CN105504045B - 一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽与SLA-2重链、轻链β2m复性、结晶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽与荷包猪SLA‑2重链、轻链β2m复性、结晶的方法。本发明以荷包猪为例，构建SLA‑2胞外部区原核表达载体，转入宿主菌获得SLA‑2‑HB，设计与其匹配的口蹄疫病毒流行毒株多肽As63，与重链SLA‑2‑HB、轻链sβ2m通过稀释复性法进行共结合，分离复性蛋白质复合物并浓缩。本发明的结果显示，SLA‑2‑HB能够与亚洲I型口蹄疫多肽As63成功复性，晶体分辨率为，晶体SLA‑2‑HB‑As63‑sβ2m呈现非对称双分子的构型，两个分子中多肽的折叠方式相同，其中除了第二位和第九位为锚定残基外，第五位氨基酸也充当锚定残基的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽与荷包猪SLA-2重链、轻链β2m复性、结晶的方法。
背景技术
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)，简称MHC，是脊椎动物所具有的与免疫应答相关的一类基因群。MHC分为I，II和III类。其中，MHC I类分子与细胞免疫应答有关，这是由MHC I类分子特殊的空间结构决定的。从上世纪八十年代开始，人们逐渐开始了对MHC I类分子晶体结构的研究。
人的MHC，亦称为人的白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)。1987年，Bjorkman等(Nature,1987,6139:506-512)首次解析了人的HLA-A2的三维晶体结构，MHC I由重链α和轻链β2微球蛋白组成。重链α包括胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区部分由3个结构域组成：α1、α2和α3，每个结构域包含大约有90个氨基酸；跨膜区的结构域由大约25个疏水氨基酸构成，带有一段带电的亲水氨基酸；胞内锚定的部分由30个氨基酸残基组成。其中，α1与α2具有相似的三级结构，α3与β2m具有相似的折叠。β2m以99个氨基酸的折叠与α链通过非共价键结合，无跨膜区。MHC I类分子中的α3与β2m靠近细胞膜，α3通过它的疏水跨膜部分和亲水的胞内部分镶嵌在细胞膜内。α1与α2形成整个分子的顶部，螺旋状结构域指向胞外，用于被TCR识别。
猪的MHC又称猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)，其基因组区域只有1.1Mb，是目前已知最小的哺乳动物MHC基因连锁群(Renard,et al.,Genomic,2006,88:96-100)。SLA位于猪的7号染色体上，分为class I、class II和class III三类区域基因。II类区域基因位于长臂上，I和III类区域基因位于短臂上，分别靠近端粒和着丝粒。
SLA-2基因是猪SLA-Ⅰ类分子重要的基因座，与SLA-1，SLA-3一起构成Ⅰ类分子的3个典型的功能基因群。
张念之等(J Virol,2011,22:11709-11724)最近解析了猪SLA-1*0401晶体结构。该研究中，SLA-1*0401和流感多肽S-OIV-NA449-457(NSDTVGWSW)及埃博拉病毒多肽Ebolavirus-vp35155-163(ATAAATEAY)成功获得晶体。
然而，到目前为止，猪SLA-2的晶体结构还未见报道。尤其缺乏口蹄疫病毒多肽与SLA I类分子形成晶体的研究。课题组长期研究猪SLAI类分子，并专注于口蹄疫病毒表位的设计和筛选。在前期研究的基础上，以实验室构建的荷包猪SLA-2重链和β2m轻链为蛋白，与一优化筛选出的亚洲I型口蹄疫病毒多肽表位在体外进行复性，并获得晶体，解析SLA-2晶体结构，为今后更加准确设计猪源病毒多肽表位提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是：研究猪SLA-2与β2m与多肽形成的复合体空间结构，解析SLA-2空间结构，为今后详细研究SLA-2的抗原递呈功能提供了依据。
