CN105506112A - Prss8检测试剂在制备食管炎和胃炎诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术和医学技术领域，提供了检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂在制备食管炎和胃炎诊断试剂盒中的应用。还提供了一种食管炎和胃炎诊断试剂盒，本发明所提供的试剂盒能够对食管炎和胃炎进行早期筛查具有操作简单、高特异性、高灵敏性的优点。

Description

PRSS8检测试剂在制备食管炎和胃炎诊断试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物技术和医学技术领域，具体涉及检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂在制备食管炎和胃炎诊断试剂盒中的应用。
背景技术
PRSS8是丝氨酸蛋白酶家族的一个成员，最初于1994年在精液中发现，被证实由前列腺分泌，所以又被称为prostasin。PRSS8在人体内有两种存在形式，一种是通过其羧基末端的磷脂酰肌醇(GPI)结构锚定于细胞膜，另一种是以分泌蛋白的形式存在于细胞外。现有的研究大多数以前者为主，而分泌性PRSS8的功能则鲜有研究。
食管炎和胃炎作为常见病，危害着人类的健康，其发病机制复杂多样，如果不能及时治疗，则病情可迁延恶化，进而影响病人的生存质量和存活期，因此通过检查对食管炎和胃炎进行早期诊断有助于尽早的治疗疾病，控制病情的发展，避免进一步恶化。
发明内容
针对现有食管炎和胃炎诊断技术的不足，本发明的目的是是开发PRSS8在食管炎和胃炎诊断中的应用。
为实现上述目的，本发明提供了一种检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂在制备食管炎和胃炎诊断试剂盒中的应用。
其中，所述检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂包括实时荧光定量PCR引物对，在所述PCR引物对中。
上游引物序列为：5′-AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3′；
下游引物序列为：5′-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3′。
其中，所述检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂还包括本领域用于PRSS8检测的已知和未知的其他生物化学试剂，例如，为ELISA、PCR检测试剂、抗体等。
一种食管炎和胃炎诊断试剂盒，所述试剂盒含有丝氨酸蛋白酶PRSS8编码基因的实时荧光定量PCR引物对，在所述PCR引物对中，
上游引物序列为：5′-AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3′；
下游引物序列为：5′-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3′。
该试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和PCR反应常用的酶。
作为优选，试剂盒包括：组织总RNA提取试剂、逆转录试剂以及定量PCR试剂。
其中定量PCR试剂中还包括内参GAPDH的特异引物：
内参GAPDH的特异引物包括：
上游引物：5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′，如SEQIDNO：3所示；
下游引物:5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′，如SEQIDNO：4所示。
本发明的有益效果：本发明提供的应用通过利用检测试剂检测患者血清中PRSS8的水平，可以对胃炎、食管炎患者进行早期诊断。本发明在医学和分子诊断领域有实际意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1为PRSS8在食管炎病人和正常人的血清ELISA检测情况；
图2为PRSS8在胃炎病人和正常人的血清ELISA检测情况；
图3为PRSSE在食管炎病人、胃炎病人和正常人中mRNA表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
实施例1PRSS8在食管炎病人和正常人的血清中水平
1、一般资料
本研究中共48例血清样本，均来自于新乡市中心医院，其中食管炎血清样本20例，正常血清样本28例。所有食管炎患者以及正常组皆通过胃镜检查确诊。
2、标本收集
所有研究对象在抽血前均禁食8h以上，采集空腹静脉血约5ml，室温静置30min后以3000r/min离心10min，收集血清，-20℃冻存用于PRSS8浓度监测。
3、试剂及主要仪器
人prostasin(PRSS8)ELISA试剂盒(Lot:F10139905)购自CUSABIOBIOTECH公司。美国MD公司多功能酶标仪。
4、实验方法
采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中PRSS8浓度，每组血清样本设置3个重复，在多功能酶标仪中检测OD值，以3个重复的均值作为此组样本的最终OD值。分别比较食管炎组和胃炎组与正常组的PRSS8表达水平。
5、统计学方法
采用SPSS13.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，2组样本均数间比较采用t检验，P<0.05表示差异有显著意义。
