CN101790962B - 一种铁线蕨的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种铁线蕨的生产方法。其包括如下步骤：A取铁线蕨孢子叶作为外植体；B配孢子萌发和原叶体增殖继代用的M1培养基；C孢子萌发，将外植体表面消毒后转到M1培养基上，放置于培养室中培养；D原叶体增殖与继代，将孢子萌发后产生的原叶体团分成小块，转到新的M1培养基上增殖继代；E孢子体诱导，取原叶体团块与搅切溶液混合后用豆浆机打碎，打碎后的混合液喷播于装有基质的筛盘上，放置于温室大棚中栽培即得铁线蕨孢子体植株。本发明利用不完全组培生产铁线蕨，可降低继代的代数，降低了生产成本，降低了突变率，提高生产效率以及节约人力。

Description

一种铁线蕨的生产方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种铁线蕨的生产方法。
背景技术：
铁线蕨又称铁丝草、铁线草、水猪毛土，为铁线蕨科铁线蕨属多年生草本观叶植物。其茎叶秀丽多姿，形态优美，株型小巧，可供切叶插花配材、盆景观赏，也可当地被植物，深受欧美、日本人喜爱，近年来，在国内市场也发展迅速。
目前蕨类生产中，大多是以组培的方式，先诱导出GGB或原叶体，再利用GGB或原叶体诱导孢子体植株，但是铁线蕨用完全组培的方式只能获得大量的原叶体，难以获得孢子体植株；用孢子播种繁殖虽然能获得大量植株，但是孢子在撒播时易与菌类、藻类或苔藓类竞争养分而降低萌发率及生长速率，而且孢子经过储藏后，孢子萌发率和孢子体的诱导率大大降低，影响了铁线蕨的周年供应，另外直接用孢子播种对环境的要求较严格，温室大棚光照和湿度不稳定，会因不耐强光或干旱等逆境而死亡；孢子播种密度难以控制，播种出来的原叶体体要产生孢子体植物还需要进行原叶体移栽，这必然增加了人力。
发明内容：
本发明的目的克服现有铁线蕨生产中的上述不足之处，提供一种简便、高效的生产铁线蕨植株的方法，以满足铁线蕨规模化生产之需要。
本发明实现其目的所采用的技术方案是：所述生产铁线蕨的方法包括如下步骤：
A.取铁线蕨孢子叶作为外植体；
B.配孢子萌发和原叶体增殖继代用的M1培养基；
C.孢子萌发，将外植体表面消毒后转到M1培养基上，放置于培养室中培养；
D.原叶体增殖与继代，将孢子萌发后产生的原叶体团分成小块，转到新的M1培养基上增殖继代；
E.孢子体诱导，取原叶体团块与搅切溶液混合后用豆浆机打碎，打碎后的混合液喷播于装有基质的筛盘上，放置于温室大棚中栽培即得铁线蕨孢子体植株。
具体而言：
所述铁线蕨孢子叶须含有褐色的成熟孢子囊。
所述M1培养基为：1/2MS+2％白糖+0.6％琼脂，pH5.8-6.0，1/2MS即NH4NO3，KNO3，MgSO4·7H2O，KH2PO4用量为MS培养基正常用量的1/2，其它成分不变。
所述孢子萌发中外植体表面消毒方法为：先用流水冲洗孢子叶表面25-35min，在实验室中将孢子叶从叶柄上剪切下，然后在超净工作台上将孢子叶置于含有吐温20(Tween-20，化学名称：聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯)的0.1％HgCl2溶液中灭菌5-6min，无菌水冲洗5-6次，无菌滤纸吸干后，将灭菌的孢子叶平铺在配子体诱导培养基上，培养室温度为20-25℃，光照10-14h/d，光照强度为30-40μmol/(m2·s)。
所述原叶体增殖与继代中，继代时将原叶体团分成直径为0.4-0.6cm的小块，继代周期为两个月。
所述孢子体诱导中，取继代两个月的原叶体团，搅切浓度为每200mL搅切溶液中含1块直径为1cm的原叶体团，搅切溶液为：NH4NO3410mg/L、KNO3950mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4220mg/L，搅切时原叶体残渣与溶液不分离，搅切时间为4-6s。
喷播时的基质为泥炭∶珍珠岩＝3∶1，混合液喷播密度为每筛喷200mL，喷播后用塑料薄膜盖住，放置于温室大棚中，大棚温度保持在10-25℃之间，盖好荫网，1个月后将塑料薄膜掀开，半个月浇水一次，保持湿度在80％以上。
本发明利用不完全组培生产铁线蕨，在组培过程中产生的原叶体，保存于培养瓶中，可以四季供应生产孢子体；原叶体打碎可以一次性极大提高原叶体的繁殖倍数，材料所需要的少，降低继代的代数，降低了生产成本，降低了突变率；孢子体的诱导在室外进行，不用无菌操作，对技术工人技术要求低，操作容易，降低了劳动力成本；原叶体碎片对环境的适应能力强，能很快适应外部环境，并恢复生长；孢子体萌发率可达到90％以上，1团原叶体团可产生孢子体1000个以上，效率非常高；播种的原叶体溶液密度好控制，不用再分栽，孢子体直接在大棚基质上产生，不用炼苗，直接进行常规管理，没有缓苗期，孢子体生长快，大大节约了人力。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
首先，配制M1培养基：按MS正常用量的1/2称取以下原料：NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4；其他成分均按MS培养基的正常用量称取，然后加入2％的白糖，0.6％的琼脂，并用蒸馏水定容，然后用HCL或NaOH调节溶液pH值到5.8-6.0，加热融化并分装后经高温高压消毒12-15min，即成M1培养基；
其次，孢子萌发：取含有褐色的成熟孢子囊的铁线蕨孢子叶作为外植体，先按如下操作对外植体表面进行消毒：先用流水冲洗孢子叶表面30min，在实验室中将孢子叶一片一片的从叶柄上剪切下，然后在超净工作台上将孢子叶置于含有几滴吐温20的0.1％HgCl2溶液中灭菌5-6min，无菌水冲洗5-6次；消毒后用无菌滤纸吸干后，将灭菌的孢子叶平铺在M1培养基上诱导孢子萌发，一瓶接种三片，培养室温度为22-23℃，光照12h/d，光照强度为30-40μmol/(m2·s)，获得原叶体；
然后，原叶体增殖与继代：将孢子萌发后产生的原叶体团分成直径约0.5cm的小块，转到新的M1培养基上增殖继代，增殖继代周期为60天；
按如下配方配制搅切溶液：NH4NO3 410mg/L、KNO3 950mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4 220mg/L，备用；
最后，取继代60天的直径1cm的原叶体团与200mL搅切溶液混合后，用豆浆机打碎5S；然后喷播在基质为泥炭∶珍珠岩＝3∶1的筛盘上，按每200mL喷播一筛盘；喷播后用塑料薄膜盖住保湿，放置于温室大棚中，盖上双层荫网，1个月后掀开保湿的塑料薄膜，每半月浇水一次，注意保持湿度在80％以上，夏季可每天喷雾两次，即得到铁线蕨孢子体植株。
经试验检验，采用本发明所述铁线蕨的生产方法，孢子体萌发率可达到90％以上，1团原叶体团可产生孢子体1000个以上，效率非常高。