本发明的技术方案为：以荷包猪为例，构建SLA-2胞外部区原核表达载体，转入宿主菌获得表达蛋白及其包涵体(SLA-2-HB)。利用netMHCpan2.8设计与SLA-2-HB匹配的口蹄疫病毒流行毒株多肽，与重链SLA-2-HB、轻链sβ2m成熟肽按照摩尔比3:1:1通过稀释复性法进行共结合，通过分子筛检测。分离复性蛋白质复合物并浓缩，调整复合物浓度分别为7.5mg/mL和15mg/mL的浓度，在晶体生长液中进行晶体的生长。结果显示，SLA-2-HB表达蛋白大小约为33kDa，在sβ2m存在的情况下，能够与O型口蹄疫多肽As63成功复性。当晶体浓度为10mg/mL的时候，用Hampton Research试剂盒筛选出现高质量的晶体，分辨率为晶体经解析后分析显示，SLA-2-HB-As63-sβ2m呈现非对称双分子的构型，分析显示，两个分子中多肽的折叠方式相同，其中除了第二位和第九位为锚定残基外，第五位氨基酸也充当锚定残基的作用，具体步骤如下。
1、引物设计与合成
依据荷包猪SLA-2全基因编码序列，分别设计扩增其胞外区的上游引物和下游引物：
2、多肽的合成
通过预测网站NetMHC 2.8 Server以亚洲I型口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMDV)病毒毒株EF149009-FMDV-Asia1/Jiangsu/Wuxi/China/2005的全序列，设计了As63口蹄疫病毒多肽，序列为ALLRSATYY。
3、SLA-2-HB胞外区表达载体的构建
用pHB21F/pHB-21R1作为引物对，以荷包猪SLA-2-HB01/pMD18-T全基因重组质粒为模板，扩增荷包猪SLA-2胞外区部分，PCR产物5′端带有Nde I限制性酶切位点CA/TATG，3′端带有Xho I限制性酶切位点CT/CGAG。建立如下PCR反应体系，总体积为50μL：
PCR反应条件为
PCR产物经切胶回收，并经过Nde I和Xho I双酶切后，与经过同样处理的pET-21a(+)空载体进行连接，转化BL21感受态细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒进行双酶切鉴定筛选阳性克隆，并测序。
4、诱导表达、包涵体提取及SDS-PAGE电泳检测表达蛋白
测序正确的SLA-2重链阳性克隆菌与轻链sβ2m表达菌在有Amp抗性的固体LB平板上划线，平板在37℃培养12小时，挑取单菌落至装有3mL LB+3μLAmp(100mg/mL)培养基的试管中培养10h，把培养好的菌液50μL接入装有50mL LB液体培养基的锥形瓶内，培养基内加入50μL的Amp，锥形瓶37℃恒温振荡过夜培养。用大三角瓶配制2L的LB液体培养基，121℃20min灭菌。将过夜培养的菌往大三角瓶内按1:100的比例接种，并加入2mL(100mg/mL)的Amp。在大摇床内37℃恒温震荡培养约2个小时测OD值，直至OD为0.5时加入2mL的IPTG(1mol/L)进行诱导，37℃培养5h后收菌。将培养的菌转入500mL的离心杯中，4℃，6000rpm，15min收菌，倒掉上清只留菌体沉淀。收菌后(接下去步骤都在低温下进行)，用60ml左右1×PBS悬浮(60μl DTT，1‰)，超声裂解(超6S，间隔12S，99+99次，250W左右)。中间看是否有沉淀，有则搅拌，之后超声。16000rpm，15min，4℃，用玻棒将细菌碎片拨掉，washing buffer(共100mL+100μL DTT，1‰)洗3次。每次超声：4S，10S，25次，250W左右，超声条件可以自行调整。每次超声后16000rpm，15min，washing buffer洗涤，尽量去除细菌碎片。称重。16000rpm，15min，resuspension buffer(60mL+60μL DTT，1‰)悬浮。16000rpm，15min，按30mg/ml用dissolution buffer(按1％加入DTT)溶解，4℃搅拌溶解(过夜)。16000rpm，15min，倒出上清或分装成1ml/管，于-20℃或-80℃保存备用。
5、重链SLA-2-HB、轻链sβ2m及其口蹄疫病毒表位多肽的体外结合
荷包猪重链SLA-2-HB、轻链β2m与口蹄疫病毒As63表位肽在体外结合：
(1)稀释法复性蛋白质
