CN105461767A

CN105461767A - 一种连翘苷的化学合成方法

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Publication number: CN105461767A
Application number: CN201410386621.8A
Authority: CN
Inventors: 樊宏宇; 富力
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-08-07
Also published as: EP3178834B1; RU2017107144A3; KR102057549B1; ES2819302T3; US10400004B2; WO2016019682A1; AU2014402936A1; CA2956980A1; RU2017107144A; EP3178834A1; CN105461767B; EP3178834A4; JP6305626B2; RU2667917C2; US20170233425A1; JP2017523190A; AU2014402936B2; KR20170040324A

Abstract

本发明涉及一种化学合成连翘苷的方法，本发明方法首先将糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于有机溶剂后进行糖苷化反应，制得四酰基连翘苷；然后将四酰基连翘苷溶于有机溶剂中，接着加入甲醇钠，进行脱酰基反应，然后加入酸性pH调节剂，调节反应混合物的pH值到中性；最后经过纯化处理即得。本发明所述的制备方法的先进性和实用价值在于，原料来源方便，糖苷化反应的催化剂廉价易得，使制备成本明显下降，而且可工业化生产。

Description

一种连翘苷的化学合成方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及化学合成连翘苷的方法。

本发明所述的制备方法的先进性和实用价值在于，原料来源方便，糖苷化反应的催化剂廉价易得，使制备成本明显下降，而且可工业化生产。

背景技术

连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl)的干燥果实，主要分布于我国河南、山西、陕西、山东等地，此外，湖北、河北、四川、甘肃亦有分布。常用于治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结结核、尿路感染等症。连翘的主要成分为连翘苷(phillyrin)，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等药理作用。目前从天然连翘中提取连翘苷的研究已有大量研究报道，由于药用植物资源日趋匮乏，有效成分含量较低，因此，化学合成连翘苷将会大大降低成本，提高产量，而且对植物资源保护起到一定的作用。

连翘苷的化学合成已有研究，2014年，樊宏宇等人利用四乙酰-D-葡萄糖-1-溴代糖和连翘脂素在相转移催化剂和碱的催化下进行糖苷化反应，然后利用甲醇钠脱保护生成连翘苷[樊宏宇，富力，连翘苷的合成与结构表征，辽宁化工，2014，43，241-243]，但该方法的合成收率较低且四乙酰-D-葡萄糖-1-溴代糖需要五乙酰-β-D-葡萄糖与33％氢溴酸的乙酸溶液作用溴代得到，氢溴酸具有腐蚀性，不利于操作。

发明内容

本发明的目的是针对现有连翘苷的化学合成过程中存在的技术问题提供一种连翘苷的合成方法，本发明方法克服现有技术不足，合成的产物连翘苷的得率高，本发明方法操作工艺过程简单，生产周期短，合成产物连翘苷含量高，产率高，显著降低了连翘苷的生产成本，适宜批量制备和工业化生产。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种连翘苷的化学合成方法，包括如下步骤：

1)将糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于第一有机溶剂后进行糖苷化反应，制得四酰基连翘苷；

2)将四酰基连翘苷溶于第二有机溶剂后，加入甲醇钠，进行脱酰基反应，然后加入酸性pH调节剂，调节反应混合物的pH值至中性后经过纯化处理即得。

其中，步骤1)中所述糖苷化反应的温度为0-20℃，优选为0-10℃，进一步优选为0℃；反应时间为4-15h，优选为8-10h，进一步优选为10h。

特别是，所述糖基给体选择2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯；所述第一有机溶剂选择二氯甲烷、三氯甲烷，1，2-二氯乙烷或甲苯，优选为二氯甲烷。

尤其是，所述2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯选择2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯或2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯。

其中，所述2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯和连翘脂素的摩尔比为1.0-5.0：1。

特别是，本发明进行糖苷化反应过程中，糖基给体2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的用量少，糖苷化产物的得率低，而用量增加则导致副产物增多，糖基给体2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯和连翘脂素的摩尔比优选为1.5～2.5：1。

