CN105434344A - 一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液及其制备方法。该口服液以五节芒、巨菌草、芦苇、玉米粉、麸皮等组成的培养基发酵制备的灰树花多糖为主要原料，其制备步骤：制备灰树花菌丝体多糖，配制灰树花多糖溶液，加入辅料并灌装封口，最后杀菌制得成品。体外细胞试验表明，灰树花多糖在前期对EV71病毒的抑制率达80%以上。灰树花多糖能下调宿主细胞内EV71病毒结构蛋白VP₁的表达合成，抑制EV71病毒引起的IêBá蛋白下调来控制EV71病毒复制，增强机体的免疫力。该口服液能预防和控制手足口病的发生，口服液的原材料来自药食兼用菌灰树花，安全无毒。

Description

一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液及其制备方法

技术领域

本发明涉及保健品技术领域，具体为一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液及其制备方法。

背景技术

肠道病毒71型，简称为EV71，是引起婴幼儿手足口病主要病原体之一，常引起儿童手足口病、病毒性咽峡炎，重症患儿可出现心肌炎、肺水肿、脑炎等。手足口病多发生于儿童，尤其是3岁以下婴幼儿多发，少数病情较重，严重的会引起死亡。

灰树花是一种珍贵的药、食兼用蕈菌，灰树花多糖是从其菌丝体或子实体中分离得到的一种主要的生物活性成份，具有抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗辐射和清除自由基等功效。灰树花多糖具有较好的抗流感病毒、艾滋病病毒（HIV）和I型单纯疱疹病毒（HSV-I）的作用。研究发现，固体发酵制备的灰树花多糖能多条通路实现抗EV71病毒的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗EV71病毒灰树花多糖口服液。该口服液富含灰树花多糖，能有效的抗EV71病毒，从而能有效控制手足口病。本发明的另一个目的在于提供一种具有抗EV71病毒灰树花多糖口服液的制备方法。

本发明的目的，可通过以下技术方案来实现：

一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，所述口服液按以下重量份计组分组成：5-10份灰树花多糖粉末，1-3份蔗糖，0.01-0.03份甜菊糖，0.05-0.1份香精，500-1000份纯净水。

所述灰树花多糖粉末的制备方法为：

（1）灰树花菌种以5-10%接种量接种于培养基上，置于20-30℃中避光培养25-35天，得到菌丝体，干燥备用；

（2）将步骤（1）所得灰树花菌丝体中加入纯净水，灰树花菌丝体与纯净水体积质量体积比为1:35，300-600W微波提取6-15min，60-90℃浸提3-6小时，提取结束后，进行3000-4000r/min离心10-20min，取上清液备用，将离心的残渣进行上述步骤提取2-3次，合并上清液；

（3）将步骤（2）上清液在50-60℃、转速为20-40r/min进行旋转蒸发，将上清液浓缩为原来的1/20-1/10；

（4）醇沉，往浓缩的上清液加入3-4倍体积的95%乙醇，置于2-4℃中醇沉5-10h，醇沉后，进行3000~4000r/min离心5-20min，取沉淀物；

（5）向步骤（4）所得提取物中加入10-20倍体积的纯净水，进行搅拌复溶，用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种除蛋白3-5次；

（6）除小分子物质：利用透析袋，截留分子量12000-14000以上，除去有机小分子、色素；

（7）重复步骤（3），得到多糖，并进行冷冻干燥，研磨制得灰树花多糖粉末。

所述的培养基为具体配制为：五节芒20-40%，巨菌草5-10%，芦苇5-10%，玉米粉10-13%，麸皮10-15%，石膏粉1%-2%，水15%-40%，各组分百分数之和为百分百，pH值为5-8，装瓶，中央打孔；

所述的香精为葡萄香精、苹果香精、草莓香精、蓝莓香精、橘子香精中的一种或几种。

一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液的制备方法：

（1）称取灰树花多糖粉末，加入纯净水，搅匀得到灰树花多糖溶液；加入蔗糖，搅匀，加入香精、甜菊糖，调节pH值至6.8-7.5，搅匀；

（2）将步骤（1）得到的溶液静置8-10小时，取上清液经中空纤维膜超滤设备超滤，得滤液；

（3）将步骤（2）得到的溶液分装，封口，100-121℃灭菌10-20mim，制备得到口服液。

本发明的优点在于：

（1）本发明充分利用草本植物（五节芒、巨菌草、芒萁）为灰树花固态发酵的培养基，“以草代木”栽培食药用菌灰树花，解决了菌业生产与林业生态平衡之间的“菌林矛盾”，有利于降低提取制备灰树花多糖的成本。

