CN101208356A

CN101208356A - 癌症特异性pcna同种型结合性抗体及其用途

Info

Publication number: CN101208356A
Application number: CNA2006800228685A
Authority: CN
Inventors: R·J·希基; L·H·马卡斯; L·施纳佩
Original assignee: Cs- Keith Ltd; Indiana University Research and Technology Corp
Current assignee: Cs- Keith Ltd; Indiana University Research and Technology Corp
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2008-06-25

Abstract

抗体仅特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型，而不结合非恶性增殖细胞核抗原(nmPCNA)同种型。公开了检测csPCNA同种型存在情况的方法和组合物。

Description

癌症特异性PCNA同种型结合性抗体及其用途

相关申请的交叉参考

本申请要求2005年4月7日提交的美国序号60/675,275和2005年6月9日提交的美国序号60/689,614的优先权。

发明领域

本文的公开内容涉及恶性细胞的检测和治疗，包括使用特异性结合癌症特异性蛋白的抗体。

发明背景

在细胞变成恶性细胞时发生的转化是了解得最少且最复杂的疾病过程之一。该过程涉及遗传突变和蛋白体转化，其结果是使细胞逃脱正常控制；阻止不适宜的细胞分裂。所有癌症都是独一无二的，与其它细胞以及其它癌症截然不同。尽管存在这种独特性，但癌细胞共有某些相同特性。大部分癌细胞在正常的细胞周期控制之外增殖，表现出形态变化，并表现出对细胞过程的各种生物化学破坏。

通常在开始出现细胞变化后肿瘤变得充分可见时诊断出癌症。许多癌症在依据组织学检验活检样品的形态异常后被诊断出来，形态异常证明细胞增殖和遗传无规律。恶性肿瘤的有效治疗经常依赖于在疾病早期可靠地检测恶性细胞的存在情况的能力，使得有效治疗可在疾病对此治疗最敏感的阶段开始。因此，需要能够可靠地检测潜在的恶性细胞，此恶性细胞还没有发展至被看作恶性肿瘤的组织学阶段，但可发展至恶性肿瘤状态。还需要快速的、侵入性最低的技术，该技术能够可靠地检测或治疗恶性细胞或潜在的恶性细胞。

增殖细胞核抗原(PCNA)是一种29kDa的核蛋白，其在细胞周期的S期和G2期时于细胞中的表达使该蛋白成为良好的细胞增殖标记。还已经表明，在许多分子途径中的配偶体负责细胞的生命和死亡。其在S期细胞核中的周期性出现提示与DNA复制有关联。PCNA后来被鉴别为哺乳动物细胞中的DNA聚合酶辅助因子和体外SV40DNA复制的必需因子。除了在哺乳动物细胞中用作DNA滑动钳蛋白和DNA聚合酶辅助因子以外，PCNA还与涉及转录、细胞周期关卡、重组、凋亡和其它形式的DNA修复的众多其它蛋白相互作用。除了作用不同之外，PCNA的许多结合配偶体还通过其对每种新一代细胞的细胞功能的精确遗传的影响而连锁。PCNA可用作协调染色体加工的主要分子。

恶性癌细胞表达一种称为癌症特异性PCNA(csPCNA)的PCNA同种型，而非恶性细胞表达一种称为非恶性细胞PCNA(nmPCNA)的同种型。癌症的诊断和治疗需要辨别两种同种型的有效组合物和方法。

发明概述

本发明公开了增殖细胞核抗原(csPCNA)癌症特异性同种型的抗体及其用途。抗体特异性结合癌症特异性PCNA同种型，但不结合非恶性PCNA同种型(nmPCNA)。抗体由含肽的免疫原产生，所述肽包含的氨基酸序列存在于与着色性干皮病群G(XPG)蛋白相互作用的csPCNA蛋白区上。

对应于人PCNA蛋白的氨基酸残基126-133的肽区SEQ ID NO.：1(LeuGlyIleProGluGlnGluTyr)是一种适于产生csPCNA抗体的抗原性肽。本文公开的抗原性肽可包含改善肽的免疫原性而不显著干扰所获csPCNA抗体的特异性的额外氨基酸残基。例如，所述肽可具有SEQID NO：2(CysGlyGlyGlyLeuGlyIleProGluGlnGluTyr)的氨基酸序列。所获抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体或其片段。

本文公开的分离抗体特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型。csPCNA同种型包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列以及不影响csPCNA特异性抗体的特异性的任意变异、突变，包括置换、插入和缺失。csPCNA特异性抗体不结合nmPCNA同种型。

在一个实施方案中，抗体结合的表位包含的氨基酸序列处于结合着色性干皮病群G(XPG)蛋白的csPCNA蛋白中。

在一个实施方案中，抗体结合的csPCNA表位包含的氨基酸序列选自LGIPEQEY(SEQ ID NO：1)、VEQLGIPEQEY(SEQ ID NO：5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQ ID NO：6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQID NO：7)、EQLGIPEQEY(SEQ ID NO：8)、QLGIPEQEY(SEQ IDNO：9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQ ID NO：10)、LGIPEQEYSCVVKMP(SEQ ID NO：11)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQID NO：12)、LGIPEQEYSCVV(SEQ ID NO：13)、LGIPEQEYSCV(SEQID NO：14)和LGIPEQEYSC(SEQ ID NO：15)。

在一个实施方案中，抗体包括单克隆抗体或嵌合抗体或重组抗体或单链抗体。

在一个实施方案中，所述抗体是选自Fab、Fab′或F(ab′)₂的抗体片段。

所述抗体可结合可检测物质，所述可检测物质选自荧光标记、放射性标记、发光标记和酶标记。

一种组合物包含分离的且大致纯化的抗体，所述抗体特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)的表位，其中所述表位包含氨基酸序列LeuGlyIleProGluGlnGluTyr(SEQ D NO：1)。

一种检测生物样品中的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的方法包括以下步骤：

使生物样品与特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的抗体接触；

提供用于抗体结合的条件；以及

检测抗体与csPCNA同种型的结合。

在一个实施方案中，所述生物样品是体液，选自血液、血浆、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。任意体液都是适宜的，只要怀疑其含有csPCNA同种型或PCNA同种型。

在一个实施方案中，所述生物样品是组织样品，选自乳腺、前列腺、肺、结肠、上皮、结缔组织、子宫颈、食道、脑、胸腺、甲状腺、胰腺、睾丸、卵巢、肠、膀胱、胃、软组织瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盘、纤维组织、胚细胞组织及其提取物。

在一个实施方案中，所述抗体检测步骤在体内或体外进行。

在一个实施方案中，所述抗体检测通过提供标记的二抗进行。在另一个实施方案中，标记特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的抗体。在另一个实施方案中，结合csPCNA特异性抗体的csPCNA同种型的检测使用质谱分析进行。在一个实施方案中，csPCNA同种型的检测使用酶联免疫吸附测定进行。在一个实施方案中，csPCNA同种型的检测使用免疫组织化学法进行。结合csPCNA特异性抗体或使用csPCNA特异性抗体分离的csPCNA同种型的检测不限于任何具体的检测技术。

一种诊断或预后恶性肿瘤的方法包括以下步骤：通过特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的抗体检测由动物获得的生物样品中的csPCNA；并基于生物样品中的csPCNA检测诊断恶性肿瘤。在一个实施方案中，所述动物是脊椎动物或哺乳动物。

一种生产癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的特异性抗体的方法包括以下步骤：

给予抗体生产源免疫原性量的肽，所述肽代表仅暴露在csPCNA同种型上而不暴露在非恶性肿瘤同种型(nmPCNA)上的表位，其中所述肽选自与着色性干皮病群G(XPG)蛋白相互作用的csPCNA区上的连续或不连续氨基酸残基；

提供用于抗体产生的条件；以及

分离和纯化所述抗体。

在一个实施方案中，所述抗体由杂交瘤细胞分离和纯化。

在一个实施方案中，所述免疫原性肽包含氨基酸序列CGGGLGIPEQEY(SEQ ID NO：2)。在一个实施方案中，所述肽结合载体蛋白。在一个实施方案中，所述载体蛋白是匙孔血蓝蛋白(KLH)。任意合适的载体蛋白都可与本文公开的肽一起使用。

一种鉴别体内肿瘤位置的方法，该方法包括以下步骤：

给予结合csPCNA的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型特异性抗体，其中所述抗体用可检测物质标记；以及

通过检测标记的csPCNA-特异性抗体在肿瘤部位的累积确定肿瘤位置。

一种使受试者中肿瘤演进的降低增大的方法包括以下步骤：

提供一种药物可接受的组合物，其包含治疗有效量的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型特异性抗体和传递组分的制剂；

给予所述制剂给受试者；以及

通过将含csPCNA-特异性抗体的制剂传递至肿瘤部位降低肿瘤演进，其中所述csPCNA特异性抗体与存在于肿瘤细胞中的csPCNA同种型反应。

在一个实施方案中，所述制剂包含脂质体或纳米颗粒。在一个实施方案中，所述制剂包含肿瘤杀伤剂或免疫增强剂。

一种鉴别抗癌剂的方法包括以下步骤：

使癌细胞群与物质接触；

通过测定csPCNA特异性抗体与csPCNA同种型的结合检测癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的水平；以及

如果与所述物质接触的癌细胞中的csPCNA同种型水平低于未与所述物质接触的癌细胞中的csPCNA同种型水平，则确定所述物质是抗癌剂。

在一个实施方案中，所述物质是小分子或肽或核酸。

在一个实施方案中，所述癌细胞群选自癌细胞系、异种移植物和癌症的同位模型系统。

在一个实施方案中，确定所述物质是否是抗癌剂包括检测与所述物质接触的正常细胞和未与所述物质接触的正常细胞中的非恶性肿瘤PCNA同种型的水平。在一个实施方案中，抗癌剂的鉴别在高通量系统中进行。

一种检测PCNA的csPCNA同种型的免疫测定试剂盒包含以下组分：

一种抗体制备物，其仅特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型，而不特异性结合正常增殖细胞核抗原(nmPCNA)同种型，由此所述抗体和csPCNA形成复合物；

以及检测所述复合物的试剂。

所述试剂盒中的阳性对照肽可包括其氨基酸序列选自以下的肽：LGIPEQEY(SEQ ID NO：1)、VEQLGIPEQEY(SEQ ID NO：5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQ ID NO：6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQID NO：7)、EQLGIPEQEY(SEQ ID NO：8)、QLGIPEQEY(SEQ IDNO：9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQ ID NO：10)、LGIPEQEYSCVVKMP(SEQ ID NO：11)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQID NO：12)、LGIPEQEYSCVV(SEQ ID NO：13)、LGIPEQEYSCV(SEQID NO：14)和LGIPEQEYSC(SEQ ID NO：15)。

在一个实施方案中，csPCNA同种型在免疫测定试剂盒中用作阳性对照。

公开了一种对癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型有特异性的分离的自身抗体。在一个实施方案中，所述自身抗体与csPCNA同种型的表位复合。

一种测定恶性细胞的存在情况的方法包括以下步骤：

使疑似含自身抗体的生物样品与含结合的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型或其片段的底物接触，其中所述自身抗体对csPCNA同种型是特异性的；

提供用于csPCNA-自身抗体复合物形成的条件；以及

检测生物样品中自身抗体-csPCNA复合物的存在情况。

在一个实施方案中，自身抗体-csPCNA复合物的存在情况使用抗人二抗检测。在一个实施方案中，自身抗体-csPCNA复合物的存在情况使用标记的生物样品检测。

一种检测循环性癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的存在情况的方法，所述方法包括以下步骤：检测生物样品中对csPCNA同种型特异性的自身抗体，并由此确定循环csPCNA同种型的存在情况。