①配制500mL refolding buffer(100mmol/L Tris,pH8.0,400mmol/L L-ArgHCl,2mmol/L EDTA,5mmol/L GSH,0.5mmol/L GSSH(复性液预冷后加入)0.5mmol/L PMSF)，4℃缓慢搅拌至其完全溶解混匀。
②用5mL或10mL注射器将溶解后的包涵体(约3-5ml，可分3次加，每次间隔8-10小时左右)加入注射器内，使之一滴一滴的往refolding buffer内滴下(如果用的是尿素溶解的话，包涵体应该会冻了起来，可用injection buffer溶解后再加入注射器内)，慢慢搅拌8-10小时(可适当延长时间)。(在4℃条件下进行)。先加β2m，再加多肽，最后加重链(重链分三次加)，重链：轻链：多肽＝1:1:3(摩尔比)。
③复性后，可用浓缩杯浓缩样品换液(适合于此蛋白的缓冲液，一般为分子筛buffer)，再转到浓缩管内浓缩，如果复性体系小的话可直接用浓缩管浓缩换液。(复性后如果复性液变得浑浊，可低温离心去除沉淀后再浓缩。)(4℃条件下进行)
(2)蛋白质浓缩
将复性蛋白质体系转入到500mL的离心管内6000rpm，4℃离心15min，去沉淀。在4℃冷库将上清转入到350mL的搅拌式超滤装置(Stirred Cells)中，浓缩杯底部事先装好蛋白截留膜(10kDa，Millipore Centricon)，利用N2进行加压浓缩，当浓缩至30mL时加入事先预冷抽滤好的分子筛buffer(20mmol/L Tris pH8.0，50mmol/L NaCl)至体积150mL。继续浓缩重复上述步骤。最后浓缩至30mL，将溶液转移至30mL离心管中，16000rpm，4℃离心15min，将上清转到超滤浓缩管(Millipore Centricon)中进一步浓缩至4mL。将浓缩好的蛋白换到EP管中13300rpm，4℃离心10min，换管去沉淀；再重复上述步骤一次，检查是否有沉淀，若有继续重复一次，若没有沉淀，冰上放置以备上样用。
(3)分子筛和SDS-PAGE鉴定多肽结合
分子筛buffer洗涤AKTA的上样泵，之后再用分子筛buffer平衡凝胶柱Superdex200pg HiLoad 16/600预装柱。将样品12000rpm，10min，4℃离心去气泡以备上样。以1mL/min的流速运行，按OD280，mAU>20的标准进行收集，定量每管收集1.8mL。收集峰值处的样品进行制备蛋白样品，然后SDS-PAGE鉴定是否结合。
将跑胶显示为复性的蛋白质收集后浓缩，以备点晶体用。
6、SLA-2-HB-As63-sβ2m复合物蛋白质结晶
①将纯化得到的复性蛋白质复合物经分子筛buffer换液，并用10kDa的超滤浓缩管浓缩至100μL左右，用BSA法测定蛋白质浓度，分别稀释成7.5mg/mL和15mg/mL的浓度。
②利用Index1-48，Index49-96，PEG/IonⅠ，PEG/IonⅡ,Crystal ScreenⅠ，CrystalScreenⅡ，PEGRxⅠ，PEGRxⅡ等试剂盒，利用座滴法于4℃和18℃分别进行蛋白复合物的晶体筛选。
③在48孔的座滴板中，每孔加入120μL晶体试剂(池液)，在晶体孔中加入1μL蛋白和1μL池液，使其混合，用胶带将48孔板密封，放入晶体生长柜中。一周后，用低倍显微镜观察是否有晶体长出，并做好标记。
④如果有晶体生长，将晶体拍照保存，送到X光机上进行衍射鉴定。如果晶体是蛋白晶体且衍射效果较好，可以直接收集晶体的数据，如果衍射的效果不佳，则需要重新筛选晶体生长条件或者优化。
⑤优化的条件是通过改变初筛条件中的沉淀剂，缓冲pH，离子浓度或者添加剂的方法得到。得到了质量较好的蛋白晶体后，重复上述步骤④。
本发明的有益效果，本发明采用了原核表达系统，高表达了荷包猪的SLA I分子的重链胞外区域和轻链，通过稀释复性法使SLA-2、多肽与sβ2m体外正确结合折叠，具有快捷、直观等优点。经过多肽设计的进一步优化，选择As63作为候选多肽与荷包猪SLA-2-HB和sβ2m进行复性和结晶，结果发现其偏好的pH为6.5，SLA-2-HB-As63-sβ2m结果获得高质量的单晶，晶体分辨率达到进一步分析显示，SLA-2-HB-As63-sβ2m呈现非对称的双分子结构，但多肽结合槽多肽的结合方式相同，揭示SLA-2-HB-As63-sβ2m只有一种构象。
附图说明
图1是荷包猪SLA-2胞外区PCR扩增产物，其中M：DL2000 Marker；1：SLA-2-HB胞外区；