Claims (6)

1.一种铁线蕨的生产方法，其特征在于：该生产方法包括如下步骤：
A.取铁线蕨孢子叶作为外植体；
B.配孢子萌发和原叶体增殖继代用的M1培养基；
C.孢子萌发，将外植体表面消毒后转到M1培养基上，放置于培养室中培养；
D.原叶体增殖与继代，将孢子萌发后产生的原叶体团分成小块，转到新的M1培养基上增殖继代；
E.孢子体诱导，取原叶体团块与搅切溶液混合后用豆浆机打碎，打碎后的混合液喷播于装有基质的筛盘上，放置于温室大棚中栽培铁线蕨孢子体植株；
其中，所述M1培养基为：1/2MS+2％白糖+0.6％琼脂，pH5.8-6.0，1/2MS即NH4NO3，KNO3，MgSO4·7H2O，KH2PO4用量为MS培养基正常用量的1/2，其它成分不变；
搅切溶液为：NH4NO3 410mg/L、KNO3 950mg/L、MgSO4·7H2O185mg/L、KH2PO4 220mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种铁线蕨的生产方法，其特征在于：所述铁线蕨孢子叶为含有褐色的成熟孢子囊的孢子叶。
3.根据权利要求1所述的一种铁线蕨的生产方法，其特征在于：所述孢子萌发中外植体表面消毒方法为：先用流水冲洗孢子叶表面25-35min，在实验室中将孢子叶从叶柄上剪切下，然后在超净工作台上将孢子叶置于含有吐温20的0.1％HgCl2溶液中灭菌5-6min，无菌水冲洗5-6次，无菌滤纸吸干后，将灭菌的孢子叶平铺在孢子萌发培养基上，培养室温度为20-25℃，光照10-14h/d，光照强度为30-40μmol/(m2·s)。
4.根据权利要求1所述的一种铁线蕨的生产方法，其特征在于：所述原叶体增殖与继代中，继代时将原叶体团分成直径为0.4-0.6cm的小块，继代周期为两个月。
5.根据权利要求1所述的一种铁线蕨的生产方法，其特征在于：所述孢子体诱导中，取继代两个月的原叶体团，搅切浓度为每200mL搅切溶液中含1块直径为1cm的原叶体团，搅切溶液为：NH4NO3410mg/L、KNO3 950mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、KH2PO4220mg/L，搅切时原叶体碎片与溶液不分离，搅切时间为4-6s。
6.根据权利要求5所述的一种铁线蕨的生产方法，其特征在于：喷播时的基质为泥炭∶珍珠岩＝3∶1，混合液喷播密度为每筛喷200mL，喷播后用塑料薄膜盖住，放置于温室大棚中，大棚温度保持在10-25℃之间，盖好荫网，1个月后将塑料薄膜掀开，半个月浇水一次，保持湿度在80％以上。
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