CN105475139B - 一种毛叶铁线蕨的组培繁殖方法 - Google Patents

一种毛叶铁线蕨的组培繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种毛叶铁线蕨的组培繁殖方法，首先收集毛叶铁线蕨孢子，进行消毒；然后将毛叶铁线蕨孢子用无菌水配成悬浮液，加入到孢子萌发培养基中，培养7～15d后开始萌发，发育成片状原叶体；之后将片状原叶体转接至增殖培养基中培养25~35d，再转入孢子体诱导培养基中培养30~40d，形成幼孢子体；最后将幼孢子体团分离成单株幼孢子体或具4～5株幼孢子体的小丛，与多菌灵消毒液混合，然后将混合液均匀倒入土壤基质中培养。本发明无需孢子体继代培养和生根培养两个阶段，缩短了培养周期，从孢子萌发到幼孢子体形成只需90d左右；短时间内获得大量毛叶铁线蕨种苗，且炼苗和移栽同步进行，幼孢子体苗成活率可达100%。

Description

一种毛叶铁线蕨的组培繁殖方法
技术领域
本发明涉及蕨类植物的繁殖方法，具体是一种毛叶铁线蕨的组培繁殖方法。
背景技术
铁线蕨属（Adiantum）植物有200多种，主要分布于热带和温带。此属植物中许多具有较高的观赏价值，其性耐阴，可作庭园绿化阴湿处点缀，也可作室内切叶或盆栽观赏，毛叶铁线蕨为其中一种，其高约20～40cm，叶簇生，叶柄深栗色，有光泽，密被棕色长柔毛，顶端分裂成2枝以上，小叶暗绿色，新叶黄绿色至浅红色，四季常绿，耐阴性极强，可在立体绿化背阴面及室内绿化应用，具有良好的市场开发价值。
目前关于铁线蕨属植物繁殖的研究多见于铁线蕨、扇叶铁线蕨以及荷叶铁线蕨，未见关于毛叶铁线蕨组培繁殖的研究。而组培繁殖是蕨类生产的主要途径，其具有不受季节限制，繁殖速度快、数量巨大的优势，许多铁线蕨属植物的孢子离体培养研究只能获得大量原叶体，难以获得幼孢子体。因此，建立毛叶铁线蕨的组培繁育技术体系将有助于规模化生产，以促进其在园林绿化中的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能简易快速繁殖毛叶铁线蕨的方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种毛叶铁线蕨的组培繁殖方法，所述方法包括以下步骤：
S1、收集毛叶铁线蕨孢子，进行消毒；
S2、毛叶铁线蕨孢子用无菌水配成悬浮液，加入到孢子萌发培养基中，培养25～35d，孢子萌发并发育成片状原叶体；
S3、将片状原叶体转接至增殖培养基中培养25~35d，再转入孢子体诱导培养基中培养30~40d，形成幼孢子体；
S4、将幼孢子体团分离成单株幼孢子体或具4～5株幼孢子体的小丛，与多菌灵消毒液混合，然后将混合液均匀倒入土壤基质中培养。
进一步地，所述步骤S1的消毒具体为：将毛叶铁线蕨孢子用滤纸包好，在无菌水里浸泡3～5min，再在升汞溶液中浸泡3～4min，最后用无菌水漂洗干净。
进一步地，所述孢子萌发培养基每升含6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS或Knop培养基，pH为5.8～6.0。
进一步地，所述步骤S2、S3的培养条件都是：温度25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。
进一步地，所述增殖培养基每升含0.2～1mg 6-BA、0.1～0.5mg NAA、6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS培养基，pH为5.8～6.0。
6-BA是6-苄基腺嘌呤，NAA是萘乙酸。
进一步地，所述孢子体诱导培养基每升含6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS培养基，pH为5.8～6.0。
进一步地，所述土壤基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比1：1：1混合得到。
进一步地，所述步骤S4的混合液为每200mL浓度为0.1wt%的多菌灵消毒溶液中含2块幼孢子体团的分离物。
可以按照以下步骤繁殖毛叶铁线蕨：
（1）孢子采集及消毒处理：收集毛叶铁线蕨孢子用滤纸包好，在无菌水里浸泡3～5min，再在1g/L升汞溶液中浸泡3～4min，最后用无菌水漂洗干净，最好漂洗4~5次，备用；
（2）孢子接种及诱导萌发：消毒过的毛叶铁线蕨孢子用无菌水配成悬浮液，加入到孢子萌发培养基中，培养25～35d后，孢子萌发，并从绿色丝状体再发育成大约0.3~0.4cm的片状原叶体；培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d；孢子萌发培养基每升含6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS或Knop培养基，pH为5.8～6.0；
（3）原叶体增殖培养：将片状原叶体转接至增殖培养基中培养25~35d，所得增殖原叶体团直径为1cm左右；培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d；所述增殖培养基每升含0.2～1mg 6-BA、0.1～0.5mg NAA、6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS培养基，pH为5.8～6.0；
（4）幼孢子体诱导：将增殖原叶体转入孢子体诱导培养基中培养30~40d，形成幼孢子体，且生长1～3片幼孢子叶；培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d；所述孢子体诱导培养基每升含6～7g琼脂，20～25g蔗糖，其余为MS培养基，pH为5.8～6.0；
