CN105412909A - 一种重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法，所述溶液剂包含重组人白细胞介素-12、磷酸盐缓冲液PB、NaCl和泊洛沙姆188，其中磷酸盐缓冲液将所述溶液剂的pH保持为6.0～7.2。本发明提供的溶液剂具有很好的稳定性，外观澄清、无不溶物、不含防腐剂、不含血液成分，所含的活性多肽的体外活性比较稳定；在规定条件下，可稳定保存至少8个月，且产品质量比粉针剂型有明显提高。

Description

一种重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法，属于生物制药领域。

背景技术

白细胞介素-12(IL-12)是人体内重要的细胞因子，可提高辅助性T细胞数量和活性以增强整体的免疫功能，通过调节NK细胞和巨噬细胞介导的非特异性的免疫和Th1、CTL介导的特异性免疫作用，产生一系列的生物效应。国外重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的临床试验方案已达30多项，涉及多种传染病(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病)，多种肿瘤(如黑色素瘤、肾癌、直肠癌、前列腺癌、宫颈癌等)，自身免疫性疾病和哮喘等，但至今仍未批准上市，将rhIL-12制备成使用方便，易于人体吸收、代谢的剂型，显的尤为重要。

注射剂作用迅速可靠，不受pH、酶、食物等影响，无首过效应，可发挥全身或局部定位作用，适用于不宜口服药物和不能口服的病人。低剂量的rhIL-12对治疗急性放射病有很好的效果，对于核事故等紧急情况下，需要作用迅速和使用方便的剂型因此将rhIL-12制成注射剂是本领域技术人员的研究方向之一。

目前国内外市场尚未有白介素-12注射剂剂型被批准，无论是水针剂(即液体注射剂)还是粉针剂。这是因为rhIL-12溶液在存放过程中稳定性较差，不溶性微粒逐渐增高，很快超过允许限度，溶液出现絮状凝集物或细小蛋白颗粒。因此现有的研究倾向于将rhIL-12制成冻干粉针剂。中国专利申请CN102178931A公开了一种这样的制剂，其通过将包含rhIL-12、甘露醇、人血白蛋白、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠的溶液冻干而获得，以避免降低生产的rhIL-12的蛋白含量和生物活性，并保持其稳定性。

粉针剂虽然稳定性较好，但是制备方法复杂，成本高，使用时需要加入注射用水，给临床使用带来不便。尤其是，发生核事故时，需要及时给病人注射rhIL-12，紧急情况下，在事发地进行紧急救治，粉针剂就有些不太方便。因此研制开发rhIL-12水针剂型具有重要的意义。

水针剂型取代冻干剂型是生物制品的发展趋势，许多医药公司都积极将细胞因子类蛋白质药物制成水针剂型，如干扰素、白介素2、G-CSF、EPO等。与冻干剂型相比，水针剂型具有明显优势，水针无需溶解，直接注射，给药方便，制造成本明显降低，易于被医生和患者接受，质量风险较小等。

但是，鉴于白介素-12注射剂的长期稳定性，包括pH，活性等，还有保持良好的药效等上述技术难题，目前尚未开发出令人满意的rhIL-12液体注射剂。

发明内容

本申请发明人针对这个课题，展开了一系列的研究，对处方进行了优化，最终研制成功了稳定的rhIL-12的溶液配方，该配方可开发成直接注射给药的液体注射剂，其稳定性甚至优于一般的粉针剂。

具体而言，本发明提供一种重组人白细胞介素-12的溶液剂，其包含重组人白细胞介素-12、磷酸盐缓冲液PB、NaCl和泊洛沙姆188，其中磷酸盐缓冲液PB将所述溶液剂的pH保持为6.0～7.2。

在一个实施方式中，所述重组人白细胞介素-12的浓度为3～50μg/mL，优选5～20μg/mL，优选10～15μg/mL。重组人白细胞介素-12是本发明溶液剂的活性成分，从保持稳定性，防止出现不溶性微粒的角度出发，将其浓度设为上述范围。另外，发现在pH为6.0～7.2时，作为活性成分的重组人白细胞介素-12，稳定性较好。

在一个实施方式中，所述NaCl的浓度为使得溶液剂的渗透压为260～320mOsm/kg，优选为60～200mM，优选为100～150mM，最优选为150mM。NaCl的作用是作为渗透压调节剂来调节溶液剂的渗透压。与常用的海藻糖相比，对本发明而言，NaCl能够更好地发挥调节渗透压的作用。

