CN105483276A - Kcnip4基因及其表达产物在直肠腺癌诊疗中的应用 - Google Patents

Kcnip4基因及其表达产物在直肠腺癌诊疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了KCNIP4基因及其表达产物在直肠腺癌诊疗中的应用，具体地涉及KCNIP4基因及其表达产物在直肠腺癌诊断和治疗中的应用。经实验证明，KCNIP4基因在直肠腺癌组织中高表达，通过检测KCNIP4基因的表达水平，可以诊断患者是否患有直肠腺癌。本发明同时公开了KCNIP4基因在制备治疗直肠腺癌药物中的应用。

Description

KCNIP4基因及其表达产物在直肠腺癌诊疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及KCNIP4基因及其表达产物在直肠腺癌诊断、治疗中的应用。
背景技术
直肠腺癌是危害人类健康的一种常见的恶性肿瘤，在全世界范围内位居恶性肿瘤第四位，在我国消化道恶性肿瘤中发生率位居第三位，仅次于胃癌和食道癌。在西方发达国家中，其更是仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤。现在，对于直肠腺癌的病因仍不完全清楚，但是普遍认为与饮食习惯、遗传因素、慢性炎症、精神因素、环境因素等密切相关。近年来，随着生活水平的不断提高，直肠腺癌在我国的发病率和死亡率(尤其是在老年人中的发病率)正逐年增加。直肠腺癌已经严重影响了人们的生活质量和生命健康。如何加强对直肠腺癌的预防、诊断、治疗和预后评估已经得到了人们广泛的重视。
肿瘤的发生发展是一个多步骤的复杂过程，涉及多种基因，受多种因素的影响。目前认为直肠癌的发病机制大致有两条途径：(1)染色体不稳定途径：遵循“正常粘膜-腺瘤-腺癌”的组织发生顺序。此途径认为引起直肠腺癌的原因是染色体的不稳定引起的癌基因的激活和抑癌基因的失活突变。(2)错配修复途径：是由于错配修复系统功能障碍导致的微卫星不稳定。微卫星不稳定阳性的散发直肠腺癌是由锯齿状腺瘤发展而来，其不遵循传统的“腺瘤-腺癌”的模式。
目前临床上判断肿瘤预后主要依据临床病理分期，由于肿瘤的生物学异质性，其形成需要经过一个长期的、多阶段、多种基因突变积累的过程。单以临床病理分期来评估肿瘤预后有一定的局限性，因此，进一步寻找出简单、易使用的预后相关生物学标记势在必行，这也有助于发展新的肿瘤靶向治疗方案。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种直肠腺癌诊疗的分子标记物。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供了KCNIP4基因及其表达产物在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用。
进一步，上面所提到的产品能够通过检测直肠粘膜组织中KCNIP4基因的表达水平来诊断患者是否患有直肠腺癌，KCNIP4基因的高表达与直肠腺癌的发生、发展相关。
进一步，所述通过检测直肠粘膜组织中KCNIP4基因的表达水平包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测KCNIP4基因及其表达产物的表达水平进行检测。
其中，所述用RT-PCR来诊断直肠腺癌的产品至少包括一对特异扩增KCNIP4基因的引物；所述用实时定量PCR诊断直肠腺癌的产品至少包括一对特异扩增KCNIP4基因的引物；所述用免疫检测诊断直肠腺癌的产品包括：与KCNIP4蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断直肠腺癌的产品包括：与KCNIP4基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断直肠腺癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KCNIP4蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KCNIP4基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KCNIP4基因转录水平的针对KCNIP4基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KCNIP4蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KCNIP4基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KCNIP4蛋白的特异性抗体。
本发明提供了一种诊断直肠腺癌的产品，所述产品能够通过检测直肠粘膜组织中KCNIP4基因的表达水平来诊断直肠腺癌。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KCNIP4基因转录水平的针对KCNIP4基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KCNIP4蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KCNIP4基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KCNIP4蛋白的特异性抗体。
进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测KCNIP4基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对KCNIP4基因的引物和/或探针。根据SEQIDNO.2所示的核苷酸序列信息设计出可以用于检测KCNIP4基因表达水平的引物和探针。
本发明中针对KCNIP4基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明中所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
所述KCNIP4蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述KCNIP4蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KCNIP4蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
本发明还提供了KCNIP4基因及其表达产物在制备治疗直肠腺癌的药物中的应用。
一方面，本发明所述的“治疗直肠腺癌的药物”包含KCNIP4基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制KCNIP4基因表达的物质、抑制KCNIP4基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制KCNIP4基因表达产物活性的物质。
另一方面，本发明所述的“治疗直肠腺癌的药物”包括能够括抑制细胞生长、促进细胞凋亡的物质。
进一步，本发明所述的治疗直肠腺癌的药物包括：通过干扰RNA抑制KCNIP4基因表达的双链核糖核酸，或基于KCNIP4抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制KCNIP4蛋白活性的蛋白质。
优选的，所述抑制剂是针对KCNIP4基因的siRNA
本发明还提供了一种用于治疗直肠腺癌的药物，所述药物包含KCNIP4基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制KCNIP4基因表达的物质、抑制KCNIP4基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制KCNIP4基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制KCNIP4基因表达的双链核糖核酸，或基于KCNIP4抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制KCNIP4蛋白活性的蛋白质。
本发明的药物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，多种药物联合使用可以提高治疗的成功率。
进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。
本发明的药物可以使用不同的添加剂进行制备，例如杀菌剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个；糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子表面活性剂或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
本发明的药物还可包括药学上可接受的包衣材料。所述包衣材料包括但不限于明胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、壳聚糖、羧甲基纤维素盐、醋酸纤维素酞酸酯、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、丙烯酸树脂类、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。
