CN105403711A - Ehd2抗体在制备前列腺癌免疫组化试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组化检测试剂中的应用，是以一种对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体；所述前列腺癌免疫组化检测试剂，用于前列腺癌诊断和预后判断，其特征是采用前述对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体，配以常规免疫组织化学试剂，用于对组织细胞中的EHD2蛋白进行定量和定位分析。

Description

EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组化试剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种前列腺癌免疫组化分子病理检测试剂的制备，具体涉及我们开发的一种EHD2特异抗体在制备前列腺癌免疫组化试剂中的应用。

背景技术

前列腺癌是威胁男性的常见肿瘤之一，在欧美国家，仅次于肺癌，位列男性癌症死因的第二位。流行病学资料显示，前列腺癌发病具有显著的地域、种族、年龄差异。多项研究还指出前列腺癌的发病与生活习惯、饮食文化、工作压力、雄性激素水平及家族病史等有相关性。中国处于前列腺癌的低发区，但近年来，我国男性的前列腺癌的发病呈上升趋势，与我国的人口老龄化加剧、生活质量改善及生活方式的改变有关。

我国前列腺癌的基础研究仍相对薄弱，现在常用的前列腺癌诊断方法主要有：直肠指诊、血清PSA、超声和穿刺、影像学检查等。这些诊断方法都停留在对前列腺癌发生的表象进行检查以作为诊断及预后判断的依据，一方面受病理医师经验等人为因素影响，另一方面缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据。而在分子水平对前列腺癌进行相关检测将对前列腺癌个体化诊断及精准医疗具有重要意义。

肿瘤的发生与多种因素有关，每个发病个体又具有不同的发病因素。目前开展的基因序列检测主要从基因突变水平理解肿瘤的异常变化。然而，现有大规模测序研究结果表明，几乎所有的肿瘤相关基因的功能突变率只占肿瘤中的很小部分，在大多数情况下，其它因素特别是真正发挥生物学作用的蛋白质的功能异变才是肿瘤的本质，其影响因素又可包含蛋白的异常表达、异常修饰、异常调控和异常细胞定位。因此，对肿瘤恶性本质的深刻认识和有效控制的前提是明确这些功能蛋白分子的异变情况，免疫组织化学是最有效的检测手段。免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分子抗原的特异性识别，以及化学标记的第二抗体的显色等作用来检测组织细胞内目标抗原的表达量及其亚细胞定位。

近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认识的不断深入，免疫组化在肿瘤诊断与鉴别中的应用价值得到了普遍的认可。虽然前列腺特异性抗原PSA、己糖激酶Hk2等非免疫组化检测指标被广泛用于前列腺癌的临床分子病理诊断，但对前列腺癌的病理分析和临床用药所起的作用非常有限、不够精准。为了不断提高前列腺癌的诊治水平，更深入的研究前列腺癌的发病机理，有待其它分子指标被揭示并纳入到临床应用中，本发明公开的一种EHD2特异抗体及其免疫组化试剂为前列腺癌的免疫组化分子病理检测提供了一个新的分子指标，将有助于前列腺癌的精准诊疗。

本申请项目前期研究发现EHD2蛋白的表达与定位在前列腺癌中产生异变，自主研发的EHD2特异抗体以及以此抗体为核心的免疫组化试剂可对此异变进行检测。EHD2(Epsinhomology(EH)-domain-containingprotein2)是EHD蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白，含有高度保守的EH结构域。参与受体内吞等胞膜转运的多步调控，是整个胞膜转运机制的必不可少的重要环节，在多种细胞中起分子与物质运输及信号传导等关键作用，它的失调将导致细胞信号应答失当及细胞功能紊乱，并可能进而引发疾病。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特性。目前，由EHD2特异抗体制备的免疫组化试剂未见报道，EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组化检测试剂中的应用也没有先例。