（5）组培苗移栽管理：将幼孢子体团从瓶内取出，分离成单株幼孢子体或具4～5株幼孢子体的小丛，与多菌灵消毒液混合，混合液为每200mL浓度为0.1wt%的多菌灵消毒溶液中含2块1～1.5cm幼孢子体团的分离物，然后将混合液均匀倒入土壤基质中培养，并覆盖薄膜保湿，栽植后15d内保持覆膜，以后可打开薄膜透气，30d后可完全揭开薄膜，但每天喷雾保湿；土壤基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比1：1：1混合得到，并用0.1wt%多菌灵消毒液浇透。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过将消毒过的毛叶铁线蕨孢子在孢子萌发培养基中进行培养得到片状原叶体，然后将片状原叶体在增殖培养基中进行激素刺激诱导，再转回不含激素的孢子体诱导培养基中培养，即可获得大量幼孢子体苗，随后出瓶移植。全过程只需要转接两次，无需孢子体继代培养和生根培养两个阶段，缩短了培养周期，从孢子萌发到幼孢子体形成只需90d左右；本发明投入少，培养基成分简单，短时间内获得大量毛叶铁线蕨种苗，且炼苗和移栽同步进行，幼孢子体苗成活率可达100%，可使毛叶铁线蕨成为优良观叶植物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：
以下实施例所用MS培养基，1L培养基里包含NH4NO3 1650mg，KNO3 1900 mg，KH2PO4170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，MnSO4·4H2O 22.3 mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，H3BO3 6.2 mg，KI 0.83 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，甘氨酸2 mg，VB1 0.4 mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5 mg，肌醇100 mg。
所用Knop培养基，1L培养基里包含KNO3 125 mg，KH2PO4 125 mg，MgSO4·7H2O 125mg，Ca（NO3）2·4H2O 500 mg。
实施例1
按照以下步骤繁殖毛叶铁线蕨：
（1）孢子采集及消毒处理：当毛叶铁线蕨的孢子囊开始呈现褐色，将其孢子叶剪下，于室内阴晾，待孢子散落收集待用。收集毛叶铁线蕨孢子用滤纸包好，在超净工作台上用无菌水里浸泡3min，再在1g/L升汞溶液中浸泡3min，最后用无菌水漂洗4次，备用。
（2）孢子接种及诱导萌发：将MS培养基、6g琼脂和20g蔗糖配制成pH5.8～6.0的孢子萌发培养基1L，分装至200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20mL，室温冷却后待用。将消毒过的毛叶铁线蕨孢子用无菌水配成悬浮液，用无菌的移液枪吸取1mL加入到准备好的培养瓶中，轻微晃动培养瓶，使孢子均匀分布在萌发培养基上。培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。培养7d后孢子开始萌发，培养基显绿，孢子形成绿色丝状体，培养30d后从绿色丝状体发育成致密的、大约0.3~0.4cm的片状原叶体。
（3）原叶体增殖培养：将MS培养基、6g琼脂、20g蔗糖、0.2mg 6-BA、0.1mg NAA配制成pH5.8～6.0的增殖培养基1L，分装至200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20mL，室温冷却后待用。将片状原叶体转接至增殖培养基，培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。培养30d后，所得增殖原叶体团直径为1cm左右。原叶体增殖倍数如表1所示。
（4）幼孢子体诱导：将MS培养基、6g琼脂、20g蔗糖配制成pH5.8～6.0的孢子体诱导培养基1L，分装至200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20mL，室温冷却后待用。将增殖原叶体转入孢子体诱导培养基，培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。培养11d后开始长出幼孢子体，30d后形成大量的幼孢子体，且生长1～3片幼孢子叶。幼孢子体诱导情况如表1所示。
（5）组培苗移栽管理：将幼孢子体团从组培瓶内取出，分离成单株幼孢子体或具4～5株幼孢子体的小丛，按每2块幼孢子体团分离物与200mL0.1wt%多菌灵消毒液混合，然后边摇匀边均匀倒入配制好的土壤基质中培养，并覆盖薄膜保湿，栽植后15d内保持覆膜，以后可打开薄膜透气，30d后可完全揭开薄膜，但每天喷雾保湿。土壤基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比1：1：1混合得到，并用0.1wt%多菌灵消毒液浇透。
本实施例从孢子萌发到幼孢子体形成需90d，幼孢子苗成活率100%。
实施例2
按照以下步骤繁殖毛叶铁线蕨：
（1）孢子采集及消毒处理：当毛叶铁线蕨的孢子囊开始呈现褐色，将其孢子叶剪下，于室内阴晾，待孢子散落收集待用。收集毛叶铁线蕨孢子用滤纸包好，在超净工作台上用无菌水里浸泡5min，再在1g/L升汞溶液中浸泡4min，最后用无菌水漂洗5次，备用。