一种监测个体的症状缓解情况的方法包括以下步骤：

在癌症治疗之前和之后检测个体中的增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的存在情况；以及

通过比较癌症治疗之前和之后循环csPCNA同种型的水平确定所述个体的症状缓解情况。

在一个实施方案中，通过测定csPCNA同种型自身抗体的存在情况检测csPCNA同种型。在一个实施方案中，csPCNA同种型用csPCNA同种型特异性抗体检测。

在考虑以下详述的实施方案时，本文公开内容的其它特征对本领域技术人员将变得显而易见，实施方案的详述例举了实施目前所认识到的公开内容主题的最佳方式。

附图简述

图1显示了序列表，包括SEQ ID NO：1-4。

图2显示了使用PC 10、Ab121和Ab126抗体的蛋白质印迹的结果。

图3-4显示了使用PC 10和Ab126抗体免疫荧光染色培养物中生长的细胞的结果。

图5显示了使用Ab126抗体免疫组织化学染色石蜡包埋组织切片中的细胞的结果。

图6表明csPCNAab抗体特异性识别csPCNA。对60μg MCF7细胞提取物进行2D-PAGE和蛋白质印迹分析。在蛋白质印迹分析中PC 10和csPCNAab抗体以1∶1000的稀释度使用。

图7表明csPCNAab抗体特异性识别在恶性细胞中特有地表达的PCNA形式。泳道1，MCF细胞提取物(用作PCNA的标记)。泳道2-9，乳癌组织提取物。泳道10-12，正常乳腺组织提取物。胶片过夜曝光。

图8表明，在蛋白质印迹分析中高浓度csPCNAab不识别存在于非恶性乳腺组织中的PCNA同种型。使用公开的方法对由患乳癌妇女或无病妇女制备的200μg组织提取物进行2D-PAGE和蛋白质印迹分析。在蛋白质印迹分析中PC10和csPCNAab抗体以1∶250、1∶500或1∶1000的稀释度使用。泳道1，MCF细胞提取物(用作PCNA标记)。泳道2、4、6，分别使用以1∶1000、1∶500或1∶250的稀释度使用的PC10抗体探测的乳癌组织提取物。泳道3、5、7，分别使用以1∶1000、1∶500或1∶250的稀释度使用的PC10抗体探测的非恶性乳腺组织提取物。泳道8、10、12，分别使用以1∶1000、1∶500或1∶250的稀释度使用的csPCNAab探测的乳癌组织提取物。泳道9、11、13，分别使用以1∶1000、1∶500或1∶250的稀释度使用的csPCNAab探测的非恶性乳腺组织提取物。

图9表明，致瘤性乳腺上皮细胞表达csPCNA，而非致瘤性乳腺上皮细胞不表达csPCNA。用于这些实验的人乳腺上皮细胞(HMEC)在无血清条件下培养。为获得还没有致瘤性的永生化细胞系，由一名31岁的Li-Fraumeni综合症(LFS)患者的非癌性乳腺组织获得HMEC(在两个p53基因等位基因的其中一个的密码子133处含种系突变(Met变为Thr[M133T])，该突变影响野生型p53蛋白构象)。这些细胞以约50-60的群体倍增(PD)水平经历危机期，并以千万分之五的频率自发地永生化。转化的HME细胞系如下建立：用hTERT和H-RasV12感染前永生化HME细胞，然后收集在软琼脂和裸小鼠异种移植物中生长的克隆(Herbert等，尚未付印)。MCF-7乳癌细胞在含10％加强型小牛血清(HyClone，Logan，UT)和50μg/ml庆大霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长。用小鼠抗PC10(识别所有形式的PCNA)或兔csPCNAab(识别csPCNA)对细胞进行免疫荧光染色。在盖玻片上生长的细胞用4％多聚甲醛固定，并用0.1％Triton X-100透化，之后用3％BSA封闭。用含0.5％叠氮化钠的PBS稀释的PCNA抗体和Alexa-Fluor 468抗小鼠IgG或Alexa-Fluor 568抗兔IgG缀合二抗(Molecular Probes，Eugene，Oregon)进行染色。盖玻片用含DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Burlingame，CA)封片，并使用Leica荧光显微镜检验细胞。细胞用DAPI复染，并用使用20X物镜的Leica荧光显微镜观察。

图10表明csPCNAab抗体特异性识别乳癌细胞。正常乳腺组织切片来自3名不同患者：(a-b，e-f)、(c-d，g-h)、(i-j，k-l)；乳癌组织切片来自3名不同患者：(m-n，q-r)、(o-p，s-t)、(u-v，w-x)。将切成3μm切片并置于载玻片上的石蜡包埋组织在二甲苯中温育2次，每次10分钟，以去除石蜡。用连续乙醇清洗液(100-90-80-70-0％的dH₂O溶液)各自再水合载玻片10分钟。使用抗原暴露溶液(VectorLaboratories，Burlingame，CA)进行抗原修复。将载玻片置于封闭缓冲液(3％BSA的PBS溶液)中于室温达30-60分钟。将在封闭缓冲液中1∶200稀释度的小鼠PC10、C20、100-478抗体或兔csPCNAab直接置于组织上，用石蜡覆盖，并在湿润室中于室温温育60分钟。在用PBS进行3次5分钟清洗后，将载玻片与在封闭缓冲液中1∶600稀释度的适宜荧光二抗温育，用石蜡覆盖，并置于暗处的湿润室中于室温达30-60分钟。用PBS进行另一个连续的3次5分钟清洗，用含DAPI的Vectashield^TM封装载玻片。使用具有20X物镜的Leica荧光显微镜检查组织切片。DAPI用作复染剂。

图11表明，csPCNAab IHC检测组织中的乳癌细胞。结果代表在缩乳术后获得的正常乳腺组织、DCIS患者的乳腺组织、侵袭性乳癌或转移性疾病。箭头指示恶性细胞的csPCNAab染色。选择20个乳癌病例。另外，选择显示出正常乳腺组织或良性纤维囊性变化的10个病例。用DAB作为发色团的csPCNAab进行石蜡包埋的恶性和非恶性乳腺组织标本的IHC染色(褐色)；切片用苏木精染色复染(蓝色)，以鉴别细胞核。

图12显示了针对csPCNA抗原性肽的肽特异性鼠多克隆抗体的产生。将用于制备兔多克隆抗体的PCNA肽片段偶联至匙孔血蓝蛋白(KLH)。使用100μg缀合肽腹膜内免疫小鼠，在免疫后12天通过尾部取血收集血清。按照指示将血清稀释在PBS中，并与捕获在ELSIA板上的抗原性肽温育。在用PBS清洗板后，将捕获的鼠抗体与抗小鼠IgG温育，并显色。定量针对csPCNA的多克隆抗体滴度，然后选择产生最高水平的csPCNA抗体的小鼠。取出小鼠脾脏，将脾细胞融合至NS-0细胞，并在HAT培养基中进行选择。

图13表明，csPCNAab抗体特异性识别csPCNA。对60μg MCF7细胞提取物进行2D-PAGE和蛋白质印迹分析。针对不同的PCNA肽片段制备的兔多克隆抗体和市售PC10抗体各以1∶1000的稀释度用于蛋白质印迹分析。csPCNA同种型迁移至凝胶的酸性区，该区域定向于所示凝胶板的左侧，而nmPCNA同种型解析至凝胶的碱性区，该区定向于每块凝胶板的右侧。这些凝胶代表至少3个不同的实验。

图14显示了癌症患者中的自身抗体水平。

图15(A-C)显示了csPCNA抗体(“Ab126”)的特异性和敏感性。

图16显示了癌细胞提取物中的csPCNA同种型的检测。

发明详述

增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白在癌细胞中被改变。PCNA是一种28kD的蛋白，具有的电泳迁移率等于36kDa蛋白的电泳迁移率。PCNA是DNA聚合酶δ介导高效DNA复制活性所需的辅助因子。由恶性细胞纯化的DNA合成体(synthesome)包含至少两种形式的PCNA。根据特异性结合PCNA的市售抗体(PC 10，Oncogene Science，Cambridge MA)染色的双向聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质印迹的检测，两种形式具有相同分子量。但是，两种PCNA物质的总电荷明显不同。因此，恶性肿瘤或癌症特异性的酸性PCNA形式csPCNA和非恶性或正常的碱性PCNA形式nmPCNA可在双向聚丙烯酰胺凝胶上得以辨别。

酸性csPCNA在恶性细胞系中表达，例如HeLa(人宫颈癌)、Hs578T(乳癌)、HL-60(人原粒细胞白血病)、FM3A(小鼠乳癌)、PC 10(前列腺癌)、LNCaP(前列腺癌)、LN99(前列腺癌)、MD-MB468(人乳癌)、MCF-7(乳癌)、KGE 90(食道-结肠癌)、KYE 350(食道-结肠癌)、SW 48(食道-结肠癌)和T98(恶性神经胶质瘤)。酸性csPCNA还在得自人乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、人胃肠肿瘤或食道-结肠肿瘤、鼠乳腺肿瘤的恶性细胞中和人慢性原粒细胞白血病中表达。在非恶性细胞系(例如乳腺细胞系Hs578Bst和MCF-10A)中或在非恶性血清或组织(例如乳腺)的样品中未检测到酸性csPCNA。

市售抗体不能辨别csPCNA和nmPCNA。因此，市售抗PCNA抗体不能用于仅特异性地检测恶性肿瘤形式的PCNA。

提供可特异性检测csPCNA同种型的分离和纯化的抗体制备物。本文公开的抗体制备物是大致纯的，例如csPCNA特异性抗体制备物为约90％纯或约95％纯。所述制备物包含仅特异性结合csPCNA同种型而不结合nmPCNA同种型的抗体。csPCNA抗体和csPCNA抗原结合的亲和常数可在约10⁸/mol至10¹¹/mol以上的因数范围内。

抗体制备物包含结合csPCNA上存在的表位而不结合nmPCNA上存在的表位的抗体。在一个方面，所述表位由结合着色性干皮病群G(XPG)蛋白的csPCNA蛋白区中连续或不连续的氨基酸残基组成。术语“表位”在本文指抗体分子可鉴别和结合的抗原表面上的局部区域。

另一方面，抗体制备物包含的抗体结合含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的表位。

在另一个实施方案中，提供一种生产csPCNA特异性抗体的方法。该方法包括给测试动物给予免疫原性量的肽的步骤，所述肽代表仅存在于csPCNA上而不存在于nmPCNA上的表位。所述肽包含的氨基酸序列含有结合XPG蛋白的csPCNA区中的5-50个氨基酸残基。所述肽可包含5-12个连续的氨基酸残基，或包含13-20个或30个不连续的氨基酸残基，还可包含结构域间连接环区中的氨基酸残基(氨基酸残基121-135)。所述肽可根据需要多次给予，以确保在测试动物中有效生产多克隆抗体。随后纯化多克隆抗体。

在一个另外的实施方案中，提供一种生产单克隆抗体的方法。所述方法包括给予测试动物(通常为小鼠)免疫原性量的肽的步骤，所述肽代表仅存在于csPCNA上而不存在于nmPCNA上的表位。所述肽包含的氨基酸序列选自结合XPG蛋白的csPCNA区中的5-12个连续氨基酸残基或13-50个不连续氨基酸残基。所述肽可根据需要多次给予，以确保在小鼠中有效生产抗体。随后收集测试动物的脾细胞，并准备用于生产杂交瘤细胞。对生产csPCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞进行选择。选定的杂交瘤细胞在适宜的培养基中生长，并由杂交瘤培养基纯化单克隆抗体。

