CN105505909A - 一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶化学领域，具体公开一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法，具体为在马来酸顺反异构酶参与的酶解反应体系中添加岩藻糖。本发明通过实验优化了岩藻糖的添加浓度，使最大程度的提高马来酸顺反异构酶的酶活力。本发明所述方法简单易行，在马来酸顺反异构酶反应过程中具有可以节约酶用量，提高反应效率的优点。

Description

一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法
技术领域
本发明涉及酶化学领域，具体地说，涉及一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法。
背景技术
富马酸(Fumaricacid)，又称反丁烯二酸、延胡索酸，是一种天然存在的有机酸，广泛用于食品、医药、化工、涂料、增塑剂等领域。如在食品方面，可用作口味纯正的酸味剂、风味增强剂。在医药方而，可以用于生产解毒药二琉基丁二酸钠等，富马酸铁则广泛应用于医学上治疗人体的小红血球贫血病。目前，富马酸的生产大都通过石化方法由马来酸酐制备得到，然而化学合成法存在成本高、副产物多及可能造成的环境污染等问题，这使得人们的目光逐渐转向环境友好的生物法来制备富马酸。
马来酸顺反异构酶(EC5.2.1.1,Maleatecis-transIsomerase,MaiA)是一种能够将马来酸(顺丁烯二酸)催化转化成富马酸(反丁烯二酸)的异构酶，能够在碳碳双键不断裂的情况下，实现顺式丁烯二酸向反式丁烯二酸的异构化，属于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族。
酶作为一种生物催化剂，对环境十分敏感，易受物理、化学和生物等因素的影响而失活，如何提高酶的稳定性及酶活力已成为酶学反应研究的重点。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了岩藻糖在提高马来酸顺反异构酶酶活力中的应用。
进一步地，本发明提供一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法，具体为在马来酸顺反异构酶参与的酶解反应体系中添加岩藻糖。
岩藻糖(fucose)是六碳糖的一种，又称6-脱氧-L-半乳糖，并可以看做是一种甲基戊糖。自然界存在的岩藻糖绝大多数为L-岩藻糖，D构型的岩藻糖仅作为稀有糖，发现于一些糖甘类化合物中。已知岩藻糖的生理效应体现在：1、神经传导；2、免疫调节；3、抑制癌症之生长及转移；4、呼吸道感染之预防与治疗；5、胶原蛋白之调节。
本发明经大量客观试验发现，蛋白质在溶液中可能会由于疏水作用而发生聚集引发变性，酶的活性中心在一定条件下可能发生聚集作用而导致活性失活。岩藻糖比一般六碳糖在第六碳原子上少一个羟基，所以岩藻糖比其他单糖亲水性弱，而疏水性强一些。由于这种特性，岩藻糖可能与酶的活性中心结合起到稳定酶活性结构的作用，同时这种特性也可能有助于底物和产物进出酶的活性中心，从而加快酶的反应速率，提高酶的稳定性。
添加时，所述岩藻糖可直接添加固体也可配制成水溶液添加。在反应体积较小的反应体系中，若直接加入岩藻糖固体其添加量很小，为了便于称量，可先配制成高浓度的岩藻糖水溶液，用移液枪进行添加，例如：在500μL反应体系中，要使岩藻糖终浓度为0.5mmol/L，添加0.5μL、0.5mol/L的岩藻糖水溶液即可。
发明人通过实验发现，当所述岩藻糖相对于酶解反应体系的添加浓度为0.3～1.0mmol/L时，马来酸顺反异构酶的酶活力显著提高。
当所述岩藻糖相对于酶解反应体系的添加浓度为0.5mmol/L时，酶活力最高，在37℃、pH8.4的酶解反应条件下，其酶活力比未添加岩藻糖的酶活力提高了26％。
进一步地，所述酶解反应条件为20～50℃，pH3.5～9.0。
为了更好的促进马来酸顺反异构酶进行酶解，所述酶解反应的条件为37℃，pH8.4。在该温度和pH条件下，更加适宜马来酸顺反异构酶发挥酶解功能。
进一步地，所述酶解反应体系中，马来酸顺反异构酶的浓度为20～200U，反应底物的浓度为100～2500mmol/L。该浓度条件下，马来酸顺反异构酶催化马来酸转化为富马酸的效率较高，转化率可达到90％以上。
作为优选，所述酶解反应体系中，马来酸顺反异构酶的浓度为20～50U，反应底物的浓度为100～1000mmol/L。该浓度条件，能够最好的发挥岩藻糖提高酶活力的作用。
进一步地，所述反应底物为马来酸或马来酸盐。
更进一步地，所述马来酸顺反异构酶来源于假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、节杆菌属(Arthrobacter)或含有马来酸顺反异构酶基因或其突变体基因的工程菌的培养物或分泌物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述马来酸顺反异构酶购自江南大学，由来源于粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的马来酸顺反异构酶编码基因重组大肠杆菌BL21表达产生。
本发明还提供了一种以马来酸为原料生产富马酸的方法，包括如下步骤：
1)将比活为50U/mg的马来酸顺反异构酶酶液，用缓冲液稀释至pH8.4，加入pH8.4浓度为1mol/L的马来酸溶液中；
所述马来酸顺反异构酶酶液与马来酸溶液的体积比为9:1；
2)加入岩藻糖，使岩藻糖相对于整个反应体系的浓度为0.3～1.0mmol/L；
3)35～40℃反应15～30min，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液进行处理，得到富马酸。
作为优选，所述缓冲液为pH8.4，50mmol/L的NaHPO4-KH2PO4缓冲液。
本发明的有益效果在于：
本发明发现，在马来酸顺反异构酶参与的酶解反应体系中添加岩藻糖，能够提高马来酸顺反异构酶酶活力。因此提供一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法，所述方法简单易行，在马来酸顺反异构酶反应过程中具有可以节约酶用量，提高反应效率的优点。