（2）孢子接种及诱导萌发：将Knop培养基、7g琼脂和25g蔗糖配制成pH5.8～6.0的孢子萌发培养基1L，分装至200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20mL，室温冷却后待用。将消毒过的毛叶铁线蕨孢子用无菌水配成悬浮液，用无菌的移液枪吸取1mL加入到准备好的培养瓶中，轻微晃动培养瓶，使孢子均匀分布在萌发培养基上。培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。培养15d后孢子开始萌发，培养基显绿，孢子形成绿色丝状体，培养35d后从绿色丝状体发育成致密的、大约0.3~0.4cm的片状原叶体。
（3）原叶体增殖培养：将MS培养基、7g琼脂、25g蔗糖、0.2mg 6-BA、0.5mg NAA配制成pH5.8～6.0的增殖培养基1L，分装至200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20mL，室温冷却后待用。将片状原叶体转接至增殖培养基，培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。培养25d后，所得增殖原叶体团直径为1cm左右。原叶体增殖倍数如表1所示。
（4）幼孢子体诱导：将MS培养基、7g琼脂、25g蔗糖配制成pH5.8～6.0的孢子体诱导培养基1L，分装至200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20mL，室温冷却后待用。将增殖原叶体转入孢子体诱导培养基，培养条件是：温度为25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。培养11d后开始长出幼孢子体，40d后形成大量的幼孢子体，且生长1～3片幼孢子叶。幼孢子体诱导情况如表1所示。
（5）组培苗移栽管理：将幼孢子体团从组培瓶内取出，分离成单株幼孢子体或具4～5株幼孢子体的小丛，按每2块幼孢子体团分离物与200mL0.1wt%多菌灵消毒液混合，然后边摇匀边均匀倒入配制好的土壤基质中培养，并覆盖薄膜保湿，栽植后15d内保持覆膜，以后可打开薄膜透气，30d后可完全揭开薄膜，但每天喷雾保湿。土壤基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比1：1：1混合得到，并用0.1wt%多菌灵消毒液浇透。
本实施例从孢子萌发到幼孢子体形成需100d，幼孢子苗成活率98%。
实施例3
按照实施例1的步骤繁殖毛叶铁线蕨，增殖培养基每升含1mg 6-BA、0.5mg NAA。
实施例4
按照实施例1的步骤繁殖毛叶铁线蕨，增殖培养基每升含1mg 6-BA、0.1mg NAA。
实施例5
按照实施例1的步骤繁殖毛叶铁线蕨，增殖培养基每升含0.5mg 6-BA、0.3mg NAA。
由上表可知，采用本发明的繁殖方法，毛叶铁线蕨的原叶体增殖倍数可达2.5~3倍；每团原叶体团诱导的幼孢子体可达80~90株；繁殖周期大约90d左右；幼孢子苗成活率接近100%。总体上缩短了繁殖周期，提高幼孢子苗成活率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种毛叶铁线蕨的组培繁殖方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、收集毛叶铁线蕨孢子，进行消毒；
S2、毛叶铁线蕨孢子用无菌水配成悬浮液，加入到孢子萌发培养基中，培养25～35d，孢子萌发并发育成片状原叶体；所述孢子萌发培养基每升含6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS或Knop培养基，pH为5.8～6.0；
S3、将片状原叶体转接至增殖培养基中培养25～35d，再转入孢子体诱导培养基中培养30～40d，形成幼孢子体；所述增殖培养基每升含0.2～1mg 6-BA、0.1～0.5mg NAA、6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS培养基，pH为5.8～6.0；所述孢子体诱导培养基每升含6～7g琼脂、20～25g蔗糖，其余为MS培养基，pH为5.8～6.0；
S4、将幼孢子体团分离成单株幼孢子体或具4～5株幼孢子体的小丛，与多菌灵消毒液混合，然后将混合液均匀倒入土壤基质中培养。
2.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤S1的消毒具体为：将毛叶铁线蕨孢子用滤纸包好，在无菌水里浸泡3～5min，再在升汞溶液中浸泡3～4min，最后用无菌水漂洗干净。
3.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤S2、S3的培养条件都是：温度25～30℃，光照强度2000～2500lx，光照时间12h/d。
4.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于，所述土壤基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比1：1：1混合得到。
5.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤S4的混合液为每200mL浓度为0.1wt％的多菌灵消毒溶液中含2块幼孢子体团的分离物。
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