图2是荷包猪SLA-2-HB-pET-21a(+)重组质粒图，其中M：DL2000 Marker；1：SLA-2-HB-pET-21a(+)质粒；
图3是荷包猪SLA-2-HB-pET-21a(+)重组质粒的双酶切鉴定，其中M：DL2000Marker；1：SLA-2-HB-pET-21a(+)酶切结果；
图4是荷包猪的SLA-2-HB-pET-21a(+)试表达，其中M：低分子量蛋白Marker；1：对照，没有加IPTG诱导的SLA-2-HB-pET-21a(+)-BL21重组菌表达；2：SLA-2-HB-pET-21a(+)-BL21蛋白试表达；
图5是荷包猪SLA-2重链包涵体提取SDS-PAGE图，其中M：低分子量蛋白Marker；1：SLA-2-HB-pET-21a(+)-BL21包涵体蛋白；
图6是猪轻链sβ2m包涵体提取SDS-PAGE图，其中，M：低分子量蛋白Marker；1：sβ2m-pET-21a(+)-BL21包涵体蛋白；
图7是SLA-2-HB-As63-sβ2m分子筛；
图8Index79#SLA-2-HB-As63-sβ2m的晶体；
图9是SLA-2-HB-As63-sβ2m的晶体衍射图；
图10是SLA-2-HB-As63-sβ2m的晶体；
图11是SLA-2-HB-As63-sβ2m两种非对称分子多肽折叠方式比较；
图12是SLA-2-HB-As63-sβ2m抗原多肽结合槽结构。
具体实施方式
现结合实施类对本发明进步进行说明。
实施类1
1、引物设计与合成
依据荷包猪SLA-2全基因编码序列，分别设计扩增其胞外区的上游引物和下游引物：
2、多肽的合成
通过预测网站NetMHC 2.8 Server(http://genome.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)以O型口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMDV)病毒毒株HQ116229-FMDV-O-HuBHK99的全序列，设计了As63口蹄疫病毒多肽，序列为ALLRSATYY，由上海强耀生物科技有限公司合成。
3、SLA-2-HB胞外区表达载体的构建
用pHB21F/pHB-21R1作为引物对，以荷包猪SLA-2-HB01/pMD18-T全基因重组质粒为模板(序列号为AB602431，重组条件见发表文章Microbiology and Immunology,2012,56:208-215)，扩增荷包猪SLA-2胞外区部分，命名为SLA-2-HB，大小为820bp左右，产物如图1所示，PCR产物5′端带有Nde I限制性酶切位点CA/TATG，3′端带有Xho I限制性酶切位点CT/CGAG。
建立如下PCR反应体系，总体积为50μL：
PCR反应条件为
PCR产物经切胶回收，并经过Nde I和Xho I双酶切后，与经过同样处理的pET-21a(+)空载体进行连接，转化BL21感受态细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒进行双酶切鉴定筛选阳性克隆。阳性克隆送生物公司测序。
荷包猪SLA-2-HB-pET-21a(+)质粒提取结果，如图2所示，质粒大小约为6260bp，与预期大小相符。
荷包猪SLA-2-HB-pET-21a(+)质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后的结果，如图3所示，pET-21a(+)空载体为5443bp，目的基因大小为820bp。
重组质粒SLA-2-HB-pET-21a(+)在BL21中培养3h后经过IPTG诱导，37℃下震荡培养6h，裂解菌体提取蛋白进行SDS-PAGE，蛋白表达条带大小约为33kDa。如图4所示。
4、诱导表达、包涵体提取及SDS-PAGE电泳检测表达蛋白