（2）手足口病是一种常见的传染疾病，到目前为止，临床上还没有十分有效的治疗方案或者疫苗研制成功。中草药显示出了良好的临床治疗效果，灰树花多糖被发现具有多种抗癌，抗炎，抗病毒等药用价值，但在灰树花多糖抗EV71病毒的研究方面，尚未见报道。本发明制备的灰树花多糖具有显著的抗EV71病毒作用，而且细胞毒性效应非常低，这在抗病毒药物中显得十分难得，极具研发推广前景。

所述发明产品在体外细胞试验中具有明显抗EV71病毒效果，对病毒复制的抑制作用是在病毒入侵后的感染早期阶段发挥功效的，在早期抗EV71病毒的抑制率达到80%以上。灰树花多糖通过以下三个通路进行抗病毒功效。

（1）通过下调宿主细胞内EV71病毒结构蛋白VP₁的表达和合成来抑制病毒的复制；

（2）通过抑制EV71病毒诱导的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase-3）的剪切活性来抑制由病毒感染引起的细胞凋亡。

（3）抑制EV71病毒感染引起的细胞核因子êB抑制蛋白á（IêBá）的下调。

具体实施方式

实施例1

一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，所述口服液按以下重量份计组分组成：5份灰树花多糖粉末，1份蔗糖，0.01份甜菊糖，0.05份香精，500份纯净水。

所述灰树花多糖粉末的制备方法为：

（1）灰树花菌种以5%接种量接种于固体培养基上，置于20℃中避光培养25天，得到菌丝体，干燥备用；

（2）将步骤（1）所得灰树花菌丝体中加入纯净水，灰树花菌丝体与纯净水体积质量体积比为1:35，300W微波提取6min，90℃浸提3小时，提取结束后，进行3000r/min离心10min，取上清液备用，将离心的残渣进行上述步骤提取2次，合并上清液；

（3）将步骤（2）上清液在50℃、转速为20r/min进行旋转蒸发，将上清液浓缩为原来的1/10；

（4）醇沉，往浓缩的上清液加入3倍体积的95%乙醇，置于2℃中醇沉5h，醇沉后，进行3000r/min离心5min，取沉淀物；

（5）向步骤（4）所得提取物中加入10倍体积的纯净水，进行搅拌复溶，用Sevag法除蛋白3次；

（6）除小分子物质：利用透析袋，截留分子量12000以上，除去有机小分子、色素；

（7）重复步骤（3），得到多糖，并进行冷冻干燥，研磨灰树花多糖粉末。

所述的固体培养基为具体配制为：五节芒20%，巨菌草10%，芦苇10%，玉米粉13%，麸皮12%，石膏粉2%，水33%，pH值为5，装瓶，中央打孔；

所述的香精为葡萄香精。

制备方法：

（1）称取灰树花多糖粉末，加入纯净水，搅匀得到灰树花多糖溶液；加入蔗糖，搅匀，加入香精、甜菊糖，调节pH值至6.8，搅匀；

（2）将步骤（1）得到的溶液静置8小时，取上清液经中空纤维膜超滤设备超滤，得滤液；

（3）将步骤（2）得到的溶液分装，封口，100℃灭菌10mim，制备得到口服液。

实施例2

一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，所述口服液按以下重量份计组分组成：10份灰树花多糖粉末，3份蔗糖，0.03份甜菊糖，0.1份香精，1000份纯净水。

所述灰树花多糖粉末的制备方法为：

（1）灰树花菌种以10%接种量接种于固体培养基上，置于30℃中避光培养35天，得到菌丝体，干燥备用；

（2）将步骤（1）所得灰树花菌丝体中加入纯净水，灰树花菌丝体与纯净水体积质量体积比为1:35，600W微波提取15min，60℃浸提6小时，提取结束后，进行4000r/min离心20min，取上清液备用，将离心的残渣进行上述步骤提取3次，合并上清液；

（3）将步骤（2）上清液在60℃、转速为40r/min进行旋转蒸发，将上清液浓缩为原来的1/20；

（4）醇沉，往浓缩的上清液加入4倍体积的95%乙醇，置于4℃中醇沉10h，醇沉后，进行4000r/min离心20min，取沉淀物；

（5）向步骤（4）所得提取物中加入20倍体积的纯净水，进行搅拌复溶，用三氟三氯乙烷法除蛋白3-5次；

（6）除小分子物质：利用透析袋，截留分子量14000以上，除去有机小分子、色素；

（7）重复步骤（3），得到多糖，并进行冷冻干燥，研磨灰树花多糖粉末。

所述的固体培养基为具体配制为：五节芒40%，巨菌草5%，芦苇5%，玉米粉10%，麸皮15%，石膏粉1%，水24%，pH值为6，装瓶，中央打孔；

所述的香精为苹果香精。

制备方法：

（1）称取灰树花多糖粉末，加入纯净水，搅匀得到灰树花多糖溶液；加入蔗糖，搅匀，加入香精、甜菊糖，调节pH值至7.5，搅匀；

（2）将步骤（1）得到的溶液静置10小时，取上清液经中空纤维膜超滤设备超滤，得滤液；

（3）将步骤（2）得到的溶液分装，封口，121℃灭菌20mim，制备得到口服液。

实施例3

一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，所述口服液按以下重量份计组分组成：8份灰树花多糖粉末，2份蔗糖，0.02份甜菊糖，0.07份香精，750份纯净水。