附图说明
图1为本发明实施例2中不同浓度岩藻糖对马来酸顺反异构酶酶活力的影响示意图。
图2本发明实施例3中添加岩藻糖对马来酸顺反异构酶反应稳定性的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中所用马来酸顺反异构酶，购于江南大学，由来源于粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的马来酸顺反异构酶编码基因重组大肠杆菌BL21表达产生；购买厂家只是说明原料的可行性，不用来限制本发明的范围。
实施例1马来酸顺反异构酶酶活力的测定
取450μl用pH8.4反应缓冲溶液(50mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液)适当稀释的酶液(酶液比活为50U/mg)，加入50μl、1mol/L马来酸(KOH调至pH8.4)溶液，于37℃反应20min后，用0.45μm有机滤膜过滤，滤液用HPLC测定富马酸含量。酶活的定义：37℃、pH8.4的条件下该反应体系中每分钟转化底物马来酸生成1μmol产物富马酸所需的酶量定义为一个酶活力单位1U。
HPLC色谱柱为LaChromC18(5μm4.6×250mm)；流动相为体积分数8％的甲醇水溶液，流速0.6mL/min；UV检测器测波长为210nm，柱温为30℃。
实施例2岩藻糖浓度对马来酸顺反异构酶酶活力的影响
在实施例1中的反应体系中添加岩藻糖，岩藻糖终浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mmol/L。实验结果如图1所示。结果显示，当为岩藻糖浓度为0.5mmol/L时，酶活力最高，比未添加岩藻糖的提高了26％。
相对酶活力的定义：以反应体系中不添加岩藻糖时测得的酶活为分母，得到不同岩藻糖浓度下测定的相对酶活。
实施例3岩藻糖对马来酸顺反异构酶反应稳定性的影响
对照组的酶液不添加岩藻糖，试验组的酶液添加0.5mmol/L的岩藻糖，室温放存，每8h取酶液按实施例1中的方法检测酶活力，实验结果如图2所示。从图中可以看出，添加岩藻糖组酶活力的衰减速率较慢，48h后酶活保留率为84.2％，而此时未加岩藻糖组的酶活保留率仅为58％
相对酶活力的定义：以反应体系中未添加岩藻糖组0h测得的酶活为分母，得到不同时间点测定的相对酶活。
酶活保留率：(室温放存0h的酶活-取样时的酶活)/室温放存0h的酶活。
实施例4利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法
取450μl用pH8.4反应缓冲溶液(50mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液)适当稀释的酶液(酶液比活为50U/mg)，加入50μl、1mol/L马来酸(KOH调至pH8.4)溶液，反应体系中添加1μl、0.25mol/L的岩藻糖水溶液(反应体系中岩藻糖终浓度为0.5mmol/L)，于37℃反应20min。
实施例5～7利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法
实施例5～7与实施例4的区别在于：反应体系中添加的岩藻糖浓度分别为：0.3、0.7和1.0mmol/L。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.岩藻糖在提高马来酸顺反异构酶酶活力中的应用。
2.一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法，其特征在于，在马来酸顺反异构酶参与的酶解反应体系中添加岩藻糖。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖相对于酶解反应体系的添加浓度为0.3～1.0mmol/L，优选0.5mmol/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶解反应体系中，马来酸顺反异构酶的浓度为20～200U，反应底物的浓度为100～2500mmol/L；优选马来酸顺反异构酶的浓度为25～50U，反应底物的浓度为100～1000mmol/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应底物为马来酸或马来酸盐。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖为固体或水溶液。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶解反应条件为20～50℃，pH3.5～9.0；优选37℃，pH8.4。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述马来酸顺反异构酶来源于假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、节杆菌属(Arthrobacter)或含有马来酸顺反异构酶基因或其突变体基因的工程菌的培养物或分泌物。
9.一种以马来酸为原料生产富马酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将比活为50U/mg的马来酸顺反异构酶酶液，用缓冲液稀释至pH8.4，加入pH8.4浓度为1mol/L的马来酸溶液中；
所述马来酸顺反异构酶酶液与马来酸溶液的体积比为9:1；
2)加入岩藻糖，使岩藻糖相对于整个反应体系的浓度为0.3～1.0mmol/L；
3)35～40℃反应15～30min，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液进行处理，得到富马酸。
10.根据权利要求2～8任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH8.4，50mmol/L的NaHPO4-KH2PO4缓冲液。
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