测序正确的SLA-2重链阳性克隆菌与轻链sβ2m表达菌在有Amp抗性的固体LB平板上划线，平板在37℃培养12小时，挑取单菌落至装有3mL LB+3μLAmp(100mg/mL)培养基的试管中培养10h，把培养好的菌液50μL接入装有50mL LB液体培养基的锥形瓶内，培养基内加入50μL的Amp，锥形瓶37℃恒温振荡过夜培养。用大三角瓶配制2L的LB液体培养基，121℃20min灭菌。将过夜培养的菌往大三角瓶内按1:100的比例接种，并加入2mL(100mg/mL)的Amp。在大摇床内37℃恒温震荡培养约2个小时测OD值，直至OD为0.5时加入2mL的IPTG(1mol/L)进行诱导，37℃培养5h后收菌。将培养的菌转入500mL的离心杯中，4℃，6000rpm，15min收菌，倒掉上清只留菌体沉淀。收菌后(接下去步骤都在低温下进行)，用60ml左右1×PBS悬浮(60μl DTT，1‰)，超声裂解(超6S，间隔12S，99+99次，250W左右)。中间看是否有沉淀，有则搅拌，之后超声。16000rpm，15min，4℃，用玻棒将细菌碎片拨掉，washing buffer(共100mL+100μL DTT，1‰)洗3次。每次超声：4S，10S，25次，250W左右，超声条件可以自行调整。每次超声后16000rpm，15min，washing buffer洗涤，尽量去除细菌碎片。称重。16000rpm，15min，resuspension buffer(60mL+60μL DTT，1‰)悬浮。16000rpm，15min，按30mg/ml用dissolution buffer(按1％加入DTT)溶解，4℃搅拌溶解(过夜)。16000rpm，15min，倒出上清或分装成1ml/管，于-20℃或-80℃保存备用。
通过2L大瓶培养表达大肠杆菌，提取重链与轻链包涵体进行SDS-PAGE鉴定，结果如图5和图6所示，重链蛋白质大小约为33kDa，轻链蛋白质大小约为12kDa。
5、重链SLA-2-HB、轻链sβ2m及其口蹄疫病毒表位多肽的体外结合
荷包猪重链SLA-2-HB、轻链β2m与口蹄疫病毒As63表位肽在体外结合试验。
(1)稀释法复性蛋白质
①配制500mL refolding buffer(100mmol/L Tris,pH8.0,400mmol/L L-ArgHCl,2mmol/L EDTA,5mmol/L GSH,0.5mmol/L GSSH(复性液预冷后加入)0.5mmol/L PMSF)，4℃缓慢搅拌至其完全溶解混匀。
②用5mL或10mL注射器将溶解后的包涵体(约3-5ml，可分3次加，每次间隔8-10小时左右)加入注射器内，使之一滴一滴的往refolding buffer内滴下(如果用的是尿素溶解的话，包涵体应该会冻了起来，可用injection buffer溶解后再加入注射器内)，慢慢搅拌8-10小时(可适当延长时间)。(在4℃条件下进行)。先加β2m，再加多肽，最后加重链(重链分三次加)，重链：轻链：多肽＝1:1:3(摩尔比)。
③复性后，可用浓缩杯浓缩样品换液(适合于此蛋白的缓冲液，一般为分子筛buffer)，再转到浓缩管内浓缩，如果复性体系小的话可直接用浓缩管浓缩换液。(复性后如果复性液变得浑浊，可低温离心去除沉淀后再浓缩。)(4℃条件下进行)。
将荷包猪的重链SLA-2、口蹄疫病毒表位多肽与轻链sβ2m进行体外稀释复性，通过分子筛以及SDS-PAGE鉴定其是否复性，得到分子筛与SDS-PAGE结果如图7所示。SDS-PAGE标注的泳道编号为分子筛收集样品的编号。本发明所用分子筛凝胶柱为Hiload 10/600Superdex200pg，蛋白质复性的样品中包含了SLA-2重链、口蹄疫病毒表位多肽As63和轻链sβ2m，复合物大小约为45kDa，出峰位置在75-90mL之间，不同的重链与多肽之间形成的不同的复合物以及不同的柱子都会导致出峰位置的略微不同。复性蛋白质情况只有一种，即重链与轻链摩尔比为1:1(SDS-PAGE图中重链与轻链质量比为3:1)。而不复性的蛋白质情况有三种：只有重链聚合；重链轻链摩尔比例不为1:1；只有轻链。结果发现SLA-2-HB与As63及sβ2m成功复性。
(2)蛋白质浓缩
将复性蛋白质体系转入到500mL的离心管内6000rpm，4℃离心15min，去沉淀。在4℃冷库将上清转入到350mL的搅拌式超滤装置(Stirred Cells)中，浓缩杯底部事先装好蛋白截留膜(10kDa，Millipore Centricon)，利用N2进行加压浓缩，当浓缩至30mL时加入事先预冷抽滤好的分子筛buffer(20mmol/L Tris pH8.0，50mmol/L NaCl)至体积150mL。继续浓缩重复上述步骤。最后浓缩至30mL，将溶液转移至30mL离心管中，16000rpm，4℃离心15min，将上清转到超滤浓缩管(Millipore Centricon)中进一步浓缩至4mL。将浓缩好的蛋白换到EP管中13300rpm，4℃离心10min，换管去沉淀；再重复上述步骤一次，检查是否有沉淀，若有继续重复一次，若没有沉淀，冰上放置以备上样用。