所述灰树花多糖粉末的制备方法为：

（1）灰树花菌种以7%接种量接种于固体培养基上，置于25℃中避光培养30天，得到菌丝体，干燥备用；

（2）将步骤（1）所得灰树花菌丝体中加入纯净水，灰树花菌丝体与纯净水体积质量体积比为1:35，450W微波提取10min，80℃浸提5小时，提取结束后，进行4000r/min离心15min，取上清液备用，将离心的残渣进行上述步骤提取3次，合并上清液；

（3）将步骤（2）上清液在60℃、转速为30r/min进行旋转蒸发，将上清液浓缩为原来的1/10；

（4）醇沉，往浓缩的上清液加入3倍体积的95%乙醇，置于3℃中醇沉7h，醇沉后，进行3000r/min离心15min，取沉淀物；

（5）向步骤（4）所得提取物中加入15倍体积的纯净水，进行搅拌复溶，用三氯乙酸法除蛋白5次；

（6）除小分子物质：利用透析袋，截留分子量13000以上，除去有机小分子、色素；

（7）重复步骤（3），得到多糖，并进行冷冻干燥，研磨灰树花多糖粉末。

所述的固体培养基为具体配制为：五节芒30%，巨菌草10%，芦苇10%，玉米粉13%，麸皮10%，石膏粉2%，水25%，pH值为8，装瓶，中央打孔；

所述的香精为葡萄香精、苹果香精、草莓香精、蓝莓香精、橘子香精中的一种或几种。

制备方法：

（1）称取灰树花多糖粉末，加入纯净水，搅匀得到灰树花多糖溶液；加入蔗糖，搅匀，加入香精、甜菊糖，调节pH值至7.0，搅匀；

（2）将步骤（1）得到的溶液静置9小时，取上清液经中空纤维膜超滤设备超滤，得滤液；

（3）将步骤（2）得到的溶液分装，封口，110℃灭菌15mim，制备得到口服液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，制备灰树花的培养基不仅限于以上所述配方，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，其特征在于：所述口服液按以下重量份计组分组成：5-10份灰树花多糖粉末，1-3份蔗糖，0.01-0.03份甜菊糖，0.05-0.1份香精，500-1000份纯净水。

2.根据权利要求1所述的一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，其特征在于：所述灰树花多糖粉末的制备方法为：

（1）灰树花菌种以5-10%接种量接种于培养基上，置于20-30℃中避光培养25-35天，得到菌丝体，干燥备用；

（2）将步骤（1）所得灰树花菌丝体中加入纯净水，灰树花菌丝体与纯净水体积质量体积比为1:35，300-600W微波提取6-15min，60-90℃浸提3-6小时，提取结束后，进行3000-4000r/min离心10-20min，取上清液备用，将离心的残渣进行上述步骤提取2-3次，合并上清液；

（3）将步骤（2）上清液在50-60℃、转速为20-40r/min进行旋转蒸发，将上清液浓缩为原来的1/20-1/10；

（4）醇沉，往浓缩的上清液加入3-4倍体积的95%乙醇，置于2-4℃中醇沉5-10h，醇沉后，进行3000~4000r/min离心5-20min，取沉淀物；

（5）向步骤（4）所得提取物中加入10-20倍体积的纯净水，进行搅拌复溶，用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种除蛋白3-5次；

（6）除小分子物质：利用透析袋，截留分子量12000-14000以上，除去有机小分子、色素；

（7）重复步骤（3），得到多糖，并进行冷冻干燥，研磨灰树花多糖粉末。

3.根据权利要求2所述的一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，其特征在于：所述的培养基为具体配制为：五节芒20-40%，巨菌草5-10%，芦苇5-10%，玉米粉10-13%，麸皮10-15%，石膏粉1%-2%，水15%-40%，各组分百分数之和为百分百，pH值为5-8，装瓶，中央打孔。

4.根据权利要求2所述的一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液，其特征在于：所述的香精为葡萄香精、苹果香精、草莓香精、蓝莓香精、橘子香精中的一种或几种。

5.一种如权利要求所述的一种灰树花多糖抗肠道病毒71型口服液的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下：

（1）称取灰树花多糖粉末，加入纯净水，搅匀得到灰树花多糖溶液；加入蔗糖，搅匀，加入香精、甜菊糖，调节pH值至6.8-7.5，搅匀；

（2）将步骤（1）得到的溶液静置8-10小时，取上清液经中空纤维膜超滤设备超滤，得滤液；

（3）将步骤（2）得到的溶液分装，封口，100-121℃灭菌10-20mim，制备得到口服液。