在一个具体的实施方案中，所述肽用做免疫原，以产生含SEQ IDNO：1的氨基酸序列(LeuGlylleProGluGlnGluTyr)的抗体。

具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列(LeuGlyIleProGluGlnGluTyr)和一个或多个额外氨基酸残基的肽适于产生抗体，只要对csPCNA的特异性得以保持。额外的氨基酸可包括来源于PCNA或另一个来源的氨基酸或随机选定的氨基酸。额外的氨基酸还可包括改善稳定性和免疫原性的氨基酸。例如，在一个更具体的实施方案中，用做免疫原产生抗体的肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列(CysGlyGlyGlyLeuGlyIleProGluGlnGluTyr)。此外，可通过本领域众所周知的任意方法纯化抗体。例如，通过使抗血清或培养基穿过将结合抗体的层析柱或改性滤膜亲和纯化单克隆或多克隆抗体。然后可例如使用具有高盐浓度或改变了pH的缓冲液由所述柱洗脱结合的抗体。

在另一个实施方案中，能够产生csPCNA特异性抗体的肽包括以下氨基酸序列的肽：其在SEQ ID NO：1(LGIPEQEY)的NH2末端上含有约+3个连续或不连续的额外氨基酸，在LGIPEQEY的COOH末端上含有约+9个连续或不连续的氨基酸。例如，这些肽中有一些包含氨基酸序列VEQLGIPEQEY(+3-NH2末端，SEQ ID NO：5)、LGIPEQEYSCVVK(+5-COOH末端，SEQ ID NO：6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(+9-COOH末端，SEQ ID NO：7)、EQLGIPEQEY(+2-NH2末端，SEQ ID NO：8)、QLGIPEQEY(+1-NH2末端，SEQ ID NO：9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(+8-COOH末端，SEQ D NO：10)、LGIPEQEYSCVVKMP(+7-COOH末端，SEQ IDNO：11)、LGIPEQEYSCVVKM(+6-COOH末端，SEQ ID NO：12)、LGIPEQEYSCVV(+4-COOH末端，SEQ ID NO：13)、LGIPEQEYSCV(+3-COOH末端，SEQ ID NO：14)、LGIPEQEYSC(+2-COOH末端，SEQ ID NO：15)、LGIPEQEYS(+1-COOH末端，SEQ ID NO：16)和例接LGIPEQEY(SEQ ID NO：1)的额外NH2和COOH末端氨基酸的组合。包括置换的氨基酸突变在本文公开内容的范围之内，该置换不影响产生csPCNA特异性抗体的肽的特异性。肽中的一个或多个氨基酸残基可用氨基酸类似物或非天然氨基酸替换。另外，基于本文公开的肽序列开发的肽模拟物也可用于产生针对csPCNA同种型的抗体。

在另一个实施方案中，提供一种检测癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的方法。所述方法包括使含csPCNA同种型的生物样品接触抗体制备物的步骤，由此抗体和csPCNA同种型形成复合物；以及检测所述复合物的步骤。

生物样品可为体液样品，其可包括血液、血浆、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、精液、泪液、滑液或可测试csPCNA同种型存在情况的任意体液。或者，所述生物样品可为组织样品，其中组织样品的细胞可被怀疑是恶性的。例如，组织切片或细胞培养物可封装在玻璃或塑料载玻片上，并按照标准免疫细胞化学方法与抗体接触。组织提取物或细胞浓缩物或细胞提取物也是适宜的。抗体可包括可检测标记，例如比色、放射性、荧光、化学发光、酶或生物素化部分。抗体和csPCNA之间的特异性结合可使用二抗检测。许多检测结合抗体的系统是本领域已知的。或者，可使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、比色、荧光和表面等离子体共振(SPR)检测溶解的细胞、细胞提取物、液体样品中的抗体的特异性结合以及结合至固体基质的抗体的特异性结合。本公开的抗体还可用于单向或双向聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质印迹，所述凝胶已用于由待测细胞或组织分离蛋白。这些方法是相似的，并在本领域得到广泛实践。使用对csPCNA同种型特异性的抗体捕获循环性csPCNA同种型或其片段，csPCNA同种型或其片段的特征可使用质谱法证实。

在另一个实施方案中，提供一种诊断恶性肿瘤的方法。所述方法包括以下步骤：免疫检测生物样品中的csPCNA，所述生物样品得自人，或者具体地说是疑似具有恶性肿瘤病症的患者，其中免疫检测csPCNA的步骤包括使用本文公开的抗体制备物。

在另一个实施方案中，提供一种有助于诊断恶性肿瘤的方法。所述方法包括免疫检测组织样品中的csPCNA的步骤，其中组织样品的细胞疑似为恶性的，其中免疫检测csPCNA的步骤包括使用本文公开的抗体制备物。但是，要理解的是，可使用所述抗体检测的恶性细胞不限于诸如乳腺、前列腺、血液、脑、胰腺、平滑肌或横纹肌、肝脏、脾脏、胸腺、肺、卵巢、皮肤、心脏、结缔组织、肾脏、膀胱、肠、胃、肾上腺、淋巴结或子宫颈的组织中的恶性细胞，或例如Hs578T、MCF-7、MDA-MB468、HeLa、HL60、FM3A、BT-474、MDA-MB-453、T98、LNCaP、LN 99、PC 10、SK-OV-3、MKN-7、KGE 90、KYE 350或SW 48的细胞系中的恶性细胞。

在另一个实施方案中，提供一种有助于预后恶性肿瘤发展的方法。该方法包括使用本文公开的抗体免疫检测组织样品中的csPCNA，其中组织样品的细胞可被怀疑是恶性的，并将csPCNA的水平与具体恶性肿瘤疾病的演进相关联。而且，所述抗体可用于预后已发展出恶性肿瘤的患者的潜在存活结果。要理解的是，可使用所述抗体诊断或预后的疾病包括但不限于恶性肿瘤，例如各种形式的成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、黑素瘤、结肠癌、肺癌、腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、成淋巴细胞瘤、白血病、骨肉瘤、乳癌、肝癌、肾瘤、肾上腺癌或前列腺癌、食道癌。如果恶性细胞表达csPCNA同种型，则本文公开的抗体能够检测csPCNA同种型。

本文公开的抗体还检测乳腺组织某些肿瘤类型中的恶性肿瘤，这些肿瘤类型包括管囊肿、顶泌腺化生、硬化性腺病、管上皮细胞增生、非典型管内乳头瘤病、柱状细胞改变、放射状硬化病(放射状瘢痕)、乳头腺瘤、管内乳头瘤、纤维腺瘤、乳腺乳头瘤、非典型管上皮细胞增生、非典型小叶增生、原位管癌-再分类为核级1、2和3、原位小叶癌、原位多形性小叶癌、乳腺内脂瘤、乳腺错构瘤、粒细胞瘤、乳腺内脂肪坏死、假血管瘤样间质增生(PASH)、涉及乳腺的恶性黑素瘤、涉及乳腺的恶性淋巴瘤、叶状瘤-良性、临界和恶性亚型以及乳腺肉瘤。

在另一个实施方案中，本文公开的抗体用于通过比较随时间变化的肿瘤中的csPCNA水平确定肿瘤的恶性程度、跟踪恶性肿瘤疾病的演进或患者对治疗的响应。通过使用抗体测定血样的csPCNA同种型存在情况，抗体还可用于检测已脱离肿瘤并存在于患者血流中的恶性细胞。生物样品可得自人类患者或脊椎动物患者。

要理解的是，使用的抗体浓度取决于具体抗体及其对csPCNA的亲和性。典型地，抗体亲和性为约10⁴M^-1至约10⁹M^-1。用于以上讨论的免疫化学方法的抗体浓度例如可为约50至约2000ng抗体/ml，或直到50-500μg/ml。

在另一个实施方案中，提供一种检测csPCNA同种型的免疫测定试剂盒。该试剂盒包含仅结合csPCNA的抗体，并可包含额外的组分，例如试剂，如用于实施采用所述抗体的免疫化学染色、ELISA或RIA的封闭抗血清、二抗、缓冲液或标记试剂。所述试剂盒还可包含阳性对照(例如恶性组织或细胞样品的csPCNA同种型或其肽)和阴性对照(例如非恶性组织样品)。所述试剂盒还可包含使用试剂盒作为恶性肿瘤的诊断或预后辅助的说明书。

在另一个实施方案中，提供一种筛选测试化合物抑制细胞恶性表型的能力的测定系统。所述试剂盒包含本文公开的仅结合csPCNA的抗体和存活恶性细胞的样品。

在另一个实施方案中，csPCNA特异性抗体可用于筛选测试化合物抑制细胞恶性表型的能力的测定，或用于筛选潜在抗肿瘤或抗癌症化合物。所述测定包括使恶性细胞与测试化合物接触，并使用本文公开的抗体观测csPCNA水平。测试化合物可为本领域已知对恶性表型具有作用或具有其它药理作用的药学化合物，或者可为以前不知道具有任何药理学活性的化合物。测试化合物可为天然的，或在实验室设计的。测试化合物可分离自微生物、动物或植物，或者可重组生产，或者通过本领域已知的化学方法合成生产。测试化合物还包括核酸、肽、肽核酸(PNA)、反义寡核苷酸、siRNA核酸和其它抗体。降低csPCNA同种型表达、降低纯化合成体的DNA合成活性水平或增加纯化DNA合成体的复制保真度水平的测试化合物是抑制恶性表型和治疗恶性肿瘤的潜在治疗剂。

在再另一个实施方案中，抗体还可用作治疗剂，以恢复恶性细胞中的PCNA的正常功能。可使用本领域已知的任何方法将所述抗体传递至人类或脊椎动物患者中的恶性细胞中。例如，可将特异性结合恶性细胞中的csPCNA的全长抗体、抗体片段或抗体融合蛋白给予所述患者。包含csPCNA特异性抗体的治疗混合物可传递到肿瘤中。治疗组合物在使用本文公开的诊断方法获得阳性结果后不久给予。治疗组合物的给予剂量和方法都可基于组合物的具体量、患者的病况、年龄和体重、待治疗的具体疾病的演进和其它相关因素来确定。给予可为局部的或全身的，包括注射、口服给予、导管给予和局部给予。

要理解的是，含抗体的治疗组合物的受体介导性靶向传递用于传递抗体至特定组织。包括乳癌、肺癌和卵巢癌在内的许多肿瘤过表达恶性细胞特异性的抗原，例如糖蛋白p185^HER2。特异性结合这些抗原的抗体可结合至含csPCNA特异性抗体的脂质体。抗p185^HER2抗体在注射入患者血流中时将脂质体导向目标癌细胞，在癌细胞中脂质体被胞吞，因此传递其内容物至恶性细胞(Kirpotin等，Biochem.36：66，1997)。

脂质体可载荷本领域已知的抗体(参见Papahadjopoulos等，Proc.Natl.Acad.Sci.88：11640，1991；Gabizon，Cancer Res.52：891，1992；Lasic和Martin，Stealth Liposomes，1995；Lasic和Papahadjopoulos，Science 267：1275，1995；和Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.92：1327，1995)。这种脂质体含约0.02-0.15mg csPCNA特异性抗体/μmol脂质体，可以约5mg/kg的范围给予给患者。治疗性组合物可包含药物赋形剂，例如但不限于依托泊苷或阿糖胞苷或阿霉素。

针对与肿瘤细胞相关的特异性细胞蛋白的自身抗体在许多类型的肿瘤生长期间出现。这些抗体基于以下事实用于鉴别恶性肿瘤的存在情况：在健康个体中一般没有发现自由循环的产生自身抗体的抗原性蛋白。因此，这些自由循环蛋白的存在指示疾病，并可直接用作疾病标记，或者针对这些蛋白中的一种或多种的自身抗体的检测可用作存在疾病的指示。在采用化疗的治疗前取样的IV期乳癌患者血清中存在csPCNA自身抗体表明存在自由循环的csPCNA。