本发明药物的单位剂型可以使多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如丸剂、粉剂、片剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如悬浮液、溶液、乳状液、酏剂、糖浆等。
本发明所述药物可以通过任何途径给予受体，只要能达到目标组织，其可通过口服或非口服的多种途径，如口服给药、肺内给药、直肠内给药、鼻内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、肌内给药、静脉内给药。
在本发明中，所述RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
为了确保KCNIP4基因能够被高效剔除或沉默，根据KCNIP4基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashiret.al2001，Schwarzet.al2003，Khvorovaet.al2003，Reynoldset.al2004，Hsiehet.al2004，Ui-Teiet.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgramofWhiteheadInstitute(BingbingYuanet.al2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTMRNAiDesignerofINVITROGEN(winnerofthe2004Frost&SullivanExcellenceinResearchAward，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBIBLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
在本发明的上下文中，“KCNIP4基因”包括KCNIP4基因以及KCNIP4基因的任何功能等同物的多核苷酸。KCNIP4基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中KCNIP4基因(NC_000004.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，KCNIP4基因的编码序列包括以下任意一种DNA分子：
(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述KCNIP4基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，KCNIP4基因表达产物包括KCNIP4蛋白以及KCNIP4蛋白的部分肽。所述KCNIP4蛋白的部分肽含有与直肠腺癌相关的功能域。
“KCNIP4蛋白”包括KCNIP4蛋白以及KCNIP4蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括KCNIP4蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或插入发生变异的突变体、与修饰的氨基酸序列功能相同的突变体及在高或低的严格条件下能与KCNIP4的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，KCNIP4蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述KCNIP4蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质，提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是KCNIP4蛋白的融合蛋白。对于与KCNIP4蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留KCNIP4蛋白的生物学活性即可。
本发明的KCNIP4蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留KCNIP4蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了KCNIP4基因的表达水平与直肠腺癌的发生发展相关，通过检测受试者直肠粘膜组织中KCNIP4的表达水平，判断患者是否患有直肠腺癌或患直肠腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案；使用分子标记物进行诊断，具有更及时、更灵敏、更特异性的效果。
附图说明
图1显示QPCR法检测KCNIP4基因在直肠腺癌组织中的表达情况；
图2显示QPCR法检测siRNA对KCNIP4基因表达的影响；
图3显示MTT法检测KCNIP4基因表达对直肠腺癌细胞生长的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物
1、样品的收集
各收集8例直肠腺癌组织和直肠腺癌癌旁正常组织样本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)
1)制冰，取组织放入研钵，将其研为碎末，研磨过程要保持组织冷冻。
2)将组织转入1.5mlEP管中，加入1mlTrizol试剂，用研磨棒细研磨，漩涡混合器充分匀浆，冰浴10min。
3)4℃，12000rpm离心10min。
4)吸取上层水相至另一新1.5mlEP管中，加入与上清等体积的异丙醇，反复吹打，冰浴10min。
5)4℃，12000rpm离心10min。
6)吸取上清至另一新1.5mlEP管中，加入与上清等体积的异丙醇，反复吹打，冰浴10min。
7)4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
8)加入75％乙醇1ml摇振充分混匀，4℃，7500rpm离心10min，弃上清。
9)重复步骤8)。
10)倒尽上清，自然干燥。DEPC水完全溶解RNA，取1μlRNA加入99μl蒸馏水，蛋白核酸分析仪测OD260及OD280。
3、高通量转录组测序
1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3)差异表达基因的检测
将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，KCNIP4基因在直肠腺癌组织中的表达量显著高于癌旁正常组织。
实施例2QPCR测序验证KCNIP4基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择KCNIP4基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择直肠腺癌组织和直肠腺癌癌旁正常组织各60例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：
1)反应体系：
试剂 体积
MgCl2 2μl
10×RT Buffer 1μl
无Rnase水 3.75μl
dNTP混合液 1μl
Rnase抑制剂 0.25μl
AMV反转录酶 0.5μl
寡聚dT适配子引物 0.5μl
实验样品 1μl
2)逆转录反应条件
按照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。
42℃～55℃60min，99℃2min，5℃5min。
3)聚合酶链反应
1)引物设计
根据Genebank中KCNIP4基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
KCNIP4基因：
正向引物为5’-TGTAGAAAGCGGTGTAAA-3’(SEQIDNO.3)；
反向引物为5’-CCATCTCCAGTTCATCTT-3’(SEQIDNO.4)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQIDNO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.6)。
2)按照表1配制PCR反应体系：
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 0.5μl
反向引物 0.5μl
Takara Ex Taq HS 12.5μl
模板 10μl
去离子水 补足25μl
3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃30s，60℃40s)×40个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与直肠腺癌癌旁正常组织相比，KCNIP4基因在直肠腺癌组织中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3抑制KCNIP4基因表达
1、细胞培养：人直肠腺癌细胞株HRC-99，以含10％小牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用含EDTA的0.25％胰蛋白酶常规消化传代。
