CN105483216A - 一种家兔cetp基因检测肉质育种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种家兔CETP基因多态性肉质育种的方法，包括以下步骤：1)提取家兔样品的基因组DNA；2)PCR反应扩增家兔CETP基因；3)家兔CETP基因测序；4)分析家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性；5)确定外显子4第11位点处产生3种基因型为AA、GG和AG的变异；6)分析三种基因型与家兔屠体性状的关联性；7)根据需要选择不同基因型的家兔进行培养育种。本发明所述的方法可以实现家兔的快速肉质育种，解决了我国肉兔生产育种品种较少，育种时间长，成效慢的问题。

Description

一种家兔CETP基因检测肉质育种的方法

技术领域

本发明涉及家兔育种技术领域，尤其是一种利用基因检测进行家兔肉质早期育种的方法。

背景技术

据联合国粮农组织调查，兔肉在欧洲许多国家，如意大利、捷克、西班牙、比利时、卢森堡、葡萄牙、法国，还有一些北非国家，如埃及、阿尔及利亚，受到消费者的青睐，兔肉生产在国民经济中发挥着的重要作用。兔肉能提供丰富的营养物质，首先蛋白含量很高，尤其是限制性氨基酸水平较高。在家兔背最长肌和后腿的蛋白含量高达22％。同时矿物质、维生素、抗氧化因子含量高，而兔肉胆固醇和脂肪含量低，被认为是消费者首选的功能食品。

我国现有家兔育种方法主要有两种，一是对育种家兔进行人工选择，即选择性状好的公、母家兔作种用，淘汰性状较差的家兔；二是进行杂交育种，选择不同品种的家兔进行杂交，在后代中选择具有双亲优良性状的子代。但是在家兔肉质育种方面的研究较少。家兔作为小畜种动物，家兔的育种，尤其是肉质育种在我国研究滞后，肉兔生产育种品种较少，育种时间长，成效慢。

发明内容

本发明的目的是提供一种家兔CETP基因多态性检测肉质育种的方法，所述方法可以根据育种需求快速简便的进行家兔育种。

本发明提供了一种家兔CETP基因多态性检测的试剂在制备用于检测家兔肉质的制剂或试剂盒中的应用，其中CETP基因外显子4第11位点为GG基因型家兔的半净膛屠宰率最高；AG基因型的兔背最长肌肌内脂肪含量最高；AA基因型的家兔后腿肌内脂肪含量最高其中所述多态性的试剂包括上游引物和下游引物：

所述上游引物为CETP-F，CCACTTGTTCCCTCAGCCTC，所述的下游引物为CETP-R，CGAGTGAGTACACAGCCGCTG。

优选的，其中所述CETP基因多态性检测的试剂为聚合酶链式反应所用的试剂，所述的聚合酶链式反应所用的试剂还包括家兔基因组DNA，dNTP，MgCl₂，taqDNA聚合酶和Buffer。

优选的，所述CETP基因多态性检测的试剂有如下反应体系构成：45～55ng全基因组DNA，上游引物CETP-F和下游CETP-R各0.8～1.2uM，1～2mMMgCl₂，180～220μMdNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，0.3～0.5个单位的TaqDNA聚合酶(MBI)，2.4～2.6μL的100×buffer。

优选的，家兔待测个体为伊拉兔、香槟兔或天府黑兔中的一种或几种。

优选的，所述的家兔待测个体样品来自70日龄家兔。

本发明提供了一种家兔CETP基因多态性肉质育种的方法，包括以下步骤：

1)提取家兔样品的基因组DNA，并将所述的基因组DNA保存于-15℃-20℃；

2)以步骤1)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增家兔CETP基因，所述的PCR包括上游引物：CETP-F，CCACTTGTTCCCTCAGCCTC和下游引物CETP-R，CGAGTGAGTACACAGCCGCTG；

3)将步骤2)扩增得到的家兔CETP基因测序，得到家兔CETP基因序列；

4)分析步骤3)中所得到的家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性；

5)根据家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性的分析结果确定外显子4第11位点处发生单核苷酸变异，产生3种基因型为AA、GG和AG；