为解决上述问题，本发明公开了EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组化检测试剂中的应用。

发明内容

为解决背景技术中提到的问题，本发明公开了一种EHD2抗体及其在制备前列腺癌免疫组化检测试剂中的应用。

本发明解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组化检测试剂中的应用，是以一种对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体。所述前列腺癌免疫组化检测试剂，用于前列腺癌诊断和预后判断，其特征是采用前述对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体，配以常规免疫组化试剂，用于对组织细胞中的EHD2蛋白进行定量和定位分析。

所述常规免疫组化试剂，包括二抗、显色剂及缓冲剂。

所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601，所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_055416。

所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体，其特征在于，所述抗体能特异性识别人EHD2蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQIDNO：1-543，由该氨基酸序列构成的一种多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO：1。

以所述多肽的氨基酸序列为核心序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肽N端连接一个半胱氨酸；修饰后的所述多肽经纯化后作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体并进行纯化。

有益效果

本发明的有益效果为：

本发明公开了一种EHD2特异抗体在制备前列腺癌免疫组化检测试剂中的应用，由于EHD2蛋白参与受体与胞膜转运的多步调控，以及在各种细胞中对维持物质运输与信号传导等起关键作用，与肿瘤等疾病的发生密切相关。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地从分子水平反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特点，符合肿瘤的精准医疗原则和趋势。

本发明公开的EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组化检测试剂中的应用，以对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体，制备前列腺癌免疫组化检测试剂，制备出的试剂特异性好，灵敏度高，显色性好，能有效判别组织细胞中EHD2基因在蛋白水平的表达情况以及定位特征，为前列腺癌的个体化精准医疗提供新的分子依据。

附图说明

图1为免疫印迹检测结果图。

图2为前列腺增生组织200倍镜下免疫组化图。

图3为前列腺癌组织200倍镜下免疫组化图。

图4为前列腺癌组织400倍镜下免疫组化图。

具体实施方式

实施例1：对EHD2特异抗体的制备

1)实验材料来源

新英格兰大白兔购于上海强耀生物。

多肽CDEEFALASHLIEAKLEGHGLPANLPRRLVPPSKRRHKGSAE由天津赛尔生物技术有限公司定制并与KLH偶联。

CNBr活化的凝胶珠，褔氏完全佐剂及褔氏不完全佐剂购自Invitrigen公司。

2)动物免疫

取4月龄新西兰大白兔3只，将100ug抗原多肽溶于0.2ml0.1MPBS(pH7.2)，与等体积褔氏完全佐剂充分混匀，腹部皮下多点注射。第一次免疫后第15和29天，分别用100ug多肽/0.2mlPBS与等体积褔氏不完全佐剂充分混合后加强免疫。

3)EHD2抗血清的制备

于免疫结束后一周颈动脉取血，37℃静置3小时后离心取血清。

4)抗原凝胶珠制备

CNBr活化的凝胶珠于1mMHCl中浸泡30分钟，用偶联缓冲液(含0.1MNaHCO3pH8.3，和0.5MNaCl)清洗，按1mg多肽加1ml凝胶的比例混合反应体系，4度偶联过夜，1M乙醇胺浸泡3小时后用清洗液1(含50mMTris，1MNaCl，pH8.0)和清洗液2(含50mM甘氨酸,1MNaCl，pH3.5)交叉清洗八遍，PBS清洗1遍。

5)EHD2抗体的纯化

血清与上述抗原凝胶珠按体积比为20:1的混合，加与混合后体系等体积的PBS，混匀1小时后离心，用PBS清洗凝胶珠，用pH3柠檬酸钠溶液洗脱联在凝胶珠上的抗体，调pH至6.5-7.5，得到纯化后的EHD2抗体。

实施例2：对EHD2抗体采用免疫印迹法进行特异性检测

1)实验材料来源

293T细胞购于美国AmericanTypeCultureCollection(ATCC)公司，RPMI1940培养液、BSA、HRP标记抗兔二抗、Lipo2000转染试剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂、ECL化学发光检测试剂等购于Invitrogen公司，EHD1、EHD2、EHD3、EHD4表达质粒为自制。