在另一方面，鉴别和分离csPCNA特异性的自身抗体。术语自身抗体在本文指由机体的免疫系统产生的抗体。csPCNA可被发现于晚期或末期癌症患者血流中循环的认知以及表明csPCNA抗体可用于以单细胞水平鉴别癌细胞存在情况的免疫组织化学数据表明，癌症个体的表达也产生csPCNA自身抗体。因为此癌症特异性蛋白一般不会遭遇健康个体的机体免疫系统的细胞，所以csPCNA不被识别为“自身的”。这些csPCNA自身抗体因此还用作存在恶性肿瘤的指示剂。另外，这些自身抗体的存在表明，有可能建立针对产生csPCNA的癌细胞的强免疫应答，它们可用作鉴别机体中癌细胞存在部位的工具。而且，与抗原相比，抗体生产一般表现出数倍的数量增加，因此，csPCNA的自身抗体增加了检测实验的检测灵敏度。

可使用本领域已知的任意合适方法，由生物样品如恶性组织或血清中分离csPCNA特异性的自身抗体。自身抗体还可以自身抗体-csPCNA复合物的形式被分离。结合的csPCNA同种型可分离自复合物，并使用本文描述的csPCNA特异性抗体鉴别。在一个实施方案中，可使用人抗IgG或其它合适的检测试剂鉴别csPCNA同种型特异性的自身抗体。例如，csPCNA可用于结合csPCNA同种型特异性的自身抗体，然后再使用本文描述的csPCNA特异性抗体免疫检测结合的csPCNA同种型。或者，csPCNA蛋白可在结合测定前用可检测物质如荧光染料标记。

在另一个实施方案中，在流体或组织中检测的csPCNA同种型特异性自身抗体的存在情况可周作恶性肿瘤的指示剂。csPCNA特异性自身抗体的检测还可指示恶性细胞的组织部位。另外，此特异性自身抗体的存在可用作评价长期存活可能性的预后指示剂，或用作确定肿瘤去除术或癌症治疗后的患者症状缓解状态的监视工具。预期在去除原发性肿瘤时的抗体转换和csPCNA表达损失会显著降低循环性csPCNA自身抗体的水平。此外，此特异性自身抗体提供了一种基本原理，意味着靶向csPCNA和在一些位置将所述蛋白分泌入血流中的细胞的疫苗其目标可为通过产生细胞毒性免疫应答实施破坏作用。

术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性或特异性。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般来说包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文使用的术语“单克隆抗体”(mAb)指由基本同源的抗体群获得的抗体，即群体所包含的个体抗体是相同的，只是有可能存在少量的天然突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原性位点或表位。而且，每种单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇位点。单克隆抗体可通过各种方法制备，包括但不限于Kohler等，Nature256：495(1975)描述的杂交瘤法，或者可通过重组DNA法制备(例如美国专利第4,816,567号)。单克隆抗体还可使用描述于Clackson等，Nature 352：624-626(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)的技术由噬菌体抗体展示文库分离。生产单克隆抗体一般需要免疫动物，例如小鼠；由其脾脏获得免疫细胞；并将所述细胞与癌细胞(例如来自骨髓瘤的细胞)融合以使其永生化。融合细胞的肿瘤叫做杂交瘤，这些细胞分泌mAb。永生化杂交瘤的生长一般需要使用动物。选择分泌的mAb与csPCNA同种型或其片段强反应的杂交瘤细胞系。细胞生长和复制，以形成将产生期望的mAb的克隆。一般有两种方法用于培养这些细胞一将它们注射入小鼠腹腔，或使用体外细胞培养技术。当注射入小鼠或任意合适的动物中时，杂交瘤细胞复制并在其腹部产生流体(腹水)。此腹水液包含高浓度的抗体。另一种替代方法是以小规模分批系统或大规模分批反应器在组织培养基中培养杂交瘤细胞。

mAb的体外生产通常需要杂交瘤培养物分批生长，并由培养基纯化mAb。可使用配制用于支持杂交瘤细胞系生长的无血清组织培养基。使细胞培养物与常用的组织培养瓶在标准培养条件下温育约10天。然后由培养基收集mAb。杂交瘤细胞在培养基中生长至较高密度产生较大量的mAb，它们可由培养基收集。使用隔层如具有低截流分子量(10,000-30,000kD)的中空纤维或膜适于以高密度培养杂交瘤细胞。这些基于半透膜的系统分离细胞，mAb在通过隔层与含培养基的较大区室分开的小室中产生。培养物可补加帮助优化杂交瘤生长的生长因子。关于抗体生产和纯化方法的一般性综述，参见Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley &Sons Inc，(1988)。

本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链部分与来源于特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源，而链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源，以及包括这种抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(美国专利第4,816,567号；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。

噬菌体展示方法也可用于生产csPCNA特异性抗体。该技术使用细菌和称为噬菌体的细菌病毒，以产生和选择合成抗体，此合成抗体具有免疫系统产生的抗体的全部靶识别特异性。这些合成抗体使用编码哺乳动物系统的天然抗体中靶识别区或可变区的相同基因生产。对噬菌体进行遗传工程改造，使得特定抗体融合至噬菌体外壳上的蛋白，而编码展示抗体的基因包含在噬菌体颗粒中。该技术因此使展示抗体表型与其基因型匹配，允许编码选定抗体的DNA被回收，易于将来使用。这些抗体覆盖的噬菌体的集合称为文库。

为由文库选择具有目标抗体的噬菌体，使噬菌体结合连接至固体表面的靶分子。具有识别靶分子的抗体的噬菌体紧密结合，余下的(未结合的)噬菌体被简单地洗除。噬菌体展示允许选择对给定靶具有不同结合特征的抗体。包含在目标噬菌体中的DNA然后可用于生产更多的选定抗体，用于研究或医学诊断。

噬菌体肽展示方法可用于鉴别结合csPCNA特异性抗体的肽。例如，在约6个氨基酸至约12或15个氨基酸范围内的各种肽(包括肽变体或蛋白)的文库在噬菌体病毒体外部表达，而编码这些肽中每一种的遗传物质位于噬菌体颗粒内部。这在每个变体蛋白序列和编码其的DNA之间产生物理连接，有利于基于对给定靶分子的结合亲和性快速鉴别，例如通过称为淘选的选择方法鉴别csPCNA特异性抗体。例如，如下进行淘选：将噬菌体展示肽的文库与包被csPCNA特异性抗体的板或珠或任意固体基质温育，洗去未结合的噬菌体，并洗脱特异性结合的噬菌体。然后扩增洗脱的噬菌体，接着进行额外的结合/扩增循环，以富集结合序列的混合物。在3-4轮后，通过DNA测序和ELISA表征个体克隆。csPCNA抗体还可用于鉴别合成肽文库中结合csPCNA特异性抗体的肽或肽模拟物。

核糖体展示是一种无细胞展示技术，其使用参与蛋白合成的体外细胞组分，建立含数十亿不同人抗体片段的文库，又可由该文库快速地分离针对目标分子的抗体。

核糖体展示技术还可用于鉴别靶分子如csPCNA的抗体。该技术基于稳定的抗体-核糖体-mRNA复合物的形成，与噬菌体展示具有相似性，因为抗体蛋白与其编码DNA序列直接连接。拷贝由人细胞提取的抗体基因文库，并通过标准PCR扩增。在转录后，mRNA分子群各自编码不同的抗体基因。mRNA分子然后与基于裂解物的核糖体温育(细菌来源的核糖体及其蛋白生产机器)，核糖体将mRNA翻译成蛋白复合物一一核糖体展示文库。各自展示不同抗体的这种复合物与靶抗原性肽混合，例如来源于csPCNA同种型的肽，对所述靶特异性的抗体结合靶，未结合物被洗除。

一抗(如csPCNA抗体)或二抗与针对其Fc区的染料或酶标记的二抗Fab片段的复合或缀合属于本文公开内容的范围。多种标记可用于偶联或缀合至一抗或二抗，包括但不限于氨基甲基香豆素(AMCA)、荧光素(FITC)、荧光素(DTAF)、罗丹明(TRITC)、TexasRed^TM、Cy2^TM、Cy3^TM、Cy5^TM、Cy7^TM、R-藻红蛋白(RPE)、B-藻红蛋白(BPE)、C-藻青蛋白、R-藻青蛋白。对于辣根过氧化物酶(HRP)-3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，红色)和二氨基联苯胺(DAB，褐色)；对于碱性磷酸酶(AP)-Fast red(粉色)、溴氯吲哚磷酸盐(BCIP，黄色)、碘硝基四唑紫(INT)(红棕色)、氮蓝四唑(NBT，紫色)、New Fuchsin(红色)、TNBT(紫色)和Vega red(粉色)。可与抗体结合的任意可检测标记都适于和csPCNA特异性抗体一起使用。

实施例

提供以下的实施例仅是为了解释目的，无意限制上文广义上已描述的公开内容。

实施例1：csPCNA特异性抗体的生产

该实施例阐述了仅结合csPCNA但不结合nmPCNA的肽特异性抗体的生产。

人csPCNA和nmPCNA同种型具有相同的氨基酸序列，该序列在本文标识为SEQ ID NO：3。如图1中的序列所示，csPCNA或nmPCNA包含261个氨基酸残基。

本文公开的PCNA免疫原可为肽，其具有的氨基酸序列选自跨越SEQ ID NO：3的氨基酸残基75-150的区域。PCNA氨基酸序列可包括诸如插入、缺失、置换的突变，其不影响csPCNA抗体结合的特异性。PCNA或csPCNA的肽或片段与PCNA中连续或不连续的短序列相关。所述肽可包含至少含PCNA的Leu126至Tyr133的序列或SEQ ID NO：1(LeuGlyIleProGluGlnGluTyr)的氨基酸序列。还可加入额外的氨基酸，用于增加免疫原性或抗原性，而不显著影响特异性。例如，可实施保守氨基酸置换，而不改变特异性。基于本文提供的指引，还可制备合成肽，以产生对csPCNA同种型特异性的抗体。生产肽的任意合适方法都可用于生产本文公开的免疫原。

实施例1A：肽特异性抗体

制备两种合成肽，其具有鉴别为SEQ ID NO：2(CysGlyGlyGlyLeuGlyIleProGluGlnGluTyr)的序列，第二种肽具有鉴别为SEQ ID NO：5(CysAspValGluGlnLeuGlyIleProGluGhnGluTyr)的序列。SEQ ID NO：5包含PCNA的一部分免疫显性区(AspValGluGln)。两种合成肽用于使用本领域已知的方法在兔中产生多克隆抗体。获得的抗体鉴别为Ab126(由SEQ D NO：1产生)和Ab121(由SEQ IDNO：5产生)。

实施蛋白质印迹分析，以评价抗体特异性识别csPCNA的能力。通过2D-PAGE解析由MCF-7乳癌细胞系和PA-1卵巢癌细胞系的高速上清液(S3)制备的蛋白样品。然后使用Ab126、Ab121或PC 10(一种市售抗-PCNA抗体)进行已解析多肽的蛋白质印迹分析。如在图2中所示，PC 10抗体同其它市售PCNA抗体一样，既识别存在于非恶性细胞中的碱性同种型nmPCNA，也识别特有地存在于癌细胞中的酸性同种型csPCNA。要指出的是，用于本实验的两种癌细胞系MCF-7(图2A)和PA-I(图2B)都产生可检测的nmPCNA。市售抗体的非特异性结合特性使它们不能分辨恶性和非恶性细胞。抗体的对比性研究表明了Ab126抗体在乳癌细胞和卵巢癌蛋白这二者的蛋白质印迹中特异性识别csPCNA的能力。但是，使用Ab121的蛋白质印迹未显示出对csPCNA的特异性。同PC 10抗体一样，Ab121既识别csPCNA，也识别nmPCNA同种型。因此，出乎意料的是，含一部分PCNA免疫显性区的肽产生非特异性抗体，而不含任何部分的PCNA免疫显性区的肽产生csPCNA特异性抗体。

