CN105506039A - 米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法 - Google Patents

米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法，包括以下步骤：将8～10ml察氏培养基倒入培养皿中，接种米曲霉，于25～28℃培养110～130小时；然后加入10ml蒸馏水混匀，得米曲霉混悬液；先按照虾壳：葡萄糖：水＝5g:1～2g:25～30ml的比例配制成发酵基料，然后在发酵基料中加入米曲霉混悬液，于25～28℃发酵28～32天；所得的发酵液离心，收集上清液，经滤纸过滤，再通过孔径为5K的超滤膜，收集滤过液，经活性炭脱色，得活性多肽溶液；所述活性多肽即为抗氧化肽。

Description

米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法
技术领域
本发明涉及一种利用虾壳制备抗氧化肽的方法。
背景技术
来自虾壳的抗氧化肽安全性高，无毒副作用；利用虾壳开发具有清除自由基、延缓衰老作用的抗氧化肽具有重要的理论意义和应用价值。目前现有的利用蛋白酶水解虾壳制取抗氧化肽的研究有如下几种：
一、201210161452.9的发明《一种利用虾壳制备抗氧化肽的方法》，步骤如下：
A)、将虾壳清洗除杂，在40～60℃下烘干20～26小时，用粉碎机磨粉，过40～100目筛，制成虾壳粉，然后加水配制成质量百分比为4～8％的虾壳粉溶液；
B)、将虾壳粉溶液的pH调节到8.0～12.0，然后加入蛋白酶1000～5000U/g，在20～80℃水浴中水解1～4小时，水解在搅拌状态下进行，并保持温度和pH恒定，得到虾壳蛋白水解液；
C)、将虾壳蛋白水解液于85～100℃水浴灭活蛋白酶10～20分钟，冷却至室温后，在2000～6000r/min转速下离心10～20分钟，取上清液，用截留分子量≤10000Da的超滤膜进行超滤，得到虾壳多肽超滤液；
D)、将虾壳多肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到虾壳抗氧化肽产品。
所制得的虾壳多肽超滤液中多肽含量可达0.699mg/mL，FRAP还原能力为1.419nmol/mL。
二、公布于《南方水产科学》2015年第6期《虾头虾壳蛋白质酶解制备抗氧化肽的研究》(张风、夏旭、周爱梅、刘欣、曹庸)告知了以下内容：以凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)虾头、虾壳为原料，碱法提取蛋白质后，采用不同的蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶)酶解，以抗氧化活性和水解度为指标，筛选最佳水解用酶，并对该酶的酶解条件进行优化，对优化所得酶解物的抗氧化活性进行初步研究。结果表明，风味蛋白酶为最佳水解用酶，虾头虾壳蛋白质水解制备抗氧化肽的最佳工艺条件为：温度54℃、时间10.5h、pH8、加酶量8000U/g，此条件下酶解液1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为96.58％，还原力为0.77，水解度为15.62％，氧化自由基吸收能力(ORAC)为15.50μmol/L。5mg/mL时该酶解物的DPPH自由基清除率为82.09％，相当于相同浓度维生素C(Vc)抗氧化活性的90.50％；0.5mg/mL时，ORAC为126.16μmol/L，相当于相同浓度Vc活性的79.73％。
上述方法均采用蛋白酶进行酶解，存在酶解温度高的缺陷。蛋白酶酶解工艺还存在成本高的缺点，蛋白酶一般每吨2.0万元左右，且不可回收重复利用；同时，高温灭酶能耗高，且蛋白酶会变为杂质存在于酶解液中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、多肽含量高的米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法，包括以下步骤：
1)、米曲霉培养：
将8～10ml察氏培养基倒入培养皿中，接种(1接种环)米曲霉，于25～28℃培养110～130小时(此时，米曲霉长满培养皿，较佳为培养120小时)；然后加入10ml蒸馏水混匀，得米曲霉混悬液；
2)、先按照虾壳：葡萄糖：水＝5g:1～2g:25～30ml的比例配制成发酵基料，然后在发酵基料中加入米曲霉混悬液，于25～28℃发酵28～32天；
每5g的虾壳配用0.8～1.2ml(较佳为1ml)的米曲霉混悬液；
3)、步骤2)所得的发酵液离心，收集上清液，经滤纸过滤，再通过孔径为5K的超滤膜，收集滤过液，经活性炭脱色，得活性多肽溶液；所述活性多肽即为抗氧化肽。
作为本发明的米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法的改进：该米曲霉购自中国菌种保藏中心，编号:3.0951，名称为少根根霉戴尔变种。