6)分析步骤5)中所述的三种基因型与家兔屠体性状的关联性；

7)根据步骤6)得到的基因与家兔屠体性状的关联，根据需要选择不同基因型的家兔进行培养育种。

优选的，所述家兔为伊拉兔、香槟兔和天府黑兔中的一种或几种；所述的家兔样品来自68～72日龄家兔。

优选的，步骤1)中所述的家兔样品来自68～72日龄家兔耳组织样品。

优选的，所述的家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性分析采用DNAstar软件进行序列对比判断突变位点及其基因型，并计算得到基因型和基因型频率，利用POPGENE软件测试哈温平衡的χ2值，多态信息含量(PIC)通过下列公式计算得到

式Ⅰ，P_i和P_j分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数，所述的i和j为大于等于1，小于等于n的自然数。

优选的，所述基因型与家兔屠体性状的关联分析，采用SPSS21中一般线性模型GLM进行。

具体实施方式

本发明提供了一种家兔CETP基因多态性检测的试剂在制备用于检测家兔肉质的制剂或试剂盒中的应用，其中所述CETP基因多态性检测的试剂为聚合酶链式反应所用的试剂。所述试剂具体的包括引物，家兔基因组DNA，MgCl₂、dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)、TaqDNA聚合酶和buffer。

所诉的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为CETP-F，CCACTTGTTCCCTCAGCCTC，所述的下游引物为CETP-R，CGAGTGAGTACACAGCCGCTG。

所述的PCR扩增具体的包括全基因组DNA，优选为45～55ng，更优选的为50ng；上游引物CETP-F和下游引物CETP-R优选的为0.8～1.2uM，更优选的为1.0uM；MgCl₂优选的为为1～2mM，更优选的为1.5mM；dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)优选的为180～220μM，更优选的为200μM；TaqDNA聚合酶(MBI)优选的为0.3～0.5个单位，更优选的为0.4个单位；100×buffer优选的为2.4～2.6μL，更优选的为2.5μL，所述试剂总体积为优选的为20～30μL，更优选的为25μL。

所述的PCR扩增的具体程序为：95℃预变性5min；40个循环，94℃变性45S，56℃退火45S；72℃延伸40S；最后72℃延长10min。

所述的基因多态性检测的家兔待测个体优选的为伊拉兔、香槟兔或天府黑兔中的一种或几种。所述的家兔待测个体样品优选的来自68～72日龄家兔，更优选的为70日龄家兔。

本发明提供了一种家兔CETP基因多态性肉质育种的方法，包括以下步骤：

1)提取家兔样品的基因组DNA，并将所述的基因组DNA保存于-15℃-20℃；

2)以步骤1)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增家兔CETP基因，所述的PCR包括上下游引物：所述的上游引物为CETP-F，CCACTTGTTCCCTCAGCCTC，所述的下游引物为CETP-R，CGAGTGAGTACACAGCCGCTG；

3)将步骤2)扩增得到的家兔CETP基因测序，得到家兔CETP基因序列；

4)分析步骤3)中所得到的家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性；

5)根据家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性的分析结果确定外显子4第11位点处发生单核苷酸变异，产生3种基因型为AA、GG和AG；

6)分析步骤5)中所述的三种基因型与家兔屠体性状的关联性；

7)根据步骤6)得到的基因与家兔屠体性状的关联，根据需要选择不同基因型的家兔进行培养育种。

本发明具体的以家兔组织为样品，优选的以68～72日龄的家兔的耳组织为样品，更优选的为70日龄的家兔的耳组织为样品，进行家兔基因组DNA的提取。所述的家兔耳组织样品基因组DNA的提取按试剂盒(Axygen,USA)提供的方法进行，并将提取得到的家兔基因组DNA保存于-15℃～-20℃冰箱，优选的保存于-20℃冰箱。

提取得到家兔基因组DNA后，本发明将所述的家兔CETP基因进行PCR扩增，所述的PCR扩增所用的试剂包括家兔基因组DNA，dNTP，MgCl₂，taqDNA聚合酶、Buffer和引物。

所述的扩增体系具体的是以步骤1)中提取得到的家兔基因组DNA为模板，以上游引物CETP-F，CCACTTGTTCCCTCAGCCTC和下游引物CETP-R，CGAGTGAGTACACAGCCGCTG分别为引物，加入MgCl₂、dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)、TaqDNA聚合酶(MBI)和buffer进行反应。

所述的PCR扩增具体的包括全基因组DNA，优选为45～55ng，更优选的为50ng；上游引物CETP-F和下游CETP-R优选的为0.8～1.2uM，更优选的为1.0uM；MgCl₂优选的为为1～2mM，更优选的为1.5mM；dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)优选的为180～220μM，更优选的为200μM；TaqDNA聚合酶(MBI)优选的为0.3～0.5个单位，更优选的为0.4个单位；100×buffer优选的为2.4～2.6μL，更优选的为2.5μL，所述试剂总体积为优选的为20～30μL，更优选的为25μL。