特别是，所述糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于有机溶剂后在催化剂的作用下，进行所述的糖苷化反应。

其中，所述的催化剂选择路易斯酸。

特别是，所述的路易斯酸催化剂选择C₃-C₉的卤代酰胺、C₂-C₈的硅基氟代烃基磺酸酯、C₁-C₆的氟代烃基磺酸银、三氟化硼-乙醚络合物中的一种或多种，优选为N-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅酯或三氟化硼-乙醚络合物，进一步优选为三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟化硼-乙醚络合物。

其中，所述路易斯酸催化剂和糖基给体2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比1：1.0～10.0。

路易斯酸催化剂的用量低导致糖基给体2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的分解，降低产率；路易斯酸催化剂的用量高，导致糖基给体四酰基连翘苷的分解，降低产率。

特别是，所述路易斯酸催化剂和糖基给体2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比优选为1：5.0～10.0，进一步优选为1：5-6，更进一步优选为1：5。

特别是，所述糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于有机溶剂后在催化剂的作用下，在惰性气体保护下进行所述的糖苷化反应。

其中，所述惰性保护气体为氮气、氩气或氦气，优选为氮气。

特别是，所述糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于有机溶剂后在催化剂、分子筛的作用下，在惰性气体保护下进行所述的糖苷化反应。

其中，所述的分子筛选用硅铝酸盐分子筛或硅铝酸盐粉末。

特别是，所述硅铝酸盐分子筛选用型的硅铝酸盐分子筛，优选为型的硅铝酸盐分子筛。

尤其是，所述分子筛的用量为与分子筛与连翘脂素的质量比为1-10：1，优选为2：1。

特别是，在将四酰基连翘苷溶于第二有机溶剂之前，还包括步骤1A)：采用淬灭剂淬灭所述的糖苷化反应。

其中，所述的淬灭剂选择三甲胺、三乙胺或硫代硫酸钠。

特别是，所述淬灭剂的用量为淬灭剂与路易斯酸的摩尔比为1：1-3，优选为1：1-1.5，进一步优选为1：1。

其中，步骤2)中所述的第二有机溶剂选择二氯甲烷和甲醇的混合溶液。

特别是，所述二氯甲烷和甲醇的混合溶液中二氯甲烷与甲醇的体积之比为1：1-10，优选为1：2。

其中，所述甲醇钠和2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：300～500，优选为1：375-500。

特别是，所述脱酰基反应的时间为4-12h，优选为4h。

特别是，所述酸性pH调节剂选择醋酸、丙酸或盐酸，优选为醋酸。

尤其是，调节反应混合物的pH值到6-7。

本发明的化学合成连翘苷的化学反应式如下：

其中，结构式A为连翘脂素；结构B为2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯；结构C为四酰基连翘苷；结构D为连翘苷。

本发明所述的化学合成连翘苷方法的先进性和实用价值在于，原料来源方便，糖苷化反应的催化剂廉价易得，使制备成本明显下降，而且可工业化生产。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本发明，但这些实施例仅是说明本发明，而不应理解为对本发明范围的任何限制。另外，实施例中的试剂、原料都可以通过商业渠道获得，如有未尽之处，可以参考有机合成指南、药品监管机构的指引以及相应仪器、试剂的厂商说明书等。

实施例1

1)糖苷化反应

将连翘脂素(372mg，0.001mol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯(738mg，0.0015mol)置于100mL三口烧瓶中，其中连翘脂素与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：1.5，加入20mL无水二氯甲烷，型硅铝酸盐分子筛(744mg)；接着通入惰性气体氮气进行惰性气体保护，搅拌0.5h，混合均匀后滴加路易斯酸催化剂三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，0.06mL，0.312mmol)，路易斯酸催化剂与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：5，分子筛与连翘脂素的质量比为2：1，在0℃下搅拌，进行糖苷化反应10小时；