作为本发明的米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法的改进：
所述步骤3)中：
所述离心为：于4000～5000rpm转速离心25～35min；
所述活性炭脱色为：在100ml滤过液中加入15～20g活性炭，静置15-20分钟后(从而实现脱色)，滤除活性炭，得活性多肽溶液。
采用邻苯三酚自氧化法测得本发明所得的活性多肽溶液对超氧阴离子自由基清除率为58.4％。其对DPPH自由基清除率为43.4％。
本发明具有如下技术优势：
1、无需事先对虾壳进行烘干处理，也无需将虾壳磨成粉，即，直接以新鲜虾壳为原料进行制备；且，无需进行pH值的调节；因此，能简化生产工艺；
2、反应温度低，能大大降低能耗；
3、所得产物中多肽含量高；
4、生产成本低：由于蛋白酶价格贵，因此本发明采用微生物发酵可大大降低成本。
具体实施方式
实施例1、一种米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法，依次进行以下步骤
1)、米曲霉培养：将8～10ml配好的查氏培养基倒入培养皿中，接种1环(接种环)米曲霉，于25～28℃培养。待米曲霉长满培养皿后(约120小时)，加入10ml蒸馏水，混匀，得米曲霉混悬液，取1ml用于发酵接种。
该米曲霉购买自中国菌种保藏中心，编号:3.0951；名称为少根根霉戴尔变种。
2)、按照虾壳：葡萄糖：水的质量体积比为5:1.5:30(g/g/ml)配制发酵基料，然后加入1ml米曲霉混悬液，于温度25～28℃发酵30天；
3)、发酵液经4000～5000rpm转速离心30min，收集上清液，经滤纸过滤，再通过孔径为5K的超滤膜，收集滤过液，经活性炭脱色(加入活性炭15-20g/100ml，脱色15-20分钟，过滤除活性炭)，即得活性多肽溶液，多肽含量为9.75mg/ml。活性多肽即为抗氧化肽。
采用邻苯三酚自氧化法测得多肽溶液对超氧阴离子自由基清除率为58.4％。其对DPPH自由基清除率为43.4％。
对比例1-1、将实施例1中的“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:1.5:30(g/g/ml)”改成“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:3:30(g/g/ml)”，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1中的“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:1.5:30(g/g/ml)”改成“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:0.5:30(g/g/ml)”，其余等同于实施例1。
对比例2-1、将实施例1中的“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:1.5:30(g/g/ml)”改成“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:1.5:40”，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1中的“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:1.5:30(g/g/ml)”改成“虾壳：葡萄糖：水质量体积比为5:1:15”，其余等同于实施例1。该案例中，水量太少无法拌匀培养基；发酵效果非常差，不建议使用。
上述对比例1-1～对比例2-1所得的活性多肽溶液的性能，如下表1所示；
表1
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、米曲霉培养：
将8～10ml察氏培养基倒入培养皿中，接种米曲霉，于25～28℃培养110～130小时；然后加入10ml蒸馏水混匀，得米曲霉混悬液；
2)、先按照虾壳：葡萄糖：水＝5g:1～2g:25～30ml的比例配制成发酵基料，然后在发酵基料中加入米曲霉混悬液，于25～28℃发酵28～32天；
每5g的虾壳配用0.8～1.2ml的米曲霉混悬液；
3)、步骤2)所得的发酵液离心，收集上清液，经滤纸过滤，再通过孔径为5K的超滤膜，收集滤过液，经活性炭脱色，得活性多肽溶液；所述活性多肽即为抗氧化肽。
2.根据权利要求1所述的米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法，其特征是：
该米曲霉为中国菌种保藏中心的编号:3.0951的少根根霉戴尔变种。
3.根据权利要求2所述的米曲霉发酵虾壳制备抗氧化肽的方法，其特征是：
步骤3)中：
所述离心为：于4000～5000rpm转速离心25～35min；
所述活性炭脱色为：在100ml滤过液中加入15～20g活性炭，静置15-20分钟后，滤除活性炭，得活性多肽溶液。
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