(3)分子筛和SDS-PAGE鉴定多肽结合
分子筛buffer洗涤AKTA的上样泵，之后再用分子筛buffer平衡凝胶柱Superdex200pg HiLoad 16/600预装柱(GE，AmershamBiosciences公司)。将样品12000rpm，10min，4℃离心去气泡以备上样。以1mL/min的流速运行，按OD280，mAU>20的标准进行收集，定量每管收集1.8mL。收集峰值处的样品进行制备蛋白样品，然后SDS-PAGE鉴定是否结合。
将跑胶显示为复性的蛋白质收集后浓缩，以备点晶体用。
6、SLA-2-HB-As63-sβ2m复合物蛋白质结晶
①将纯化得到的复性蛋白质复合物经分子筛buffer换液，并用10kDa的超滤浓缩管浓缩至100μL左右，用BSA法测定蛋白质浓度，分别稀释成7.5mg/mL和15mg/mL的浓度。
②用Hampton Research公司的Index1-48，Index49-96，PEG/IonⅠ，PEG/IonⅡ,Crystal ScreenⅠ，Crystal ScreenⅡ，PEGRxⅠ，PEGRxⅡ等试剂盒，利用座滴法于4℃和18℃分别进行蛋白复合物的晶体筛选。
③在48孔的座滴板中，每孔加入120μL晶体试剂(池液)，在晶体孔中加入1μL蛋白和1μL池液，使其混合，用胶带将48孔板密封，放入晶体生长柜中。一周后，用低倍显微镜观察是否有晶体长出，并做好标记。
④如果有晶体生长，将晶体拍照保存，送到X光机上进行衍射鉴定。如果晶体是蛋白晶体且衍射效果较好，可以直接收集晶体的数据，如果衍射的效果不佳，则需要重新筛选晶体生长条件或者优化。
⑤优化的条件是通过改变初筛条件中的沉淀剂，缓冲pH，离子浓度或者添加剂的方法得到。得到了质量较好的蛋白晶体后，重复上述步骤④。
HB-SLA-2-As63-sβ2m在4℃条件下，在Index 79号条件得到了晶体。
晶体的条件为Index79#15mg/mL 4℃，0.2M Ammonium acetate，0.1M BIS-TRISpH 6.5，25％w/v Polyethylene glycol 3,350，见图8。
经过X-衍射，HB-SLA-2-As63-sβ2m的晶体结构衍射达到了其晶体衍射图见图9。
经过分析，SLA-2-HB-As63-sβ2m是一个非对称的双分子结构，如图10所示。解析抗原多肽结合槽，显示SLA-2-HB-As63-sβ2m双分子晶体所结合的多肽As63呈现两种基本相同的折叠方式，表明SLA-2-HB-As63-sβ2m只有一种构象存在，见图11。进一步分析发现，SLA-2-HB-As63-sβ2m多肽结合槽中As63多肽除了第二位和第九位是锚定残基外，第五位氨基酸也起到锚定残基的作用，这种多肽结合更牢固，见图12。
本发明对设计pET-21a(+)载体表达荷包猪SLA-2胞外区基因上，该表达载体的特点是5′端多克隆位点临近处只含有一个Tag标签蛋白，而Tag上游含有一个Nde I酶切位点，利用这个酶切位点可以把Tag去掉；另外，在多克隆位点的3′端只有一个His标签蛋白，为了有利于蛋白结构的研究，通过在插入基因末端人为设置终止密码子的方法去掉了His标签，这样避免了切割His标签蛋白带来的一系列复杂的工作，也有利于蛋白在复性时能最大程度恢复天然结构。
本发明采用原核表达系统，高表达了荷包猪的SLA I分子的重链胞外区域和轻链，通过稀释复性法使SLA-2、多肽与sβ2m体外正确结合折叠，再利用分子筛分离纯化复性蛋白质。
经过多肽设计的进一步优化，选择As63作为候选多肽与荷包猪SLA-2-HB和sβ2m进行复性和结晶，结果发现其偏好的pH为6.5，接近偏酸性环境。SLA-2-HB-As63-sβ2m获得高质量的单晶，晶体分辨率达到进一步分析显示，SLA-2-HB-As63-sβ2m呈现非对称的双分子结构，但分析显示只呈现一种构象。对SLA-2-HB-As63-sβ2m晶体多肽结合槽进一步分析显示，其多肽结合槽As63多肽除了第二位和第九位是锚定残基外，第五位氨基酸也起到锚定残基的作用，这种多肽结合更牢固。
<110> 大连大学