路易斯酸夺去反应底物连翘脂素的羟基的氢后，生成的活性中间体遇到氧气会被氧化，通过惰性气体保护使中间体失去与氧接触的机会，保证反应正常进行；糖苷化反应产生水，加入分子筛目的是除去反应生成的水，保证糖苷化反应的正常进行，同时由于TMSOTf遇水会分解，加入分子筛更能促进反应的正常进行。

2)淬灭处理

向反应混合物中加入淬灭剂三乙胺(0.312mmol)淬灭糖苷化反应，淬灭剂三乙胺与路易斯酸催化剂三氟甲磺酸三甲基硅酯的摩尔比为1：1；接着采用砂芯漏斗过滤淬灭处理后的滤糖苷化反应混合物，滤液浓缩后，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得到四乙酰基连翘苷；

3)脱酰基处理

3-1)将四乙酰基连翘苷溶于30ml的二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积之比为1：2，接着加入甲醇钠(0.22mg，0.004mmol)，甲醇钠与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：375，然后搅拌，进行脱酰基反应，4h之后，加入pH调节剂醋酸，调节脱酰基反应的混合物的pH值至6；

本发明中进行脱酰基化反应的过程中，加入的甲醇钠的碱性既不会破坏糖苷键又可以用作脱酰基化反应的碱，脱除酰基保护基，促进糖苷化反应的进行。脱酰基反应时间至少4h，优选为4-12h。

本发明中向脱酰基反应后的混合物中加入醋酸调节混合物的pH，中和过量的甲醇钠，终止反应，同时醋酸活性适中，不会破坏生成的糖苷键，提高产物的得率。

3-2)采用旋转蒸发仪在真空状态下进行减压浓缩，蒸发去除溶剂后进行硅胶在柱层析分离纯化(洗脱剂：氯仿/甲醇＝8:2)，得白色固体连翘苷426.5mg，总产率79.8％。

白色固体的熔点181-183℃、溶于氯仿、甲醇。与连翘苷标准品(购自中国药品生物制品检定所)的物理特性相同，与连翘苷标准品混合后熔点一致，其光谱和质谱数据与文献报道的连翘苷一致，故鉴定此化合物为连翘苷(Phillyrin)。

按照《中国药典》2000年版一部附录ⅥD的高效液相色谱法测定制备的连翘苷的纯度为99.5％。

ESI-MS谱中，m/z[M-H]533，分子量为534。

¹HNMR(600MHz,d6-DMSO)δ：7.66br,1H,OH)，7.49(d,1H,J＝8.43Hz)，7.21(br,2H)，7.14(s,1H)，7.13(s,1H)，7.01(d,1H.J＝7.89Hz)，6.92(d,1H,J＝8.12Hz)，6.88(d,1H,J＝8.34Hz)，6.54(br,1H)，5.60(d,1H,J＝7.03Hz)，4.82(d,1H,J＝5.92Hz)，4.54(d,1H,J＝6.78Hz)，4.42(d,1H,J＝11.43Hz)，4.25(m,4H)，4.13(d,1H,J＝9.18Hz)，4.01(br,1H)，3.90(t,1H,J＝8.72Hz)，3.75(dd,1H,J＝8.99Hz,6.43Hz)，3.68(s,3H)，3.65(s,3H)，3.64(s,3H)，3.44(t,1H,J＝8.72Hz)，3.27(m,1H)，2.82(q,1H,J＝6.78Hz)。

¹³CNMR(150MHz,d6-DMSO)δ：50.65(C-9)，55.33(C-31)，56.04(C-32)，56.09(C-8)，56.12(C-11)，62.50C-29)，70.20(C-12)，71.38(C-34)，71.43(C-13)，75.03(C-33)，78.69(C-10)，79.04(C-30)，82.43(C-2)，88.07(C-21)，102.53(C-25)，110.52(C-6)，111.20(C-3)，112.47(C-5)，116.37(C-27)，118.58(C-4)，119.22(C-23)，132.29(C-17)，136.40(C-20)，147.60(C-36)，149.09(C-38)，150.35(C-28)，150.38(C-24)。