所述的PCR扩增的具体程序为：95℃预变性5min；40个循环，94℃变性45S，56℃退火45S；72℃延伸40S；最后72℃延长10min。

本发明经过PCR扩增后得到CETP基因的PCR扩增产物，取一部分用2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如果条带清晰、单一，符合DNA测序要求，则将PCR产物送上海英骏生物技术有限公司纯化测序，如果不符合DNA测序要求，则重新提取。

本发明在得到CETP基因测序结果后，对CETP基因的序列进行单核苷酸多态性分析，所述的家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性分析采用DNAstar软件进行序列对比判断突变位点及其基因型，并计算得到基因型和基因型频率，利用POPGENE软件测试哈温平衡的χ²值，多态信息含量(PIC)通过式Ⅰ公式计算得到，

式Ⅰ，P_i和P_j分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数，所述的i和j为大于等于1，小于等于n的自然数。根据PIC的数值大小来确定基因的多态性，PIC＞0.5为高度多态；0.25＜PIC＜0.5为中度多态；PIC＜0.25为低度多态。

本发明在家兔CETP基因多态性分析后，得到结果，在CETP基因的第4外显子的第11bp处发生了单核苷酸变异，产生3种基因型为AA、GG和AG。3个家兔群体的基因多态性分析结果具体见实施例1中的表1。由表1可以看出，GG为优势基因型，G为优势基因。最小等位基因频率变化范围为：0.3636～0.4213，表示该突变位点较多态。多态信息含量PIC结果显示，本研究的3个家兔群体均处于中度多态，能表现出明显的群体特征。而且χ²检测结果显示家兔群体偏离哈温平衡，表示3个家兔群体均未达到遗传平衡的状态。

本发明在得到家兔CETP基因的第4外显子的第11bp处产生3种基因型AA、GG和AG的结果后，开始分析三种基因型与家兔屠体性状的关联性，具体的采用SPSS21(IBM,Armonk,NY,USA)中一般线性模型(GLM)进行分析，所述分析采用的线性模型为：Y_ijk＝μ+G_i+S_j+e_ijk，其中，Y_ijk为个体性状观测值，μ为个体性状均值，G_i为基因型效应，S_j为个体性别效应，e_ijk为随机误差效应。数据计算方式均采用最小二乘法和标准误，三种基因型与家兔屠体性状的关联性分析结束后，用BonferroniT进行检验。

本发明所述的家兔屠体性状主要包括三方面，家兔屠宰率(全净膛屠宰率和半净膛屠宰率)、家兔背最长肌肉质性状和家兔后腿肌肉质性状，所述的屠宰率采用本领域常规的方法计算，所述的肌肉质性状测定的方法包括pH、肉色和肌内脂肪，pH值测定采用pH仪(ModelPH-STARCPU,Germany)完成，测定探针深入肌肉3cm；肉色测定采用VanLaacketal.(2000)报道的比色体系，数据由亮度(L*)，红度(a*)和黄度(b*)组成。肌内脂肪采用矫正的Soxhlet方法(AOAC,1980)。

本发明中3个家兔群体不同基因型与屠宰率(全净膛屠宰率和半净膛屠宰率)的相关分析结果，具体的见实施例2中的表2。可以看出，不同基因型家兔全净膛屠宰率差异不显著(P>0.05)，但GG和AG基因型的全净膛屠宰率数值高于AA基因型。GG基因型家兔的半净膛屠宰率最高，与AA和AG基因型差异显著(P<0.05)。

本发明中不同基因型与家兔背最长肌肉质性状的相关分析结果，具体的见实施例4中表3。可以看出，AA基因型的新鲜兔肉的红度最高，与GG和AG基因型的红度差异显著(P<0.05)。而且，AA基因型的24小时肉的红度也最高，与AG基因型差异不明显(P>0.05)，但与GG基因型差异显著(P<0.05)。AG基因型的兔背最长肌肌内脂肪含量最高，而且与AA基因型差异显著(P<0.05)。

不同基因型与家兔后腿肌肉质性状的相关分析结果，具体的见实施例5中表4。可以看出，AG基因型新鲜兔肉亮度最大，与AA、GG基因型亮度差异显著(P<0.05)。AA基因型24小时兔肉红度最大，与GG和AG基因型差异显著(P<0.05)。AA基因型的家兔后腿肌内脂肪含量最高，与AG基因型差异显著(P<0.05)，但与GG基因型差异不显著(P>0.05)。