在一个实施方式中，所述泊洛沙姆188的0.05～0.2w/v，优选为0.1％w/v。泊洛沙姆188是聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，可通过商购获得，通常市售平均分子量为约7680-9510)。在本发明中，泊洛沙姆188起表面活性剂(增溶剂)的作用。其能够促进rhIL-12的溶解，防止聚合，同时防止吸附作用。此外申请人令人惊奇地发现，与其他常规表面活性剂药用辅料，例如吐温-20相比，泊洛沙姆188有利于长期贮存后rhIL-12的比活性的保持(参见表9)。

在一个实施方式中，将所述溶液剂用作注射液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述溶液剂包含10μg/mL的重组人白细胞介素-12、将所述溶液剂的pH保持为6.0的磷酸盐缓冲液PB、150mM的NaCl和0.1％的泊洛沙姆188。

此外，本发明还提供上述重组人白细胞介素-12的溶液剂的制备方法，所述方法包括：

1)称量一水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠，加注射用水溶解，配制PB缓冲液；

2)向上述溶液中加入作为渗透压调节剂的NaCl，搅拌溶解；

3)向上述溶液中加入作为增溶剂的泊洛沙姆188，搅拌至完全溶解；

4)调节pH至6.0～7.2，用NaOH或H₃PO₄调节pH，所述NaOH或H₃PO₄的优选浓度为1M；

5)加入重组人白细胞介素-12蛋白原液，以使重组人白细胞介素-12终浓度为3～50μg/mL，优选5～20μg/mL，优选10～15μg/mL的方式的方式定容至终体积。

与现有技术相比，本发明重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法，所得的产品外观良好，不会降低生产的rhIL-12的蛋白含量和生物活性，稳定性好，制备方法简单。

此外，本发明解决了冻干粉针剂型外观不佳、不溶性微粒偏高，可见异物超标等问题；提供的溶液剂具有很好的稳定性，外观澄清、无不溶物、不含防腐剂、不含血液成分，所含的活性多肽的体外活性比较稳定；在规定条件下，可稳定保存至少11个月，优选1年以上，更优选2年以上，且产品质量比粉针剂型有明显提高。

附图说明

图1是说明不同pH的剂型4的含量检测的图。

具体实施方式

实施例1

按pH＝6加入磷酸盐缓冲液PB，加适量水溶解后，再加NaCl，使其终浓度为150mM，溶解后，加入终浓度为0.1％的泊洛沙姆188，完全溶解后，用1MNaOH调节pH为6.0，并加入终浓度为10μg/ml的重组人白细胞介素-12，从而制得本发明的溶液剂。其在下述制剂剂型筛选实验中作为剂型4给出。

以下通过制剂剂型筛选实验来说明本发明溶液剂的具体配制、组分和优点。

实施例2

1.剂型初步筛选

1.1剂型设计

表1剂型设计方案

剂型设计同时考虑了冻干粉剂和溶液剂两种剂型，冻干粉制剂容易保存，运输方便，但是冻干工艺较为复杂，因此，两种类型的制剂均在考察范围内。

最初实验设计了3个冻干粉剂和2个溶液剂剂型，共5个剂型。从外观、含量、活性等几个方面进行检测分析，比较各种剂型在一定条件下(25℃)的稳定性，筛选较为优良的剂型。

1.2剂型筛选实验

1.2.1外观检查

剂型1、2、3为冻干粉剂，其外观状况如下：

1号剂型：多数粉饼完整，无散块、粉末，少数含有散块、散粉，且粘壁；

2号剂型：粉饼体积基本为1ml，有散块、粘壁现象；

3号剂型：粉饼体积极小，为不定形白色块状，无粘壁现象。

以上冻干粉剂中，1号最好，偶有粘壁和散块现象。2号次之，粉饼体积略少，有散块。3号最差，絮状，无定形，体积极小。各冻干粉剂均易复溶，且复溶后，溶液透明，无不溶物，无混浊现象。

溶液型剂型4、5，溶液澄清，无不溶物。

1.2.2渗透压

表2制剂的渗透压测定

检测以上5个剂型的渗透压，剂型1、2、4的渗透压为300mmol/kg左右，符合注射剂型的标准要求范围260-340mmol/kg；而剂型3、5的渗透压值偏低，不符合渗透压标准。