实施例2

1)糖苷化反应

将连翘脂素(372mg，0.001mol)、2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯(1.11g，0.0015mol)置于100mL三口烧瓶中，其中连翘脂素与2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：1.5，加入20mL无水二氯甲烷，型硅铝酸盐分子筛(744mg)，接着通入惰性气体氩气进行惰性气体保护，搅拌0.5h后滴加路易斯酸催化剂三氟甲磺酸银80mg(0.312mmol)，路易斯酸催化剂与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：5，分子筛与连翘脂素的质量比为2：1，在10℃下搅拌，进行糖苷化反应8小时；

加入分子筛除去反应生成的水，保证反应向正方向进行。

2)淬灭处理

向反应混合物中加入淬灭剂硫代硫酸钠(0.312mmol)淬灭糖苷化反应，淬灭剂硫代硫酸钠与路易斯酸催化剂三氟甲磺酸三甲基硅酯的摩尔比为1：1；接着采用砂芯漏斗过滤淬灭处理后的滤糖苷化反应混合物，滤液浓缩后，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2：1)，得到四苯甲酰基连翘苷；

3)脱酰基处理

3-1)将四苯甲酰基连翘苷溶于30ml的二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积之比为1：2，接着加入甲醇钠(0.22mg，0.004mmol)，甲醇钠与2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：375，然后搅拌，进行脱酰基反应，4h之后，加入pH调节剂醋酸，调节脱酰基反应的混合物的pH值至7；

3-2)采用旋转蒸发仪在真空状态下进行减压浓缩，蒸发去除溶剂后进行硅胶在柱层析分离纯化(洗脱剂：氯仿/甲醇＝8:2)，得白色固体连翘苷373.8mg，总产率70％。

纯化得到的白色固体的理化特性、光谱数据、质谱数据与文献报道的连翘苷一致，故鉴定此化合物为连翘苷(Phillyrin)。

实施例3

1)糖苷化反应

将连翘脂素(372mg，0.001mol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯(1.23g，0.0025mol)置于100mL三口烧瓶中，其中连翘脂素与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：2.5，加入20mL无水三氯甲烷，型硅铝酸盐分子筛(744mg)，接着通入惰性气体氮气进行惰性气体保护，搅拌0.5h后滴加路易斯酸催化剂三氟甲磺酸三甲基硅酯(0.08mL，0.416mmol)，路易斯酸催化剂与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：6，分子筛与连翘脂素的质量比为2：1，在0℃下搅拌，进行糖苷化反应10小时；

2)淬灭处理

向反应混合物中加入淬灭剂三乙胺(0.416mmol)淬灭糖苷化反应，淬灭剂三乙胺与路易斯酸催化剂三氟甲磺酸三甲基硅酯的摩尔比为1：1；接着采用砂芯漏斗过滤淬灭处理后的滤糖苷化反应混合物，滤液浓缩后，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得到四乙酰基连翘苷；

3)脱酰基处理

3-1)将四乙酰基连翘苷溶于30ml的二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积之比为1：2，接着加入甲醇钠(0.337mg，0.00625mol)，甲醇钠与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：400，然后搅拌，进行脱酰基反应，4h之后，加入pH调节剂醋酸，调节脱酰基反应的混合物的pH值至6；

3-2)采用旋转蒸发仪在真空状态下进行减压浓缩，蒸发去除溶剂后进行硅胶在柱层析分离纯化(洗脱剂：氯仿/甲醇＝8:2)，得白色固体连翘苷384.4mg，总产率72％。

实施例4

1)糖苷化反应

将连翘脂素(372mg，0.001mol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯(492.6mg，0.001mol)置于100mL三口烧瓶中，其中连翘脂素与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：1，加入20mL无水二氯甲烷，型硅铝酸盐分子筛(744mg)；接着通入惰性气体氮气进行惰性气体保护，搅拌0.5h后滴加路易斯酸催化剂三氟化硼-乙醚络合物(0.025mL，0.2mmol)，路易斯酸催化剂与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：5，分子筛与连翘脂素的质量比为2：1，在0℃下搅拌，进行糖苷化反应10小时；