使用上述肽制备单克隆抗体。可使用传统的单克隆抗体生产方法以及使用HuCal GOLD重组抗体文库和噬菌体展示技术的方法，以鉴别人抗-csPCNA抗体。获得的单克隆抗体应当也特异性地仅识别csPCNA同种型。

实施例1B.AB126抗体特异性识别在培养物中生长的癌细胞

实施两种不同类型的细胞染色分析，以评价Ab126抗体(后文可称为csPCNAab)是否能辨别恶性和非恶性乳腺肿瘤细胞。结果表明，Ab126抗体对癌细胞具有高特异性，用作恶性肿瘤的早期检测剂。使用Ab126抗体实施免疫荧光细胞染色实验(图3)。使用非恶性人乳腺上皮细胞(HME)和用端粒酶基因(HME50hTERT)永生化的非恶性HME细胞。HME和HME50hTERT细胞均不具有在裸鼠中产生肿瘤的能力。另外，使用来源于乳癌(HME肿瘤)患者的恶性HME细胞以及恶性MCF-7细胞。这些不同的细胞类型用绿色荧光标记的抗-PCNA(PC 10)抗体和红色标记的Ab126染色。PC 10和任意其它市售的PCNA抗体或Ab121均不能用于辨别非恶性人细胞与恶性人细胞，因为所有这些抗体都针对PCNA分子中的免疫显性区制备，而Ab126或csPCNAab针对远离免疫显性区的PCNA区制备。由图3可见，标记的PC 10抗体容易染色恶性和非恶性的所有不同检验细胞类型。但是，特异性地针对csPCNA制备的标记Ab126不染色非恶性细胞，但能够容易地检测癌细胞。非恶性细胞的DAPI染色染色这些细胞的细胞核，的确表明在视野中存在细胞，用PC-10染色表明在这些正常细胞中存在PCNA，其不是PCNA的癌症特异性同种型。该实施例表明，Ab126特异性检测癌细胞，并由此支持csPCNA是恶性肿瘤标记这一前提。

实施例1C.AB126抗体识别早期癌细胞

该实施例表明，Ab126抗体识别早期癌细胞，用于更快速的诊断。非恶性HME50hTERT细胞以及恶性HME-肿瘤和MCF-7细胞用于免疫荧光染色实验。另外还评价用端粒酶、cdk4和Ras转染的HME细胞(HME5+cdk4、hTERT+Ras)。当导入小鼠中时，这些细胞产生肿瘤，但仅在长时间之后。一般认为，它们可代表非常早转化的细胞。在该实验中，如图4所示，所有细胞类型都用DAPI染色，以表明在每个放大视野中的细胞存在情况。标记的PC10抗体染色所有不同的细胞类型。但是，癌症特异性的Ab126抗体不标记非恶性细胞，但确实容易标记恶性细胞。另外，Ab126抗体标记HME5+cdk4+hTERT+Ras细胞，表明在早期转化细胞中存在csPCNA。

实施例1D.AB126抗体特异性识别组织中的癌细胞

石蜡包埋的恶性和非恶性乳腺组织标本的免疫组织化学染色也用Ab126抗体进行。结果示于图5(图A和B)。结果表明了所述抗体仅特异性识别仅存在于图B的癌细胞的能力。两幅图中的细胞还用苏木精和曙红(H&E)染色复染，以鉴别细胞核。用Ab126抗体染色的细胞以褐色呈现(图B)。

该实施例表明，按照本文公开的方法生产的Ab126或其它抗体可用于特异性地鉴别csPCNA同种型，csPCNA同种型是恶性肿瘤的真实标记。因此，Ab126抗体等用于监测待治疗个体的癌症的症状缓解状况。Ab126等是开发筛选用途的ELISA和免疫组织化学测定的有用试剂。另外，Ab126等用于通过鉴别个体的体液或细胞或组织中的恶性肿瘤潜力来鉴别早期癌症个体。所述抗体还通过放射性或荧光标记抗体并使其与肿瘤细胞释放在肿瘤附近的csPCNA反应，用于鉴别肿瘤位置。Ab126等是一组抗体的有用成员，该组抗体能够识别当前用于评价肿瘤的恶性肿瘤潜力的标记。

实施例2：csPCNA特异性抗体识别恶性乳癌细胞

该实施例表明，抗csPCNA抗体选择性识别乳癌细胞与正常细胞。使用来源于PCNA的氨基酸序列，与商业抗体销售商(Zymed，Inc.，San Francisco，CA)订立合约来生产csPCNA特异性抗体。生产选择性识别csPCNA同种型而不识别nmPCNA同种型的兔多克隆抗体。csPCNA特异性抗体的此特异性通过人乳腺细胞系和人肿瘤/正常组织的蛋白质印迹、免疫荧光染色以及基于DAB的免疫组织化学染色(IHC)证实。动物免疫使用偶联至匙孔血蓝蛋白的PCNA肽片段，匙孔血蓝蛋白通过4个半胱氨酸加至所述肽的氨基末端部分。将100μgKLH缀合的肽片段(选自跨越PCNA的氨基酸100-160的区域)重悬浮在完全弗氏佐剂中，并皮下注射入2只雌性新西兰白兔的多个部位中。让兔休息1个月，然后用第二剂在不完全佐剂中的100μg KLH偶联抗原加强免疫动物。针对抗原的抗体滴度在免疫后约10-14天通过ELISA实验来测定，在另外的14天休息期后，动物接受KLH偶联抗原的第二次强化。12天后，由各只兔收集25ml抗血清，并储存于-20℃。抗血清对更换两次的20mM磷酸缓冲盐水，pH 7.0透析，并加样至用相同缓冲盐水预平衡的G蛋白Sepharose柱。凝胶的结合能力是19mg兔IgG/ml填装胶床。柱用10倍柱体积的PBS清洗，并用10倍体积的0.1M甘氨酸缓冲液，pH 3.0洗脱。由柱洗脱出来的1ml级分以1-2ml/分钟的流速收集入0.25ml的0.25M Tris-HCl pH8.0中。通过Bradford实验测定由柱洗脱的含蛋白峰级分中的蛋白浓度，合并这些级分，并对含10mM NaN₃的磷酸缓冲盐水透析，然后储存于4℃，直至用于各种实验。然后使用市售抗PCNA PC10抗体或兔多克隆抗体进行已解析多肽的蛋白质印迹分析(图6)。和市售PCNA抗体一样，PC10抗体既识别存在于非恶性细胞中的PCNA碱性同种型(nmPCNA)，也识别特有地存在于乳癌细胞中的PCNA酸性同种型(csPCNA)。在癌细胞提取物的2D-PAGE蛋白质印迹分析中，csPCNA抗体特异性识别csPCNA同种型。

实施例2A：使用csPCNAab对比选择性分析乳癌组织标本

使用市售抗体或csPCNAab通过蛋白质印迹分析一组正常乳腺组织和乳癌组织标本的PCNA存在情况(图7)。市售抗体包括：针对PCNA C末端的抗体C20和针对完整大鼠PCNA蛋白制备的PC10。市售抗体识别存在于正常或恶性乳腺组织中的PCNA。但是，csPCNAab抗体仅检测恶性组织中的PCNA存在情况。csPCNAab的这种能力归因于csPCNA在恶性细胞中表达而不在正常细胞中表达。csPCNA同种型抗体的特异性在实验中得到进一步证实，在该实验中，增加浓度的市售PC10抗体或csPCNAab在非恶性和恶性组织提取物的蛋白质印迹分析中用于检测PCNA(图8)。该实验的结果表明，在蛋白质分析中csPCNAab浓度即便很高，抗体也仅检测癌组织中的csPCNA存在情况。然而，PC10抗体在所有浓度都容易检测恶性和非恶性乳腺组织中的PCNA蛋白。

实施例2C：csPCNAab特异性检测培养物和组织中的乳癌细胞

进行免疫荧光分析，以评价csPCNAab是否能辨别细胞培养物和组织标本中的恶性和非恶性乳腺细胞。结果表明，抗体对癌细胞具有高特异性(图9-10)。检验csPCNAab染色培养物中生长的非恶性和恶性乳腺细胞的能力(图9)。在该实验中，所有的不同细胞类型都用DAPI染色，以证实在各个放大视野中的细胞存在情况。检验的细胞是正常人乳腺上皮细胞(HMEC)和非致瘤性的自发永生化HMEC。还评价了携带p53突变并已用人端粒酶催化组分(hTERT)和Ras癌基因(H-Ras-V12)转染的转化HMEC。另外，由在无胸腺小鼠中生长的肿瘤培养的转化HMEC以及MCF-7细胞用作图9中的乳腺肿瘤细胞。由图9可见，市售PC10抗体容易染色检验的所有不同细胞类型，(即恶性的和非恶性的)。PC10抗体已广泛地用于定量PCNA表达。与市售抗体不同，选择性识别csPCNA的csPCNAab不染色非恶性细胞，但能够容易地检测乳癌细胞。非恶性细胞的DAPI染色显示了视野中的细胞存在情况。在用csPCNAab染色的非恶性肿瘤培养物中观察到的少量大红色荧光“斑点”，这缘于与碎片的非特异性结合，因为在用绿色标记的PC10抗体染色的培养物中的相同位置观察到这些“斑点”。该实验表明，csPCNAab特异性检测培养的乳癌细胞。

在另一个实施方案中，还通过使用市售抗体和csPCNAab抗体的对比性免疫荧光染色评价新鲜冷冻的非恶性和恶性乳腺组织标本(图10)。在该研究中，评价市售PC10、C20和100-478(Novus)抗体。如图10中所示，所有市售抗体都容易染色非恶性和恶性乳腺组织。与PC10、C20和478抗体相反，csPCNAab仅染色恶性乳腺组织。使用在培养物中生长的细胞以及人组织的这些实验表明，csPCNAab仅特异性检测乳癌细胞，并提供了csPCNA是乳腺恶性肿瘤的真正标记的支持。

实施例3.针对csPCNA抗原性肽的鼠多克隆和单克隆抗体的产生

用100μg缀合KLH的csPCNA肽片段免疫两种小鼠品系(3只小鼠/品系)。使用来源于csPCNA的肽片段，其包含人PCNA蛋白的氨基酸位置126-133，SEQ ID NO：1(LeuGlyIleProGluGlnGluTyr)。使小鼠休息，在免疫后12天进行检验取血，以测定小鼠是否对肽产生免疫应答。通过使用偶联至ELISA板的抗原性肽的ELISA测定确定针对csPCNA肽的抗体生产。将小鼠抗血清的稀释液与固定化肽温育，并在与缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗鼠IgG抗体温育后定量捕获的抗-csPCNA抗体。所有小鼠都休息30天，在抗体滴度降至基线附近后，用第二剂csPCNA肽加强免疫小鼠。重复该过程3次，在定量针对csPCNA肽的免疫应答后，由具有最大免疫应答的小鼠中取出脾脏(图12)，将脾细胞融合至NS-0骨髓瘤细胞。鼠抗血清不结合随机肽序列，csPCNA的不同免疫显性区的肽周作筛选过程中的对照，并产生基线吸光度值，该值未显示在直方图上(图12)。在HAT培养基中选择杂交瘤。对HAT选择存活的杂交瘤进行针对csPCNA肽的抗体生产的筛选，选择生产抗csPCNA抗体的29个克隆。这些克隆在HAT培养基中再持续2周，通过ELISA再选择15个克隆，并鉴别为稳定的抗体生产细胞系。这些细胞系通过有限稀释亚克隆，选择生产csPCNA抗体的克隆，培养至高密度，制备亲和纯化的抗csPCNA抗体，在2D-PAGE解析PCNA同种型和IHC分析后用于蛋白质印迹；证实对csPCNA的特异性。这些亲和纯化的单克隆抗体有5种用于检测生物样品中的恶性细胞。

