环境水体样本为：河水、饮用水或自来水样本；
（6）标准加入法检测待测环境水体样本中Hg2+含量，步骤为：准备一系列离心管，分别加入0.02体积份标准浓度Hg2+溶液，0.01体积份1.0 μmol/L信号探针H2、H3，以及2.0体积份H1-Fe3O4纳米颗粒溶液；所述加入的标准浓度Hg2+浓度分别为2.0、4.0、6.0 nmol/L；然后将混合溶液室温反应20.0 min，随后磁性分离去除上清液，PBS缓冲液洗涤；洗涤完毕后，磁性纳米颗粒体系悬浮液加热到95℃后在冰水混合物中冷却；最后磁性分离，测定上清液荧光强度变化以对Hg2+进行定量分析；所用荧光强度的测定仪器为Perkin-Elmer LS-55荧光磷光分光光度计，设定参数分别为最大激发波长493 nm，最大发射波长520 nm，激发和发射狭缝10 nm；
捕获探针H1序列为：5’ NH2-(C)6-GCT AAG TTT GTG GTT TGT CGT TAGC-3’；信号探针H2序列为：5’ AGA CGC CTG GCA GCC CGT CTT TCC TCT TTC-FAM 3’，信号探针H3序列为：5’ FAM-GGC TGC CAG GCG TCT GAA AGA GGA AAG ACG 3’。
2.根据权利要求1所述的信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体步骤如下：将2.0质量份FeCl3•6H2O、14.0质量份1,6-己二胺及4.0质量份无水醋酸钠溶解于60体积份乙二醇中形成混合溶液；然后将混合溶液在55℃条件下搅拌完全溶解形成透明溶液；随后将透明溶液转移到高压反应釜中，200℃反应6.0 h；反应结束后将得到的NH2-Fe3O4用超纯水和无水乙醇清洗，然后分散于超纯水中，4.0 ℃保存待用。
3.根据权利要求1所述的信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体步骤如下：取5.0体积份用PBS缓冲液分散的、浓度为0.02 mg/mL的NH2-Fe3O4溶液，与2.0体积份用PBS缓冲液稀释配制的体积分数为2.5%的戊二醛溶液，室温震荡反应3.0 h，形成CHO-Fe3O4纳米颗粒；将CHO-Fe3O4纳米颗粒磁性分离并用PBS缓冲液洗涤；随后重新分散于5.0 体积份 PBS缓冲液中，并将0.02体积份浓度为1.0 × 10-5 mol/L的捕获探针H1加入其中，震荡反应3.0 h；反应完毕后，加入0.2体积份浓度为1.0 × 10-6 mol/L的硼氢化钠溶液；磁性分离、PBS缓冲液清洗，所得H1-Fe3O4纳米颗粒分散于PBS缓冲液中于4.0℃保存待用。
4.根据权利要求1所述的信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤如下：称取0.01713质量份Hg(NO3)2·H2O，加入1.0体积份硝酸溶液，加水溶解，移入1000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，得到浓度为5.0 × 10-5 mol/L的Hg2+溶液；将此溶液稀释得到不同浓度Hg2+的溶液。
5.根据权利要求1所述的信号放大的高灵敏水环境中Hg2+检测方法，其特征在于，所述信号探针H2和H3均为FAM修饰，所述FAM为5-羟基荧光素，H2为3端修饰FAM，H3为5端修饰FAM；
所述上清液荧光强度的测定仪器为Perkin-Elmer LS-55荧光磷光分光光度计，设定参数分别为最大激发波长493 nm，最大发射波长520 nm，激发和发射狭缝10 nm。
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磁性纳米材料的制备及其对水体中微量污染物的吸附性能研究;王碧璇;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20140415(第04期);摘要，第11页第"2.2.2 氨基磁性纳米粒子的一步合成"节

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