2)淬灭处理

向反应混合物中加入淬灭剂三甲胺(0.2mmol)淬灭糖苷化反应，淬灭剂三甲胺与路易斯酸催化剂三氟化硼-乙醚络合物的摩尔比为1：1；接着采用砂芯漏斗过滤淬灭处理后的滤糖苷化反应混合物，滤液浓缩后，经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3:2)，得到四乙酰基连翘苷；

3)脱酰基处理

3-1)将四乙酰基连翘苷溶于30ml的二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积之比为1：2，接着加入甲醇钠(0.11mg，0.002mmol)，甲醇钠与2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：500，然后搅拌，进行脱酰基反应，12h之后，加入pH调节剂醋酸，调节脱酰基反应的混合物的pH值至7；

3-2)采用旋转蒸发仪在真空状态下进行减压浓缩，蒸发去除溶剂后进行硅胶在柱层析分离纯化(洗脱剂：氯仿/甲醇＝8:2)，得白色固体连翘苷400.5mg，总产率75％。

试验例连翘苷抗病毒试验

1体外抗病毒试验

1.1试验材料

(1)药物：以下药品均用纯净水溶解，滤过，除菌分装，4℃备用。

1)连翘苷：白色固体，大连富生天然药物开发有限公司生产，经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.1％；

2)利巴韦林注射液，无色透明液体，由河南润弘股份有限公司生产，产品批号：1206261，国药准字：H19993553，100mg/ml，作为本次试验阳性对照药物；

3)磷酸奥司他韦，中国药品生物制品检定所。产品批号：101096-200901，100mg/支作为本次试验阳性对照药物。

(2)细胞株

Vero(非洲绿猴肾细胞细胞)由吉林大学基础医学院保存细胞株。

(3)病毒株

1)流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)均购于中国预防医学科学院病毒研究所；

2)柯萨奇病毒B₃(CVB₃)株来源于美国,为本教研室保存；

3)柯萨奇病毒A16(CoxA16)株、肠道病毒EV71株，由日本仙台国立医院馈赠，于本教研室保存。

4)腺病毒(AdV)来源于白求恩医科大学一院儿科研究室。

5)单纯疱疹病毒I型(HSV-1)购于卫生部药品生物制品检定所。

(4)主要设备与试剂

生物安全柜，BHC-1300ⅡA/B3，AIRTECH；CO₂培养箱，MCO-18AIC，SANYO；倒置显微镜，CKX41，OLYMPUS；电子分析天平，AR1140/C，DHAUS；培养基，DMEM，HyClone；胎牛血清，HyClone；胰蛋白酶，Gibco；MTT，Sigma；DMSO，天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2试验方法

(1)细胞准备

Vero细胞传代培养1-2d，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液(含10％胎牛血清的DMEM)稀释至约5×10⁷个/L后，接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。

(2)药物毒性测定

细胞毒性试验：将药物按表1-1所示浓度进行稀释，用于细胞毒性测定。

表1-1药物稀释参照表(单位：g/L)

将上述用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)稀释好的不同浓度的药品滴加于Vero单层细胞上，每孔0.2ml，每个浓度6个复孔，另设6孔正常对照(不加药物的正常对照组)和6孔空白对照(培养液)，置37℃，5％CO₂培养箱中培养，每日置倒置显微镜观察CPE并记录。72h后，每孔加入MTT溶液20μL(5mg·mL^－1)，继续孵育4h，吸弃各孔培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡5min，492nm测定OD值，计算细胞存活率。在SPSS18.0统计软件中，将细胞存活率进行Probit回归分析，计算药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC₀)和半数毒性浓度(TC₅₀)。