<120> 一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽与SLA-2重链、轻链β2m复性、结晶的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggaattccat atgggcccgc attccctgag ctattcttac 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agtctcgagt tagtcccatc tcagggtgag gggctcctgc 40
Claims (1)
1.一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽与SLA-2重链、轻链β2m复性、结晶的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、引物设计与合成
依据荷包猪SLA-2全基因编码序列，分别设计扩增其胞外区的上游引物pHB21F和下游引物pHB-21R1：
上游引物pHB21F：5′-GGAATTCCATATGGGCCCGCATTCCCTGAGCTATTCTTAC-3′，Nde Ⅰ限制性酶切位点CA/TATG，
下游引物pHB-21R1：5′-AGTCTCGAGTTAGTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTCCTGC-3′，Xho Ⅰ限制性酶切位点CT/CGAG；
(2)、多肽的合成
通过预测网站NetMHC 2.8 Server以亚洲I型口蹄疫病毒毒株的全序列，设计了As63口蹄疫病毒多肽，序列为：ALLRSATYY；
(3)、SLA-2-HB胞外区表达载体的构建
用pHB21F/pHB-21R1作为引物对，以荷包猪SLA-2-HB01/pMD18-T全基因重组质粒为模板，扩增荷包猪SLA-2胞外区部分，PCR产物5′端带有Nde I限制性酶切位点CA/TATG，3′端带有Xho I限制性酶切位点CT/CGAG，建立如下PCR反应体系，总体积为50μL：包括2.5mmol/LdNTPs 4μL，25pmol/μL上游引物1μL，25pmol/μL下游引物1μL，30ng SLA-2全基因组质粒1μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL ExTaq酶0.5μL，灭菌水37.5μL；
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃45s，72℃1.5min，共30cycles；72℃10min；4℃保存；
PCR产物经切胶回收，并经过Nde I和Xho I双酶切后，与经过同样处理的pET-21a(+)空载体进行连接，转化BL21感受态细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒进行双酶切鉴定筛选阳性克隆，并测序；
(4)、诱导表达、包涵体提取及SDS-PAGE电泳检测表达蛋白
测序正确的SLA-2重链阳性克隆菌与轻链sβ2m表达菌在有Amp抗性的固体LB平板上划线，平板在37℃培养12小时，挑取单菌落至装有3mL LB+3μL浓度为100mg/mL Amp的培养基的试管中培养10h，把培养好的菌液50μL接入装有50mL LB液体培养基的锥形瓶内，培养基内加入50μL的Amp，锥形瓶37℃恒温振荡过夜培养，用大三角瓶配制2L的LB液体培养基，121℃20min灭菌，将过夜培养的菌往大三角瓶内按1:100的比例接种，并加入2mL浓度为100mg/mL的Amp，在大摇床内37℃恒温震荡培养2个小时测OD值，直至OD为0.5时加入2mL浓度为1mol/L的IPTG进行诱导，37℃培养5h后收菌，将培养的菌转入500mL的离心杯中，4℃下，转速为6000rpm，离心15min后收菌，倒掉上清只留菌体沉淀，收菌后，在低温下，用60ml1×PBS的悬浮液悬浮菌体，悬浮液含60μl DTT，终浓度为1‰，然后超声裂解，每一次超声6S，间隔12S，重复198次，250W，中间看是否有沉淀，有则搅拌，之后继续超声；4℃下，转速为16000rpm，离心15min，用玻棒将细菌碎片拨掉，washing buffer共100mL，加入100μL DTT，至终浓度为1‰，洗3次，每次洗后超声4S，间隔10S，重复25次，250W，超声后转速16000rpm，离心15min，washing buffer洗涤，去除细菌碎片；称重，转速16000rpm，离心15min，去上清，沉淀用60mL resuspension buffer，加入60μL DTT，至终浓度为1‰，悬浮，转速16000rpm，离心15min；按30mg/ml用dissolution buffer溶解，dissolution buffer中加入DTT至终浓度为1％，4℃搅拌溶解过夜，转速16000rpm，离心15min，倒出上清或分装成1ml/管，于-20℃或-80℃保存备用，