2)细胞培养

293T细胞培养于RPMI1940培养液中，37℃、5％CO₂培养贴壁生长；细胞传代时先弃去培养液，再用磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)洗两遍，加入0.05％胰蛋白酶消化2分钟，加入培养基终止消化。细胞保持良好状态，两天传一代。转染时分别加入表达EHD1、EHD2、EHD3、EHD4的质粒及转染试剂，2天后收取细胞做免疫印迹实验。

3)免疫印迹方法

将各种细胞预留足够数量至离心管中，离心后RIPA裂解液裂解细胞，煮样，再离心。制得样品后，使用BCA检测试剂进行蛋白浓度的测定。每个样品分别取80ug蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF膜上，室温5％牛奶封闭1小时。洗涤后，与一抗(实施例1中制备的抗体以1:2000加入PBS和5％BSA)在室温孵育1小时。然后与1:5000稀释的抗兔二抗室温孵育1小时。最后用化学发光检测试剂检测。

4)结果：

上述抗体对EHD2蛋白具有高度的特异性，表现为仅仅针对EHD2才有信号，而对高度同源的其它EHD蛋白也不能识别。检测结果见图1。图中：样品Ve为空表达载体，无信号；样品1过表达EHD1蛋白，无信号；样品2过表达EHD2蛋白，在对应分子量70kd位置呈一条主带，信号清晰，并没有其它明显背景条带；样品3过表达EHD3蛋白，无信号；样品4过表达EHD4蛋白，无信号。综上，本实施例提供的抗体在正常位置70kd处具有强烈的信号，而且在其他位置均无信号，结果表明本发明提供的抗体具有很好的特异性。

实施例3：EHD2免疫组织化学检测

1)实验材料来源：

前列腺癌切片取自天津市肿瘤医院肿瘤组织标本库，常规脱蜡。一抗稀释液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的通用二抗、二氨基联苯胺(DAB)底物、底物稀释液等购自中杉金桥。

2)免疫组化检测试剂组配条件及样本组织中EHD2表达与定位的检测方法：

方法主要步骤为：组织切片脱蜡至水，抗原修复，内源过氧化物酶阻断，以1:200滴加实施例(1)制备得到的抗体作为一抗，4℃孵育过夜。缓冲液洗3次每次5min。滴加通用HRP酶标二抗，在室温下孵育30分钟。缓冲液洗3次每次5min。DAB显色，复染，脱水封片后显微镜下观察染色情况。

3)结果

非癌前列腺增生组织中EHD2在上皮细胞核中强着色、浆或膜弱着色(见图2)。癌组织中，EHD2表达水平和定位发生异常，或几乎为阴性(见图3)；或核表达减弱而膜、核、浆表达增强(见图4)。

以上实验结果表明，采用本发明提供抗体为核心的免疫组化检测方法，能很好地检测前列腺癌组织细胞中EHD2的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读EHD2在癌组织细胞中的定位和表达情况，并以此为依据判别肺癌的个体化异质性。

本发明是以所述的自制备的对人EHD2特异的抗体为核心抗体或一抗，配合不同是二抗、显色剂和缓冲剂，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组织化学检测试剂中的应用，其特征在于，采用一种对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体，配以常规免疫组化试剂，用于对组织细胞中的EHD2蛋白进行定量和定位分析。

2.如权利要求1所述的EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组织化学检测试剂中的应用，其特征在于，所述常规免疫组化试剂包括二抗、显色剂及缓冲剂。

3.如权利要求1所述的EHD2抗体在制备前列腺癌免疫组织化学检测试剂中的应用，其特征在于，所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601，所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_055416；所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体能特异性识别人EHD2蛋白；所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQIDNO：1-543，由该氨基酸序列构成的一种多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO：1；以所述多肽的氨基酸序列为核心序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肽N端连接一个半胱氨酸；修饰后的所述多肽经纯化后作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体并进行纯化。