(3)各种病毒TCID₅₀的测定

将各种病毒进行10倍递减稀释为10^-1,10^-2,10^-3，10^-4，10^-5，10^-6不同稀释度，按序接种于单层的Vero细胞96孔培养板上，每孔100μL，每个稀释度6孔，同时设正常细胞对照组。置37℃，5％CO₂中孵育2h，弃病毒液，随即每孔加细胞维持液100μL，置37℃，5％CO₂中培养。第3天开始在显微镜下观察细胞病变结果，第7-8天判定结果并做好记录，以能使50％细胞孔发生阳性病变的最高稀释度作为终点，用karber法计算病毒滴度。

公式

Log {TCID}_{50} = XM + \frac{1}{2} d - d \frac{ΣPi}{100}

TCID₅₀：50％组织细胞感染量

XM：病毒最高浓度稀释度的对数

d：稀释度系数(倍数)的对数

Σpi：每个稀释度病变百分数的总和

(4)药物对病毒致细胞病变作用的影响

取已长满单层细胞的培养板，吸弃培养液，以100TCID₅₀对应的病毒攻击量接种细胞，37℃，5％CO₂培养箱吸附2h，加入特定浓度(最大无毒浓度左右)的各药液，每浓度6个复孔培养，200μL/孔。设利巴韦林注射液和磷酸奥司他韦为阳性药物对照组，同时设正常对照组(不加病毒不加药)和病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组)，观察药物对病毒致CPE的影响。72h后，用MTT比色法，在492nm波长下测定OD值，计算药物抗病毒有效率(ER％)。在SPSS18.0统计软件中用ANOVA法比较各药物抗病毒有效率之间的显著性差异。

ER％＝(药物处理组平均OD值－病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值－病毒对照组平均OD值)×100％

1.3试验结果

(1)各种病毒的TCID₅₀

副流感病毒：

Log {TCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 50}{100} = - 4

流感病毒：

Log {TCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 50}{100} = - 4

CVB₃：

Log {TCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 100 + 50}{100} = - 5

HSV-1：

Log {LCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 100 + 30}{100} = - 4.8

AdV：

\log {TCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 50}{100} = - 4

RSV：

Log {TCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 100 + 50}{100} = - 5

CoxA16：

Log {TCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 100 + 50}{100} = - 5

EV71：

Log {TCID}_{50} = - 2 + 0.5 - \frac{100 + 100 + 100 + 50}{100} = - 5

(2)药物毒性测定

1)药物对细胞毒性的测定

各药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC₀)、半数毒性浓度(TC₅₀)及药物抗病毒实验用浓度见表1-2。

表1-2药物细胞毒性实验结果(单位：g/L)

2)药物对病毒致细胞病变保护作用结果

药物抗各种病毒的有效率及ANOVA法单因素方差分析结果，详见表1-3。

表1-3药物抗病毒有效率(ER％)统计表

表1-3结果显示，连翘苷对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇病毒B₃(CVB₃)、柯萨奇病毒A16(CoxA16)、肠道病毒EV71、腺病毒(AdV)及单纯疱疹病毒I型(HSV-1)八种病毒均有明显抑制作用；其中，对流感病毒、副流感病毒、单纯疱疹病毒I型(HSV-I)的抑制作用与阳性药利巴韦林、磷酸奥司他韦(达菲)抗病毒疗效相当，柯萨奇病毒B₃(CVB₃)、柯萨奇病毒A16(CoxA16)、肠道病毒EV71、腺病毒(AdV)的抑制作用明显优于阳性药利巴韦林、磷酸奥司他韦(达菲)。

2.体内抗病毒试验

2.1实验材料

(1)实验动物

昆明种小鼠由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供，医动字第10-5219号。

(2)实验仪器

定量PCR仪，7300，ABI；PCR仪，ES-60J，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；电子分析天平，FA1004，沈阳龙腾有限公司；CO₂孵育箱，HG303-5，南京实验仪器厂；超净工作台，SW-CJ-IF，苏州安泰技术有限公司；倒置显微镜，CKX41，OlympusInstrument；－80℃超低温冰箱，TECON-5082，澳大利亚；水浴振荡器，HZS-H，哈尔滨市东联有限公司；酶标仪，TECANA-5082，澳大利亚；分光光度计，7550型；日本。