1.2.3含量分析

表3制剂的Elisa含量测定

检测时间为配制后第14天，每种剂型的样品随机各取2份，原液样品1份，用Elisa法检测样品Il-12蛋白含量。

剂型1、2、3为冻干粉剂，剂型4、5为溶液剂，从上表的含量数据看来：溶液型的5号制剂含量最高，最为接近原液蛋白含量；剂型1最为差一些，其他3个剂型相差不大。

同时，制剂1和制剂4的区别仅在于，剂型1为冻干型，剂4为溶液型，制剂3和制剂5的区别仅在于，剂型3为冻干型，剂5为溶液型。对比冻干粉剂型和溶液剂型，溶液型制剂似乎比冻干粉剂型的蛋白含量高，更为接近原液蛋白含量。而关于冻干粉制剂蛋白含量较低的原因，可能是赋形剂、冻干保护剂等不足，使蛋白在冻干时受到破坏。

1.2.4活性

由于3号剂型冻干后无定形、体积骤减，外观严重不合格，故没有进行活性检测。仅对剩余4个剂型进行了活性分析，结果如下：

表4制剂活性测定

样品室温放置一段时间后，采用细胞法检测活性，结果分析以原液活性为参比，比较其他制剂的活性。原液分装后冻存于-80℃，每次实验取出一支同时检测，作为阳性对照。

由表6可见，剂型5的活性最好，其次为剂型4和剂型2，剂型1的活性最低。同时，制剂1和制剂4的区别仅在于，剂型1为冻干型，剂4为溶液型，表明溶液剂在活性稳定性方面优于冻干粉剂型。

1.3结果总结

将5个剂型的以上各检测结果综合分析：

表5制剂剂型检测数据表

对上表中的各项检测结果进行评分，做成表6，以便评选优劣剂型。

表6制剂剂型的各项评分表

	剂型1	剂型2	剂型3	剂型4	剂型5
						外观	++	+	-	+++	+++
渗透压	+++	+++	-	+++	-
						含量	+	+	++	++	+++
活性	++	++	未检测	++	+++

注：“-”表示检测不合格，可直接否决该剂型；“+”表示合格程度，“+”越多表示合格度越高。

根据表6分析：

首先，对5个剂型单独分析，利用排除法，去掉不合格剂型：

剂型3渗透压、外观均不符合要求，为不合格剂型；

剂型5渗透压不符合要求，为不合格剂型。

其他3个剂型(剂型1、2、4)，含量和活性分析，各剂型差别不大，2号剂型外观较差，粉饼有散块、粘壁现象；剂型1大部分外观合格，适当调整冻干工艺，可以作为备选剂型；剂型4各项评分均为良好以上，为最优剂型。

其次，从冻干和溶液型两种剂型比较：

冻干粉剂的剂型1、剂型2、剂型3：剂型3粉饼体积变小，严重不合格；剂型2散块较多，颠倒易脱落，也不合格；剂型1外观最好，但仍有小半数粉饼有散块，不能全部符合要求。如果采用冻干粉剂，需要继续增加冻干保护剂、赋形剂等辅料，以及改进冻干工艺等研究。

综合分析外观、pH、渗透压、含量和活性等各项检测结果，其中，剂型4号(溶液型)是最优剂型。

2.剂型进一步筛选

2.1剂型设计

表7剂型设计方案

剂型设计是基于前面初步筛选结果溶液剂优于冻干粉剂，全部采用溶液剂，并且，因为剂型5渗透压不合适，所以再次剂型设计时，对剂型5做渗透压调整。同时对剂型4和剂型5各设两个pH。然后通过含量检测，对该4个剂型进行筛选。

2.2含量分析

表84个剂型的Elisa含量测定

注：原液是配制制剂所用原液，-80℃放置。

样品在4℃和25℃放置，第42天进行含量检测，从结果来看，4个剂型含量并没有明显差异。

2.3活性分析

表94个剂型的活性测定

样品在25℃放置，第43天进行含量检测，4个剂型的活性数据显示，剂型4的活性最好。

通过含量和活性检测分析，剂型4是最优剂型。

3.pH对4号剂型的影响

针对筛选出的剂型4，了解pH对其稳定性的影响，以含量分析为主。

配制不同pH的剂型4制剂溶液，pH分别是5、6、6.5、7、7.2；为了便于观察pH对该剂型的影响，选定室温(25℃)和37℃两种温度条件。分别在两种温度条件下放置43天，Elisa法检查其含量。