实施例4：石蜡包埋的乳腺组织标本的免疫组织化学(IHC)染色

该实施例表明，本文公开的csPCNA特异性抗体和方法检测包埋组织标本中的恶性细胞。还用csPCNAab进行石蜡包埋乳腺组织标本的免疫组织化学染色。检验的组织是在缩乳术后获得的非恶性组织以及原位管癌(DCIS)患者的组织，原位管癌是一种前癌疾病，特征在于乳腺管衬层中的恶性样细胞的克隆增殖，没有扩散到管外部至乳腺中的其它组织或乳腺外的证据。DCIS是侵入性或转移性疾病的前体。显示了代表性结果(图11)。这些结果表明，csPCNAab特异性地识别癌细胞核中的表位，并检测早期(DCIS)疾病。csPCNA表达在正常乳腺小叶中未观察到。

在一个方面，阳性对照载玻片包括已知侵入性乳腺肿瘤中心区的双份切片以及用作阴性对照的空白石蜡切片。简单地讲，将5μm组织标本的石蜡切片固定至带正电荷的载玻片，并在二甲苯(更换3次)中去除石蜡，然后用分级乙醇和蒸馏水水合。使用微波炉在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行10分钟的抗原修复，随后冷却20分钟。此后用Peroxo-block(Zymed)封闭内源过氧化物酶活性。在用磷酸缓冲盐水(PBS)淋洗载玻片后，将载玻片与生物素化csPCNAab(稀释度1∶400)或市售的生物素化PC10抗体(BioScience，稀释度1∶250)温育1小时。通过使缀合过氧化物酶的抗生物素蛋白(Zymed PicturePlus^TM Kit：HRP/Fab聚合物缀合物，Invitrogen，Carlsbad，CA)结合至生物素化一抗，并使抗体-过氧化物酶复合物与二氨基联苯胺(DABplus，Dako，Carpinteria，CA)反应，显现抗原-抗体反应。载玻片用苏木精(Vector Labs)复染，用乙醇和二甲苯澄清，用Histomount^TM(Zymed，Invitrogen，Carlsbad，CA)封片，然后观察。以磷酸缓冲盐水(PBS)或同种型特异性对照抗体替换csPCNAab一抗或PC10抗体也用作阴性对照。组合的H&E染色用于确定细胞结构并鉴别各个组织切片中的细胞核，提供了一种在组织病理学评价中确定恶性肿瘤的存在情况的标准方法。在用csPCNAab或PC10抗体IHC染色石蜡包埋的标本后将H&E应用于组织切片。

如本文所述进行IHC评价和记分。在用PC10和csPCNAab抗体完成病理标本和组织阵列的染色和反应性初始记分后，独立地评价染色的载玻片，以证实染色结果。筛选每种组织学切片，并评价展示免疫染色的正常和瘤细胞核的百分率。对csPCNAab的免疫反应性分类为阴性、低、中或高，条件分别是＜2％、2-20％、21-70％或71-100％的细胞核被阳性染色。这些选定的免疫反应性范围值与采用其它乳癌生物标记的临床病理评价所使用的范围值一致。除了本文描述的记分方法以外，任意合适的记分方法都可使用。计数每个标本的10个未重叠高倍显微镜视野，当csPCNAab染色至少2％的细胞核时将标本归类为乳癌。如果需要达到一致的话，则可再评价分析结果。预期使用DAB作为底物用csPCNAab和PC10抗体将增殖恶性细胞染成褐色。预期正常组织标本不与csPCNAab反应，由于H&E染色而仍保持蓝色/紫色，但正常组织中的增殖细胞应仅在用PC10抗体探测时染成褐色，与其增殖速率无关(图9-10)。

实施例4A：恶性乳癌细胞的临床诊断

免疫荧光细胞和组织染色用于表明csPCNAab选择性结合乳癌细胞的能力，所述乳癌细胞在培养物中生长(图9)，或存在于恶性组织中(图10)。恶性乳癌的临床诊断也通过使用csPCNA特异性抗体的癌组织免疫组织化学染色进行。

对商业阵列来源的组织阵列载玻片和由组织标本制备的个体载玻片结合csPCNAab和/或PC10抗体的能力进行分析。将切成3-5μm切片的石蜡包埋组织在二甲苯中温育2次，每次10分钟，以去除石蜡。用连续乙醇清洗液(100-90-80-70-0％的dH₂O溶液)各自再水合载玻片10分钟。使用抗原暴露液(Vector Laboratories，Burlingame，CA)按照说明书进行抗原修复。然后将载玻片置于封闭缓冲液(3％BSA的PBS溶液)中于室温达30-60分钟。将在封闭缓冲液中1∶200稀释度的小鼠抗PCNA(PC10)抗体(识别所有的PCNA同种型)或兔csPCNAab直接置于组织上，用石蜡覆盖，并在湿润室中于室温温育60分钟。在用PBS进行3次5分钟清洗后，将载玻片与在封闭缓冲液中1∶600稀释度的适宜荧光二抗(Alexa 468(绿色荧光)(Calbiochem，San Diego，CA)抗小鼠IgG或Alexa 568(红色荧光)抗兔IgG；(Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA))温育，用石蜡覆盖，并置于暗处的湿润室中于室温达30-60分钟。用PBS进行另一个连续的3次5分钟清洗，用含DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Burlingame，CA)封装载玻片。组织切片使用具有20X(和40X)物镜的Leica荧光显微镜检验。DAPI用作复染剂。在增殖的正常和恶性乳腺细胞与csPCNA和PC10抗体温育后，评价Alexa 468和Alexa 568抗体与这些细胞的结合。Leica荧光显微镜配有红色-绿色滤光片，以能够辨别一种或两种抗体是否结合至相同的乳腺细胞。筛选各个组织切片，并评价展示出红色或绿色免疫荧光的正常和瘤细胞核的百分率。对csPCNAab的免疫反应性分类为阴性、低、中或高，条件分别是＜2％、2-20％、21-70％或71-100％的细胞核发红色荧光。IHC记分和评价如本文所述进行。正常组织标本仅发绿色荧光，因为其仅能与PC10抗体反应，而恶性细胞表达两种PCNA同种型，参与合PC10和csPCNAab这二者的反应。另外，预期正常组织标本中缓慢和快速增殖的细胞仅结合PC10抗体(图9-10)。使用csPCNA特异性抗体分析检测csPCNA同种型不受与抗体结合的特定标记的限制。例如，免疫荧光染色比DAB染色更灵敏，因为免疫荧光标记的连续组织切片的数字图象可彼此重叠，对于每个分析组织标本，很容易证实红色和绿色染色细胞的共定位，预期该共定位选择性指示分析的癌症标本中仅恶性细胞的存在情况。仅在乳腺肿瘤标本中存在红色荧光证实了csPCNAab对恶性乳腺细胞的选择性。

在培养物中生长或存在于正常组织中的增殖非恶性乳腺细胞不表达csPCNA，因此不与csPCNAab反应。相反，它们确实与非选择性PC10抗体反应。

本文公开的抗体组合物和方法还检测各种乳腺肿瘤类型，包括管囊肿、顶泌腺化生、硬化性腺病、管上皮细胞增生、非典型管内乳头瘤病、柱状细胞改变、放射状硬化病(放射状瘢痕)、乳头腺瘤、管内乳头瘤、纤维腺瘤、乳腺乳头瘤、非典型管上皮细胞增生、非典型小叶增生、原位管癌一再分类为核级1、2和3、原位小叶癌、原位多形性小叶癌、乳腺内脂瘤、乳腺错构瘤、粒细胞瘤、乳腺内脂肪坏死、假血管瘤样间质增生(PASH)、涉及乳腺的恶性黑素瘤、涉及乳腺的恶性淋巴瘤、叶状瘤一良性、临界和恶性亚型以及乳腺肉瘤。

乳癌已与各种生物标记连锁，这些生物标记包括表达改变的p53、ER、PR、细胞周期蛋白、B72.3、α-乳清蛋白、乳脂肪球、乳腺珠蛋白、Maspin和HER2。但是，不是所有的乳癌都同时或以相同水平表现出所有这些生物标记的表达改变。还可运用csPCNA和任何其它预后/诊断因子Ki67、p53、ER、PR、B72.3、α-乳清蛋白、乳脂肪球、乳腺珠蛋白、Maspin和HER2的表达状态。csPCNAab或其它生物标记的市售一抗以及其它生物标记的适宜二抗用于评价csPCNA表达与其它乳癌生物标记的关联。csPCNA同种型的单克隆抗体也用于检测和诊断乳癌组织。如果需要获得优化的灵敏度，则调整抗原-抗体结合条件。

实施例4C：确定csPCNAab的灵敏度和特异性的统计学方法

开始使用合适的统计方法进行免疫组织化学(IHC)数据的分析(参见S.C.Chuah等，2005，Pathology 37(2)：169-171页)，用于计算csPCNAab检测组织标本中的恶性乳腺细胞的灵敏度和特异性。除了csPCNAab的这些特征之外，使用csPCNAab将恶性和非恶性乳腺细胞彼此区分开来的阳性(PPV)和阴性(NPV)预测值使用以下公式确定。[灵敏度＝a/(a+c)；特异性＝d/(b+c)；PPV＝[a/(a+b)]×100；而NPV＝[d/(c+d)]×100；其中a＝真阳性，b＝假阳性，c＝假阴性，而d＝真阴性]。个体标本的真/假阳性和真/假阴性染色在染色组织切片的目测检查当中由病理学家确认。开始还通过卡方检验分析IHC数据，并对使用本文描述的IHC分级系统获得的数据进行分析(参见HBrustmann，2005，Gynecologic Oncology 98：396-402)。对数据进行单变量分析，评价csPCNAab区分恶性和非恶性乳腺标本的能力。使用GraphPad Prism 4和StatMate统计分析软件(GraphPad，San Diego，CA)分析用正常乳腺组织标本和良性乳腺病灶获得的数据，以便定量csPCNAab选择性和特异性地鉴别患者组织标本中的恶性乳腺细胞的能力。当csPCNAab用于鉴别人乳腺活检物质中的恶性乳腺细胞的存在情况时，该抗体应提供≥90％的选择性和＞95％的置信水平。csPCNAab甚至与分类为I期疾病的组织标本强反应。还用本文公开的csPCNAab评价了乳癌病灶的不同亚类。