2、siRNA设计
针对KCNIP4的siRNA序列：
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQIDNO.7)，
反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQIDNO.8)；
siRNA1-KCNIP4：
正义链为5’-AGUAUUUCACGUUUACACCGC-3’(SEQIDNO.9)，
反义链为5’-GGUGUAAACGUGAAAUACUGA-3’(SEQIDNO.10)；
siRNA2-KCNIP4：
正义链为5’-UUCAGUAUUUCACGUUUACAC-3’(SEQIDNO.11)，
反义链为5’-GUAAACGUGAAAUACUGAAAU-3’(SEQIDNO.12)；
siRNA3-KCNIP4：
正义链为5’-AAAUCUCUUUGAAGGUUUCUU-3’(SEQIDNO.13)，
反义链为5’-GAAACCUUCAAAGAGAUUUAC-3’(SEQIDNO.14)。
将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的RPMI1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-KCNIP4、siRNA2-KCNIP4、siRNA3-KCNIP4)，其中阴性对照组siRNA与KCNIP4基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。
3、QPCR检测KCNIP4基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用TRIzolReagent(InvitrogenCat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取HRC-99细胞的总RNA。
1)取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次。
2)加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀。
3)以1ml/管分装至1.5mlEP管中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。
4)4℃、12000rpm离心15min。
5)将上层水相移至干净EP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min。
6)4℃、7500rpm离心10min。
7)弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm离心5min。
8)室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。
9)质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰KCNIP4基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示，相比siRNA2-KCNIP4、siRNA3-KCNIP4，siRNA1-KCNIP4能够更有效抑制KCNIP4基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4划痕实验检测转染siRNA后直肠腺癌细胞增殖、迁移能力
1、将HRC-99细胞平铺于六孔板中，每孔密度为5×105个，加入含10％胎牛血清的DMEM培养，37℃，5％CO2条件下培养24h。
2、转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-KCNIP4)以及空白对照组。
3、用10μl移液枪头在单层细胞上画“一”字痕，用PBS溶液缓慢冲洗3次。分别选取培养24、48、72h的细胞置于倒置显微镜下观察拍照。计算划痕愈合率＝(0h划痕宽度-24h(或48h或72h)划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。
4、结果
结果如表2所示，随着培养时间的增长，siRNA1-KCNIP4组的划痕愈合率明显低于siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，抑制KCNIP4的表达可以抑制直肠腺癌细胞的迁移增殖，KCNIP4促进直肠腺癌细胞的迁移和增殖。
表2siRNA1-KCNIP4对HRC-99迁移增殖的影响
实施例5KCNIP4基因对直肠腺癌细胞增殖的影响
采用MTT实验检测KCNIP4基因对直肠腺癌细胞增殖能力影响。
1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
2、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续检测72h，共7次。本实验重复3次。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
图3所示的结果显示：siRNA1-KCNIP4组的细胞生长速度明显低于转染siRNA-NC组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明KCNIP4表达有利于直肠腺癌细胞的生长，通过抑制KCNIP4基因的表达可以抑制直肠腺癌细胞的生长。
实施例6KCNIP4基因对直肠腺癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测KCNIP4基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养步骤同实施例3。
2、细胞转染步骤同实施例3。
3、步骤
1)细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞。
2)用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/ml。
3)取200μl细胞悬液加入到EP管中，加入10μlAnnexin-V-FITC混匀。
4)室温暗处孵育染色15min。
5)上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。
6)未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果：
转染siRNA1-KCNIP4组的细胞凋亡率为(30.12±0.029)％，转染siRNA-NC组的细胞凋亡率为(5.78±0.17)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，KCNIP4基因的表达有利于直肠腺癌细胞存活，通过抑制KCNIP4基因的表达可以促进直肠腺癌细胞的凋亡。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.KCNIP4基因及其表达产物在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品能够通过检测KCNIP4基因的表达水平来诊断直肠腺癌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测直肠腺癌组织中KCNIP4基因的表达水平包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片进行检测。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。
5.一种诊断直肠腺癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测直肠粘膜组织中KCNIP4基因的表达水平来诊断直肠腺癌。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KCNIP4基因转录水平的针对KCNIP4基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KCNIP4蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KCNIP4基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KCNIP4蛋白的特异性抗体。
7.KCNIP4基因及其表达产物在制备治疗直肠腺癌的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物包含KCNIP4基因和/或其表达产物的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对KCNIP4的siRNA。
10.一种用于治疗直肠腺癌的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求8或9所述的抑制剂。
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