表10剂型4不同pH制剂的Elisa含量(μg/ml)

将表5作成柱状图，如图1所示。

在25℃条件下放置43天后，不同pH的剂型4的蛋白含量差异不明显。

在37℃条件下放置43天后，不同pH的剂型含量均低于25℃，蛋白对高温环境较为敏感，高温不利于目的蛋白的稳定；同时，同为37℃条件下的不同pH的剂型，其蛋白含量差异也比较明显：剂型4在37℃，pH7和pH7.2的条件下含量较高，稳定性较好，pH为6及6.5时，稳定性稍差，而pH较低(pH5.6)的条件下稳定性很差，蛋白几乎全部降解。

4.剂型4℃存储稳定性的初步研究

根据剂型筛选的结果，将选定的最优剂型4进行稳定性的初步研究。以蛋白质量的关键影响项目——活性为主要检测项，评价制剂的稳定性。以下分别给出了5μg/ml和20μg/ml的制剂的稳定性、活性结果，其是按照实施例1所述的方法制备的，除了rhIL-12浓度之外，其他组分和含量与表1中的剂型4相同。

4.15μg/ml制剂4样品的稳定性(4℃)

表115μg/ml剂型4的活性检测

注：WHO标准品浓度1μg/ml，效价10000IU/ml；IL-12浓度5μg/ml。

活性检测采用细胞法，结果本身有一定波动性,允许误差为30％。检测刺激产物IFN-γ含量，以制作活性曲线，由曲线得到活性EC50，再以标准品的活性效价计算样品的效价，最后得出样品的比活性。5μg/ml的4号制剂D10比活性为9,729,300IU/mg，其70％-130％范围为6,810,510-12,648,090IU/mg，4℃存放，D86、D204、D238和D331检测的活性均在此范围内。表明在这约11个月长的存储过程中，5μg/ml的4号制剂样品的体外活性比较稳定。

4.220μg/ml制剂4样品的稳定性检测(4℃)

表920μg/ml剂型4的活性检测

采用以上4.1相同的方法检测样品的比活性。20μg/ml的4号制剂D10比活性为21,666,667IU/mg，D103比活性为24,375,000IU/mg，D206检测的活性为21,714,286IU/mg，活性基本维持不变。表明在这约7个月长的存储过程中，20μg/ml的制剂4样品的体外活性比较稳定。

Claims (7)

1.一种重组人白细胞介素-12的溶液剂，其特征在于，所述溶液剂包含重组人白细胞介素-12、磷酸盐缓冲液PB、NaCl和泊洛沙姆188，其中磷酸盐缓冲液PB将所述溶液剂的pH保持为6.0～7.2。

2.如权利要求1所述的溶液剂，其特征在于，所述重组人白细胞介素-12的浓度为3～50μg/mL，优选5～20μg/mL，优选10～15μg/mL。

3.如权利要求1所述的溶液剂，其特征在于，所述NaCl的浓度使得溶液剂的渗透压为260～320mOsm/kg，优选的浓度为60～200mM，优选为100～150mM，最优选为150mM。

4.如权利要求1所述的溶液剂，其特征在于，所述泊洛沙姆188的浓度为0.05～0.2w/v，优选为0.1％w/v。

5.如权利要求1所述的溶液剂，其特征在于，所述溶液剂为注射液。

6.如权利要求1所述的溶液剂，其特征在于，所述溶液剂包含15μg/mL的重组人白细胞介素-12、将所述溶液剂的pH保持为6.0的磷酸盐缓冲液PB、150mM的NaCl和0.1％的泊洛沙姆188。

7.权利要求1～5所述的重组人白细胞介素-12的溶液剂的制备方法，所述方法包括：

1)称量一水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠，加注射用水溶解，配制PB缓冲液；

2)向上述溶液中加入作为渗透压调节剂的NaCl，搅拌溶解；

3)向上述溶液中加入作为增溶剂的泊洛沙姆188，搅拌至完全溶解；

4)调节pH至6.0～7.2，用NaOH或H₃PO₄调节pH，所述NaOH或H₃PO₄的优选浓度为1M；

5)加入重组人白细胞介素-12蛋白原液，以使重组人白细胞介素-12终浓度为3～50μg/mL，优选5～20μg/mL，优选10～15μg/mL的方式定容至终体积。