实施例5.csPCNA特异性肽设计和特异性针对csPCNA的抗体的产生

市售PCNA抗体的表位作图表明，大部分抗体结合在PCNA蛋白大约中部的40个氨基酸(aa)段中(aa85-125)。该区域代表PCNA多肽中的免疫显性区。兔多克隆抗体由供应商(Zymed Inc，San Francisco，CA)制备为包含连接物间结构域的PCNA肽片段(aal18-135)(表1)，这有利于PCNA的蛋白-蛋白相互作用。每种肽都偶联至匙孔血蓝蛋白(KLH)，匙孔血蓝蛋白通过4个半胱氨酸残基加至每个肽的氨基末端部分。将100μg的每种KLH缀合肽片段重悬浮在完全弗氏佐剂中，并将每种肽皮下注射入2只雌性新西兰白兔的多个部位中。让兔休息1个月，然后用第二剂在不完全佐剂中的100μg的KLH偶联抗原加强免疫动物。针对抗原的抗体滴度在免疫后约10-14天通过ELISA实验来测定，在另外的14天休息期后，动物接受第二次KLH偶联抗原的加强。12天后，由各只兔收集25ml抗血清，并储存于-20℃。抗血清对更换两次的20mM磷酸缓冲盐水，pH 7.0透析，并加样至用相同缓冲盐水预平衡的G蛋白Sepharose柱上。由柱洗脱出来的1ml级分收集入0.25ml的0.25M Tris-HCl pH 8.0中。合并含抗体的级分，透析并储存于4℃，直至用于各种实验。进行蛋白质印迹分析，以评价各种抗体特异性识别csPCNA的能力。MCF7乳癌细胞提取物通过2D-PAGE解析。然后使用不同的多克隆抗体或市售PC10抗体进行解析多肽的蛋白质印迹分析(图13)。PC10抗体同所有市售PCNA抗体一样，既识别存在于非恶性细胞中的碱性同种型nmPCNA(nmPCNA)，也识别特有地存在于乳癌细胞中的酸性同种型csPCNA(csPCNA)。所有抗体的对比性研究表明了其中仅一种抗体(针对PCNA肽aa126-133制备的抗体)在癌细胞提取物的2D-PAGE蛋白质印迹分析中唯一识别csPCNA的能力。数据表明针对完整连接物间结构域(aa118-135)产生的抗体识别csPCNA和nmPCNA这二者。另外，针对PCNA aa121-133产生的抗体结合csPCNA和nmPCNA这二者。数据还提示，csPCNA抗原性位点位于PCNA aa122-142之间的某处。针对PCNA aa126-133产生的抗体(特异性识别csPCNA的抗体)已被称为csPCNAab。另外，肽#126-133已成功地用于在4只另外的新西兰白兔中和2种不同的小鼠品系中产生csPCNA特异性抗体。

表1：用于产生兔多克隆抗体的PCNA肽序列。(使用的肽标以下划线)。

PCNA序列111-125
PCNA序列111-125	LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPEQEYSCVVKMPSGEFARICRD LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNIKLSQTSNVDK EEEAVTIEMN
PCNA序列118-135
PCNA序列118-135	LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPEQEYSCVVKMPSGEFARICRD LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNIKLSQTSNVDK EEEAVTIEMN
PCNA序列121-133
PCNA序列121-133	LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPEQEYSCVVKMPSGEFARICRD LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNIKLSQTSNVDK EEEAVTIEMN
PCNA序列126-133
PCNA序列126-133	IVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPEQEYSCVVKMPSGEFARICRD LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNIKLSQTSNVDK EEEAVTIEMN
PCNA序列126-143
PCNA序列126-143	LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPEQEYSCVVKMPSGEFARICRD LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNIKLSQTSNVDK EEEAVTIEMN
PCNA序列126-153
PCNA序列126-153	LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPEQEYSCVVKMPSGEFARICRD LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNIKLSQTSNVDK EEEAVTIEMN
PCNA序列126-163
PCNA序列126-163	LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPEQEYSCVVKMPSGEFARICRD LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNIKLSQTSNVDK EEEAVTIEMN

实施例5A.抗体对csPCNA的特异性

该实施例表明了所述抗体对csPCNA的特异性。进行直接ELISA测定，其中使抗原性肽和纯化的csPCNA作为抗PCNA抗体(“Ab126抗体”)结合的靶彼此竞争。如果抗体对csPCNA使特异性的，则预期以足够的浓度用于产生该抗体的肽与纯化的csPCNA有效竞争结合实验中投入的Ab126抗体。

如下进行实验：将0.1μg重组PCNA固定至偶联缓冲液(碳酸盐缓冲液，pH 9.6)中的ELISA板，然后与在偶联缓冲液中的1％牛血清白蛋白温育1小时，以封闭每个孔中余下的残余结合位点。然后，将一系列浓度(0.024ng/孔-2400ng/孔)的抗原性肽(UMPB6-相当于PCNA氨基酸126-133)在冰上与Ab126抗体混合，并置于每个孔中于室温振摇1小时。此一抗通过用PBS-0.05％Tween 20清洗去除，将缀合至碱性磷酸酶的抗兔IgG二抗加至每个孔。这些孔用PBS清洗，将在反应缓冲液中的100μl磷酸对硝基苯酚(1mg/ml)温育20分钟，以水解底物，然后于405nm波长读取反应混合物的光密度。

示于图15A的结果表明了所述肽抑制Ab126抗体与固定在ELISA板上的csPCNA结合的能力，该能力随增加的肽浓度而变化，表观IC50稍微超过0.1μg/ml。该数据表明了Ab126抗体对所述蛋白的csPCNA同种型的特异性。

实施例5B：AB126抗体在夹心ELISA中的特异性

该实施例表明了本文公开的抗体在夹心ELISA中对csPCNA的特异性。实施夹心ELISA，其中csPCNA特异性Ab126抗体(1μg/孔)或非特异性PCNA抗体C20(1μg/孔)固定至ELISA板，并用于捕获测定中使用的重组PCNA。ELISA板上残余的结合位点周BSA封闭，在一系列浓度的竞争性肽(UNPB6-(0.024ng/孔-2400ng/孔))存在下将重组PCNA与固定化捕获抗体温育。在洗去未结合的PCNA后，在第一种情况下用C20抗体检测结合蛋白，在第二种情况下用Ab126检测结合蛋白。将这些检测抗体加入ELISA板的每个孔。将缀合适宜碱性磷酸酶的抗兔或抗山羊IgG二抗与ELISA板的每个孔中的结合抗体温育，并在用PBS-0.05％Tween 20洗去非特异性结合的结合抗体后，通过将每个孔中剩余的二抗与1mg/ml磷酸对硝基苯酚温育30分钟确定结合捕获PCNA的检测抗体的量。

示于图15B的结果表明，当使用特异性捕获抗体(Ab126-菱形)捕获测定中加入的重组PCNA中存在的csPCNA同种型时，UMPB6肽有效竞争捕获抗体；在该类型测定中的表观IC50稍微高于1μg/孔。相反，UMPB6对C20抗体(粉色方块)捕获重组PCNA的能力没有可检测的影响。这可能归因于以下事实：非同种型特异性C20抗体的结合位点未将UMPB6肽识别为其靶表位。两种抗体之间结合量的整体差异可能由两种抗体对重组PCNA蛋白的亲和性差异引起，或者是重组蛋白中PCNA分子混合物(包括重组蛋白的csPCNA和非csPCNA同种型)的结果。

实施例5C.针对csPCNA的ELISA的灵敏度

该实施例表明了本文公开的csPCNA特异性抗体的灵敏度。ELISA测定的灵敏度通过检测该测定在一系列浓度范围内检测csPCNA的能力来确定。如上文概述使用非特异性抗PCNA抗体(C20抗体)进行夹心ELISA，以捕获在测定中使用的纯化重组PCNA中存在的csPCNA同种型。使用Ab126抗体特异性地显现结合抗体，以检测结合C20抗体的csPCNA的存在情况。缀合至碱性磷酸酶的抗兔IgG用于鉴别结合至捕获csPCNA的Ab126抗体的存在情况。如图15C所示，所述测定检测跨越3-200ng/孔的浓度范围内的csPCNA。

实施例5D.癌细胞提取物中csPCNA的检测

该实施例表明了csPCNA特异性抗体检测癌细胞提取物中的csPCNA同种型的能力。业已表明卵巢癌细胞(包括PA-1细胞系)表达csPCNA同种型。使用本文描述的夹心ELISA，温育由PA-1细胞制备的浓度渐增的核提取物，表明在跨越0-100μg/孔的核提取物浓度范围内，检测提取物中的csPCNA存在情况。如图16所示，csPCNA检测在使用Ab126抗体检验的蛋白范围内是线性的。PA-1细胞表达的PCNA由固定至ELISA孔的C20抗体捕获。

实施例6：csPCNA参与DNA复制和与POLδ相互作用

PCNA是合成体的一种功能组分。另外，合成体对DNA polα和δ抑制剂、polα抗体的功能响应以及对PCNA的需要提示，合成体的体外复制活性由polα和δ这二者介导。现在为确定csPCNA实际上是否在乳癌细胞DNA复制中起作用和与其polδ一起发挥作用，在有和没有csPCNAab的情况下，使用MCF7细胞提取物进行DNA polδ和体外SV40 DNA复制测定(表2)。观察到csPCNAab在乳癌细胞提取物中抑制DNA polδ和体外SV40DNA复制活性。加入牛血清白蛋白(BSA)，以控制反应，没有观察到抑制作用。这些结果表明，csPCNA可积极地参与乳癌细胞DNA复制，并容易与DNA polδ一起发挥作用。

表2.增加csPCNAab浓度对体外SV40DNA复制和DNA polδ活性的作用

csPCNAab浓度(μg)	％抑制
	％抑制		体外SV40DNA复制^*	DNA polδ^**
	0.1	29	体外SV40DNA复制^*	DNA polδ^**	N/D#
2.0	0.1	29	40	34	N/D#
2.0	5.0	N/D	40	34	57
10.0	5.0	N/D	48	63	57

在反应开始前，将合成体组分与浓度渐增的csPCNAab于4℃温育1小时。数据代表3个独立实验的平均值。#，未测定。*，SV40DNA复制实验，DNA聚合酶实验按照公开的方法实施(Malkas，L H.等，(1990)，Biochem.29：6362-6374；Waleed等，(2004)，BiochemicalPharmacology 68：11-21；和Han等，(2000)，Biochemical Pharmacology60：403-411)。

结果表明，csPCNA特异性抗体可选择性抑制DNA复制，并用作抑制癌细胞复制的治疗工具。csPCNA特异性抗体还影响csPCNA同种型的蛋白-蛋白相互作用，并由此影响癌细胞复制途径。

实施例7：csPCNA的自身抗体

该实施例表明了csPCNA同种型的自身抗体作为检测循环性csPCNA同种型以及诊断早期和晚期癌症的工具的用途。

实验设计包括用含csPCNA同种型的重组PCNA包被酶联免疫吸附测定(ELISA)板，用BSA封闭ELISA孔，并使包被的孔与IV期患者的人血清温育。将患者分为两组。一组包含在入选实验后存活少于200天的个体，而另一组在入选后存活超过1300天。然后用PBS清洗孔，并与缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗人抗体温育。如果针对PCNA的循环抗体存在于患者血清标本中，则这些抗PCNA抗体应与结合至板的PCNA结合，并在清洗步骤后保留在板上。预期抗人二抗应结合孔(含表达抗PCNA抗体的患者的血清)中的抗体。抗人抗体的存在应由磷酸对硝基苯酚底物转变为黄色产物指示。产物的丰度通过检测其405nm的吸光度来确定。结果表明，其中一个长期存活者具有可观的自由循环抗PCNA抗体量，而一名短期存活者产生少量的该相同类型的抗体。各组的1名患者具有不可检测水平的抗PCNA抗体，该抗体看起来与长期或短期存活无关联。图14显示了原始数据、对照以及实验值减去来源于对照的背景。本文概述了用于自身抗体的ELISA法。简单地讲，ELISA板用0.2μgPCNA包被，用偶联缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液pH 9.6；10mM NaN₃)使体积达到100μl，于37℃振摇板2小时。PCNA的浓度为约0.250μg/μl。200μl封闭缓冲液(1X PBS，pH 7.4；1％BSA；0.05％Tween 20)用于在37℃封闭未结合位点1小时。用清洗缓冲液(1X PBS，pH 7.4；0.05％Tween 20)进行3次清洗。加入50μl人血清(IV期乳癌患者)，于37℃温育1小时。去除初始血清，代之以50μl新鲜血清，并于37℃温育1小时。然后用清洗缓冲液清洗板3次。在清洗后，加入100μl的二抗抗人AP(1∶1000)，将板于37℃温育1小时。用清洗缓冲液进行3次清洗。为了显色，加入100μl的1mg/ml磷酸对硝基苯酚(pNPP)(在10mM二乙醇胺，pH 9.0；0.5mM MgCl₂中)，根据显色程度于室温温育约10-30分钟。通过加入50μl的1％SDS终止显色，并于405nm检测吸光度。