2.2实验方法

(1)连翘苷抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的研究

1)试验动物及分组

取四周龄的昆明小鼠140只，进行2项试验。取小鼠140只，随机分成14组，每组10只，用于连翘苷对流感和副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验。

2)感染方法

在200～300mL大小的烧杯内放入一团脱脂棉，然后倒入适量的乙醚(使脱脂棉变湿即可)，把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来，把小鼠放入进行麻醉，见小鼠极度兴奋，明显呈无力样时，将小鼠仰卧，滴鼻感染15LD₅₀流感病毒和副流感病毒0.03ml/鼻孔，正常对照组用生理盐水代替病毒悬液。

3)给药方法及给药剂量

连翘苷、利巴韦林和磷酸奥司他韦对照组，分别于感染前一天开始常规灌胃给药，连翘苷高、中、低给药剂量分别为13、6.5、3.25mg/kg，利巴韦林、磷酸奥司他韦阳性药给药剂量分别为19.5mg/kg、58.5mg/kg，每天一次，连续给药5d，病毒对照组灌服相同体积的生理盐水。

4)肺指数测定

小鼠用药后第5天，先禁食水8小时，称体重后摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，以生理盐水洗涤两次，用滤纸吸干表面水份，电子天平称肺重，按下列公式计算计算肺指数和肺指数抑制率：

肺指数＝(小鼠肺重/小鼠体重)×100％。

肺指数抑制率＝(感染模型组平均肺指数-实验组平均肺指数)/感染模型组平均肺指数×100％。

2.3实验结果及分析

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，平均肺指数测定结果显示：与病毒对照组(模型组)比较，连翘苷浓度在3.25～13.0mg/kg/d范围内对流感和副流感病毒感染的小鼠肺组织有明显保护作用，肺指数均明显降低，结果见表2-1、2-2。

表2-1连翘苷对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数的抑制率(n＝3)

与病毒对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

表2-2连翘苷对副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数的抑制率(n＝3)

与病毒对照组比较：*P<0.05。

2.4结论

体内抗病毒试验结果显示，连翘苷在3.25～13.0mg/kg/d的剂量范围对流感病毒和副流感病毒及所引起的小鼠病毒性肺炎具有较明显的抑制作用，能明显降低其肺指数和血凝滴度，与病毒对照组比较差异显著。

Claims

1.一种连翘苷的化学合成方法，其特征是，包括如下步骤：

2)将四酰基连翘苷溶于第二有机溶剂后加入甲醇钠，进行脱酰基反应，然后加入酸性pH调节剂，调节反应混合物的pH值至中性后经过纯化处理即得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤1)中所述糖基给体选择2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯。

3.如权利要求1或2所述方法，其特征是，所述糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于有机溶剂后在催化剂的作用下，进行所述的糖苷化反应。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是，所述催化剂选择路易斯酸。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征是，所述催化剂和糖基给体2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比1：1～10。

6.如权利要求1或2所述方法，其特征是，所述糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于有机溶剂后在催化剂、分子筛的作用下，进行所述的糖苷化反应。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述分子筛选用硅铝酸盐分子筛或硅铝酸盐粉末。

8.如权利要求1或2所述方法，其特征是，所述糖基受体连翘脂素与糖基给体溶于有机溶剂后在催化剂、分子筛的作用下，在惰性气体保护下进行所述的糖苷化反应。

9.如权利要求1或2所述方法，其特征是，在将四酰基连翘苷溶于所述第二有机溶剂之前，还包括步骤1A)：采用淬灭剂淬灭所述的糖苷化反应。

10.如权利要求1或2所述方法，其特征是，步骤2)中所述甲醇钠和2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯的摩尔比为1：300～500。