(5)、荷包猪重链SLA-2-HB、轻链β2m及其口蹄疫病毒表位多肽的体外结合
荷包猪重链SLA-2-HB、轻链β2m与口蹄疫病毒As63表位肽在体外结合：
1)稀释法复性蛋白质
①配制500mL refolding buffer，配方为100mmol/L Tris，pH8.0，400mmol/L L-ArgHCl，2mmol/L EDTA，5mmol/L GSH，0.5mmol/L GSSH，复性液预冷后加入0.5mmol/L PMSF，4℃缓慢搅拌至其完全溶解混匀，
②用5mL或10mL注射器将溶解后的包涵体加入注射器内，使之一滴一滴的往refoldingbuffer内滴下，慢慢搅拌8-10小时，在4℃条件下，先加轻链β2m，再加多肽，最后分三次加荷包猪重链SLA-2-HB，按摩尔比，荷包猪重链SLA-2-HB：轻链β2m：多肽＝1:1:3，
③复性后，可用浓缩杯浓缩样品换液，缓冲液为分子筛buffer，再转到浓缩管内浓缩，如果复性体系小的话可直接用浓缩管浓缩换液，复性后如果复性液变得浑浊，4℃条件下离心去除沉淀后再浓缩，
2)蛋白质浓缩
将复性蛋白质体系转入到500mL的离心管内，转速6000rpm，4℃下离心15min，去沉淀，在4℃冷库将上清转入到350mL的搅拌式超滤装置中，浓缩杯底部事先装好10kDaMillipore Centricon蛋白截留膜，利用N2进行加压浓缩，当浓缩至30mL时加入事先预冷抽滤好的分子筛buffer至体积150mL，分子筛buffer为20mmol/L Tris，pH8.0，50mmol/LNaCl，继续浓缩重复上述步骤，最后浓缩至30mL，将溶液转移至30mL离心管中，转速16000rpm，4℃下离心15min，将上清转到超滤浓缩管中进一步浓缩至4mL，将浓缩好的蛋白换到EP管中，转速13300rpm，4℃下离心10min，换管去沉淀；再重复上述步骤一次，检查是否有沉淀，若有继续重复一次，若没有沉淀，冰上放置以备上样用；
3)分子筛和SDS-PAGE鉴定多肽结合
分子筛buffer洗涤AKTA的上样泵，之后再用分子筛buffer平衡凝胶柱Superdex 200pgHiLoad 16/600预装柱，将样品4℃下，转速12000rpm，离心10min，去气泡以备上样，以1mL/min的流速运行，按OD280，mAU>20的标准进行收集，定量每管收集1.8mL，收集峰值处的样品进行制备蛋白样品，然后SDS-PAGE鉴定是否结合，
将跑胶显示为复性的蛋白质收集后浓缩，以备点晶体用；
(6)、SLA-2-HB-As63-sβ2m复合物蛋白质结晶
①将纯化得到的复性蛋白质复合物经分子筛buffer换液，并用10kDa的超滤浓缩管浓缩至100μL，用BSA法测定蛋白质浓度，分别稀释成7.5mg/mL和15mg/mL的浓度，
②利用Index1-48，Index49-96，PEG/Ion Ⅰ，PEG/Ion Ⅱ,Crystal Screen Ⅰ，CrystalScreen Ⅱ，PEGRx Ⅰ，PEGRx Ⅱ试剂盒，利用座滴法于4℃和18℃分别进行蛋白复合物的晶体筛选，
③在48孔的座滴板中，每孔加入120μL池液，在晶体孔中加入1μL蛋白和1μL池液，使其混合，用胶带将48孔板密封，放入晶体生长柜中，一周后，用低倍显微镜观察是否有晶体长出，并做好标记，
④如果有晶体生长，将晶体拍照保存，送到X光机上进行衍射鉴定，如果晶体是蛋白晶体且衍射效果好，可以直接收集晶体的数据，如果衍射的效果不佳，则需要重新筛选晶体生长条件或者优化，
⑤优化的条件是通过改变初筛条件中的沉淀剂，缓冲pH，离子浓度或者添加剂的方法得到，得到了质量好的蛋白晶体后，重复上述步骤④。
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