参见图1，食管炎组血清PRSS8表达水平为4.58±1.67ng/ml，正常组血清PRSS8表达水平为3.52±1.49ng/ml，食管炎患者组PRSS8表达水平高于正常组，P<0.05，差异显著，有统计学意义。
实施例2PRSS8在胃炎病人和正常人血清中的水平。
1、一般资料
本研究中共88例血清样本，均来自于新乡市中心医院，胃炎血清样本60例，正常血清样本28例。所有胃炎患者以及正常组皆通过胃镜检查确诊。
标本收集、试剂及主要仪器、ELISA、统计学分析等同实施例1。
参见图2，胃炎组血清PRSS8表达水平为5.39±1.04ng/mlng/ml，正常组血清PRSS8表达水平为3.52±1.49ng/ml，胃炎患者组PRSS8表达水平高于正常组，P<0.05，差异显著，有统计学意义。
实施例3本实施例用于说明利用本发明所提供的试剂盒对食管炎进行检测。
(1)标本收集
本研究中共60例血清样本，均来自于新乡市中心医院，其中食管炎血清样本20例，胃炎血清样本20例，正常血清样本20例。所有食管炎患者、胃炎患者以及正常组皆通过胃镜检查确诊。样本收集均经新乡医学院伦理审查委员会同意。所有研究对象在抽血前均禁食8h以上，采集空腹静脉血，室温静置30min后以3000r/min离心10min，收集血清，进行RNA提取。
(2)试剂盒的组装
mRNA定量的反应体系：上游引物(20μm)、下游引物(20μm)、cDNA、H2O、荧光染料SYBRGreen。
PRSS8实时荧光定量PCR的上游引物为5′-AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3′；下游引物为5′-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3′。
内参GAPDH实时荧光定量PCR的上游引物为5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′；下游引物为5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。
3、逆转录和实时荧光定量PCR
用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(ThermoSCIENTIFIC，USA)按操作手册对mRNA进行逆转录。
逆转录的反应体系：总RNA1μg，逆转录引物1μl，AMVbuffer2μl，AMV0.5μl，10mMdNTP0.5μl，MgCl22μl，总体积10μl；反应条件：42℃60min，70℃10min，冰上放置2min。
用步骤1组装的试剂盒，通过实时荧光定量PCR(AppliedBiosystemsInc.)对PRSS8进行定量分析。
mRNA定量的反应体系：上游引物(20μm)0.15μl，下游引物(20μm)0.15μl，cDNA0.7μl，H2O9μl，荧光染料SYBRGreen(2X)10μl；反应条件：50℃2min，95℃2min；变性95℃15s，退火/延伸60℃1min，共40个循环。
PRSS8实时荧光定量PCR的上游引物为5′-AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3′；下游引物为5′-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3′。
内参GAPDH实时荧光定量PCR的上游引物为5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′；下游引物为5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。
结果显示食管炎患者组和胃炎患者组PRSS8表达水平高于正常组，P<0.001及P<0.05，差异显著，有统计学意义(参见图3)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂在制备食管炎和胃炎诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂包括实时荧光定量PCR引物对，在所述PCR引物对中，
上游引物序列为：5′-AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3′；
下游引物序列为：5′-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3′。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂包括PRSS8的ELISA检测试剂。
4.一种食管炎和胃炎诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有丝氨酸蛋白酶PRSS8编码基因的实时荧光定量PCR引物对，在所述PCR引物对中，
上游引物序列为：5′-AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3′；
下游引物序列为：5′-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3′。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括PCR反应常用的试剂。
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CN101273144A (zh) * 2005-07-27 2008-09-24 肿瘤疗法科学股份有限公司 诊断食道癌的方法

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