本发明分析了CETP基因与家兔屠体性状的关联之后，依照基因与屠体性状的对应关系，根据需要选择不同基因型的家兔进行培养育种，如需培育屠宰率高的家兔选择CETP基因外显子4第11位点为GG的家兔进行培育，如需培育兔背最长肌肌内脂肪含量高的家兔选择CETP基因外显子4第11位点为GA的家兔进行培育，如需培育兔后腿肌内脂肪含量高的家兔选择CETP基因外显子4第11位点为AA的家兔进行培育。

下面结合实施例对本发明提供的发明内容进行详细的说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1PCR测序及基因多态性分析

根据Ensembl报道的家兔CETP基因序列NO.ENSOCUG00000013137采用Premier5软件设计一对引物：CETP-F：CCACTTGTTCCCTCAGCCTC和CETP-R：CGAGTGAGTACACAGCCGCTG。PCR反应采用25μL反应体系：50ng全基因组DNA，引物CETP-F和CETP-R各1uM，1.5mMMgCl₂，200μMdNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，0.4个单位的TaqDNA聚合酶(MBI)，2.5μL的100×buffer。PCR扩增程序：95℃预变性5min；40个循环，94℃45S，56℃45S；72℃40S；最后72℃延长10min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。扩增效果良好的PCR产物送上海英骏生物技术有限公司纯化测序。在CETP基因的第4外显子的第11bp处发生了单核苷酸变异，产生3种基因型为AA、GG和AG。

采用DNAstar软件进行序列对比判断突变位点及其基因型，并进一步计算得到基因型和基因型频率。利用POPGENE软件测试哈温平衡的χ2值。多态信息含量(PIC)通过式Ⅰ公式计算得到。PIC＞0.5为高度多态；0.25＜PIC＜0.5为中度多态；PIC＜0.25为低度多态。

式Ⅰ，P_i和P_j分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数，所述的i和j为大于等于1，小于等于n的自然数。

3个家兔群体的基因多态性分析结果，见表1。由表1可以看出，GG为优势基因型，G为优势基因。最小等位基因频率变化范围为：0.3636～0.4213，表示该突变位点较多态。多态信息含量PIC结果显示，本研究的3个家兔群体均处于中度多态，能表现出明显的群体特征。而且χ2检测结果显示家兔群体偏离哈温平衡，表示3个家兔群体均未达到遗传平衡的状态。

表1家兔CETP基因多态性分析

实施例2家兔肉质性状的测定

家兔屠宰率按常规方法计算，pH值测定采用pH仪(ModelPH-STARCPU,Germany)完成，测定探针深入肌肉3cm；肉色测定采用VanLaacketal.(2000)报道的比色体系，数据由亮度(L*)，红度(a*)和黄度(b*)组成。pH和肉色测定两次，分别为刚屠宰的肉和屠宰后24小时的肉。肌内脂肪采用矫正的Soxhlet方法(AOAC,1980)，只测定刚屠宰的肌肉。

实施例3基因型与家兔屠体性状关联分析

本实验数据采用SPSS21(IBM,Armonk,NY,USA)中一般线性模型(GLM)进行关联分析，分析的线性模型为：Y_ijk＝μ+G_i+S_j+e_ijk，Y_ijk为个体性状观测值，μ为个体性状均值，G_i为基因型效应，S_j为个体性别效应，e_ijk为随机误差效应。数据计算方式均采用最小二乘法和标准误，并用BonferroniT检验。3个家兔群体不同基因型与屠宰率的相关分析结果，见表2。可以看出，不同基因型家兔全净膛屠宰率差异不显著(P>0.05)，但GG和AG基因型的全净膛屠宰率数值高于AA基因型。GG基因型家兔的半净膛屠宰率最高，与AA和AG基因型差异显著(P<0.05)。

表2家兔CETP基因多态性与屠宰性状的相关分析

实施例4家兔基因多态性与家兔背最长肌肉质性状相关分析

本实施例中所用的试验和分析方法与实施例3中的相同，分析的对象为不同基因型与家兔背最长肌肉质性状。不同基因型与家兔背最长肌肉质性状的相关分析结果，见表3。可以看出，AA基因型的新鲜兔肉的红度最高，与GG和AG基因型的红度差异显著(P<0.05)。而且，AA基因型的24小时肉的红度也最高，与AG基因型差异不明显(P>0.05)，但与GG基因型差异显著(P<0.05)。AG基因型的兔背最长肌肌内脂肪含量最高，而且与AA基因型差异显著(P<0.05)。

表3家兔CETP基因多态性与背最长肌肉质性状的相关分析

实施例5家兔基因多态性与家兔后腿肌肉质肉质性状相关分析

本实施例中所用的试验和分析方法与实施例3、4中的相同，分析的对象为不同基因型与家兔后腿肌肉肉质性状。不同基因型与家兔后腿肌肉质性状的相关分析结果，见表4。可以看出，AG基因型新鲜兔肉亮度最大，与AA、GG基因型亮度差异显著(P<0.05)。AA基因型24小时兔肉红度最大，与GG和AG基因型差异显著(P<0.05)。AA基因型的家兔后腿肌内脂肪含量最高，与AG基因型差异显著(P<0.05)，但与GG基因型差异不显著(P>0.05)。

表4家兔CETP基因多态性与后腿肌肉质性状的相关分析

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.家兔CETP基因多态性检测的试剂在制备用于检测家兔肉质的制剂或试剂盒中的应用，家兔CETP基因多态性检测所用的试剂包括上游引物和下游引物：

所述上游引物为CETP-F：CCACTTGTTCCCTCAGCCTC；

所述下游引物为CETP-R：CGAGTGAGTACACAGCCGCTG。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CETP基因多态性检测的试剂为聚合酶链式反应所用的试剂，所述的聚合酶链式反应所用的试剂还包括家兔基因组DNA，dNTP，MgCl₂，taqDNA聚合酶和Buffer。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CETP基因多态性检测的试剂由如下反应体系构成：45～55ng全基因组DNA，引物CETP-F和CETP-R各0.8～1.2uM，1～2mMMgCl₂，180～220μMdNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，0.3～0.5个单位的TaqDNA聚合酶，2.4～2.6μL的100×buffer，所述试剂总体积为20～30μL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述家兔为伊拉兔、香槟兔或天府黑兔中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的家兔待测个体样品来自68～72日龄家兔。

6.一种家兔CETP基因多态性肉质育种的方法，包括以下步骤：

1)提取家兔样品的基因组DNA，并将所述的基因组DNA保存于-15℃～-20℃；

2)以步骤1)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增家兔CETP基因，所述的PCR包括上游引物：CETP-F，CCACTTGTTCCCTCAGCCTC和下游引物CETP-R，CGAGTGAGTACACAGCCGCTG；

3)将步骤2)扩增得到的家兔CETP基因测序，得到家兔CETP基因序列；

4)分析步骤3)中所得到的家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性；

5)根据家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性的分析结果确定外显子4第11位点处发生单核苷酸变异，产生3种基因型为AA、GG和AG；

6)分析步骤5)中所述的三种基因型与家兔屠体性状的关联性；

7)根据步骤6)得到的基因与家兔屠体性状的关联，根据需要选择不同基因型的家兔进行培养育种。

7.根据权利要求6所述的家兔CETP基因检测肉质育种的方法，其特征在于，所述家兔为伊拉兔、香槟兔和天府黑兔中的一种或几种；所述的家兔样品来自68～72日龄家兔。

8.根据权利要求6所述的家兔CETP基因检测肉质育种的方法，其特征在于，步骤1)中所述的家兔样品来自家兔耳组织样品。

9.根据权利要求6所述的家兔CETP基因检测肉质育种的方法，其特征在于，所述的家兔CETP基因序列的单核苷酸多态性分析具体为：采用DNAstar软件进行序列对比判断突变位点及其基因型，计算得到基因型和基因型频率，利用POPGENE软件测试哈温平衡的χ2值，多态信息含量PIC通过式Ⅰ所示公式计算得到

$PIC=1-\underset{i=1}{\overset{n}{\&Sigma;}}{P_i}^2-\underset{i=1}{\overset{n-1}{\&Sigma;}}\underset{j=i+1}{\overset{n}{\&Sigma;}}2{P_i}^2{P_j}^2$ 式Ⅰ，

式Ⅰ中，P_i和P_j分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数。

10.根据权利要求6所述的家兔CETP基因检测肉质育种的方法，其特征在于，所述基因型与家兔屠体性状的关联分析，采用SPSS21中一般线性模型GLM进行。