吸光度单位与血清中自身抗体的量相关联。csPCNA同种型的自身抗体的存在指示个体中自由循环的csPCNA同种型的存在情况，因此指示恶性细胞的存在情况。循环csPCNA同种型的量可随癌症阶段和癌症类型而变化。

实施例8：癌细胞的体内检测和csPCNA抗体向肿瘤细胞的传递

与csPCNA相互作用的抗体、噬菌体展示抗体或XPG片段可如下用于鉴别受试者或患者中肿瘤的位置：将放射性同位素标记(例如图18)或荧光标记加入到试剂中，并将csPCNA特异性试剂注射入受试者中，以允许肿瘤细胞与标记试剂(抗体、噬菌体颗粒)反应。然后，通过合适的装置如CCD照相机或PET扫描仪监测标记试剂在受试者中特定位置的累积，这样，以标记试剂的累积定位肿瘤。

同样，将与csPCNA相互作用的抗体、噬菌体展示抗体或XPG片段掺入到脂质体传递囊泡中，用于传递至肿瘤。当掺入到脂质体中的抗体、噬菌体颗粒或XPG片段与csPCNA反应时实现传递。释放入癌细胞中的物质会与癌细胞中的csPCNA相互作用，并竞争涉及csPCNA的细胞生物化学反应。当csPCNA结合配偶体与竞争性csPCNA肽相互作用时，或者通过与csPCNA形成复合物由癌细胞去除csPCNA时，这些反应被减慢或破坏，因此防止csPCNA与其天然目标结合配偶体(例如但不限于DNA聚合酶δ、DNA修复蛋白、转录机器和涉及DNA重组的蛋白)相互作用。

脂质体还可用临床环境下使用或测试的治疗各种恶性肿瘤的传统化疗药物的特定混合物包裹。掺入csPCNA特异性抗体、噬菌体颗粒或XPG片段或已知结合csPCNA的蛋白片段(例如但不限于p21cip/waf1)应允许治疗性脂质体在肿瘤部位累积，并在肿瘤中或邻近肿瘤与肿瘤融合。由于csPCNA试剂对csPCNA的选择性，所以这些试剂不破坏nmPCNA-蛋白相互作用，因此使非恶性细胞免于遭受由破坏csPCNA蛋白特异性相互作用介导的细胞杀伤作用。

脂质体还可用特异性免疫系统刺激分子或物质包裹，在将刺激分子传递至肿瘤细胞或肿瘤部位的细胞时这些分子或物质能够刺激肿瘤部位的免疫应答。通过将csPCNA特异性抗体、噬菌体颗粒、XPG或其它蛋白片段掺入到脂质体表面中，并在将这些治疗性脂质体注射入具有肿瘤的受试者中后允许脂质体与肿瘤细胞和肿瘤环境反应，实现肿瘤部位特异性传递。

尽管已根据其具体实施方案详细描述了与csPCNA同种型相关的肽、抗体及其用途，但对本领域一般技术人员显而易见的是，可对本发明实施各种变更和修改，而不偏离本发明的精神和范围。本文提及的所有参考文献都通过引用整体结到本文中。

Claims

1.一种分离的抗体，所述抗体特异性地结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型。

2.权利要求1的抗体，其中所述csPCNA同种型包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

3.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合的表位含csPCNA蛋白中结合着色性干皮病群G(XPG)蛋白的氨基酸序列。

4.，权利要求1的抗体，其中所述抗体结合csPCNA的表位，所述表位包含的氨基酸序列选自：LGIPEQEY(SEQ ID NO：1)、VEQLGIPEQEY(SEQ ID NO：5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQ ID NO：6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQ ID NO：7)、EQLGIPEQEY(SEQ IDNO：8)、QLGIPEQEY(SEQ ID NO：9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQ IDNO：10)、LGIPEQEYSCVVKMP(SEQ ID NO：11)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQ ID NO：12)、LGIPEQEYSCVV(SEQ IDNO：13)、LGIPEQEYSCV(SEQ ID NO：14)和LGIPEQEYSC(SEQ IDNO：15)。

5.权利要求1的抗体，所述抗体为单克隆抗体。

6.权利要求1的抗体，所述抗体为嵌合抗体。

7.权利要求1的抗体，所述抗体为重组抗体。

8.权利要求1的抗体，所述抗体为单链抗体。

9.权利要求1的抗体，其中所述抗体为选自Fab、Fab′或F(ab′)₂的抗体片段。

10.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合可检测物质。

11.权利要求10的抗体，其中所述可检测物质选自荧光标记、放射性标记、显色标记和酶标记。

12.一种含分离和大致纯化的抗体的组合物，所述抗体特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)的表位，其中所述表位包含氨基酸序列LeuGlyIleProGluGlnGluTyr(SEQ ID NO：1)。

13.csPCNA特异性抗体检测生物样品中的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的用途，所述用途包括：

使生物样品与特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的权利要求1的抗体接触；

提供用于抗体结合的条件；以及

检测抗体与csPCNA同种型的结合。

14.权利要求13的用途，其中所述生物样品是体液。

15.权利要求14的用途，其中所述体液选自血液、血浆、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。

16.权利要求13的用途，其中所述生物样品是组织样品。

17.权利要求16的用途，其中所述组织选自乳腺、前列腺、肺、结肠、上皮、结缔组织、子宫颈、食道、脑、胸腺、甲状腺、胰腺、睾丸、卵巢、肠、膀胱、胃、软组织瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盘、纤维组织、胚细胞组织及其提取物。

18.权利要求13的用途，其中所述抗体检测在体内进行。

19.权利要求13的用途，其中所述抗体检测通过提供标记的二抗进行。

20.权利要求13的用途，其中对所述特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的抗体进行标记。

21.权利要求13的用途，其中所述csPCNA同种型的检测使用质谱分析进行。

22.权利要求13的用途，其中所述csPCNA同种型的检测使用酶联免疫吸附测定进行。

23.权利要求13的用途，其中所述csPCNA同种型的检测使用免疫组织化学方法进行。

24.csPCNA特异性抗体诊断或预后恶性肿瘤的用途，所述用途包括以下步骤：

通过特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的抗体检测生物样品中的csPCNA；以及

基于生物样品中的csPCNA检测诊断恶性肿瘤。

25.权利要求24的用途，其中所述生物样品是生物组织或流体。

26.一种生产癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的特异性抗体的方法，所述方法包括：

给予抗体生产源免疫原性量的肽，所述肽代表csPCNA同种型特异性表位，其中所述肽选自与着色性干皮病群G(XPG)蛋白相互作用的csPCNA区上的连续或不连续氨基酸残基；

提供用于抗体产生的条件；以及

分离和纯化抗体。

27.权利要求26的方法，其中所述抗体由杂交瘤细胞分离和纯化。

28.权利要求26的方法，其中所述肽包含的氨基酸序列选自：LGIPEQEY(SEQ ID NO：1)、VEQLGIPEQEY(SEQ ID NO：5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQ ID NO：6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQID NO：7)、EQLGIPEQEY(SEQ ID NO：8)、QLGIPEQEY(SEQ IDNO：9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQ ID NO：10)、LGIPEQEYSCVVKMP(SEQ ID NO：11)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQID NO：12)、LGIPEQEYSCVV(SEQ ID NO：13)、LGIPEQEYSCV(SEQID NO：14)和LGIPEQEYSC(SEQ ID NO：15)。

29.权利要求26的方法，其中所述肽包含氨基酸序列CGGGLGIPEQEY(SEQ ID NO：2)。

30.权利要求26的方法，其中所述肽结合载体蛋白。

31.权利要求30的方法，其中所述载体蛋白是匙孔血蓝蛋白(KLH)。

32.csPCNA特异性抗体鉴别体内肿瘤位置的用途，所述方法包括：

给予权利要求1的特异性结合csPCNA的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型特异性抗体，其中所述抗体用可检测物质标记；以及

通过检测标记的csPCNA特异性抗体在肿瘤部位的累积确定肿瘤位置。

33.csPCNA特异性抗体使肿瘤演进的降低增大的用途，所述用途包括：

提供一种药物可接受的组合物，所述组合物包含治疗有效量的权利要求1的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型特异性抗体和传递组分的制剂；

给予所述制剂；以及

通过将含csPCNA特异性抗体的制剂传递至肿瘤部位降低肿瘤演进，其中所述csPCNA特异性抗体与存在于肿瘤细胞中的csPCNA同种型反应。

34.权利要求33的用途，其中所述制剂包含脂质体或纳米颗粒。

35.权利要求33的方法，其中所述制剂包含肿瘤杀伤剂或免疫增强剂。

36.csPCNA特异性抗体鉴别抗癌物质的用途，所述用途包括：

使癌细胞群与物质接触；

通过测定权利要求1的csPCNA特异性抗体与csPCNA同种型的结合，检测癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的水平；以及

如果与所述物质接触的癌细胞中的csPCNA同种型水平低于未与所述物质接触的癌细胞中的csPCNA同种型水平，则确定所述物质是抗癌物。

37.权利要求36的用途，其中所述物质是小分子。

38.权利要求36的用途，其中所述癌细胞群选自癌细胞系、异种移植物和癌症的同位模型系统。

39.权利要求36的用途，其中所述测定步骤包括检测与所述物质接触的正常细胞和未与所述物质接触的正常细胞中的非恶性PCNA同种型水平。

40.权利要求36的用途，其中所述抗癌物的鉴别在高通量系统中进行。

41.一种检测PCNA的csPCNA同种型的免疫测定试剂盒，所述试剂盒包含：

仅特异性结合癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型而不结合正常增殖细胞核抗原(nmPCNA)同种型的权利要求1的抗体制备物，由此所述抗体和csPCNA形成复合物；

以及检测所述复合物的试剂。

42.权利要求41的免疫测定试剂盒，所述试剂盒包含的肽的氨基酸序列选自：LGIPEQEY(SEQ ID NO：1)、VEQLGIPEQEY(SEQ IDNO：5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQ ID NO：6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQ ID NO：7)、EQLGIPEQEY(SEQ ID NO：8)、QLGIPEQEY(SEQ IDNO：9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQ ID NO：10)、LGIPEQEYSCVVKMP(SEQ ID NO：11)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQID NO：12)、LGIPEQEYSCVV(SEQ ID NO：13)、LGIPEQEYSCV(SEQID NO：14)和LGIPEQEYSC(SEQ ID NO：15)，其中所述肽用做阳性对照。

43.权利要求41的免疫测定试剂盒，所述试剂盒包含的csPCNA同种型制备物含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中所述csPCNA同种型用作阳性对照。

44.一种分离的自身抗体，所述抗体对癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型是特异性的。

45.权利要求44的自身抗体，其中所述自身抗体与csPCNA同种型的表位复合。

46.一种测定恶性细胞的存在情况的方法，所述方法包括：

使疑似含自身抗体的生物样品与包含结合的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型或其片段的底物接触，其中所述自身抗体对csPCNA同种型是特异性的；

提供用于csPCNA-自身抗体复合物形成的条件；以及

检测生物样品中自身抗体-csPCNA复合物的存在情况。

47.权利要求46的方法，其中所述自身抗体-csPCNA复合物的存在情况使用抗人二抗检测。

48.权利要求46的方法，其中使用标记的生物样品检测自身抗体-csPCNA复合物的存在情况。

49.权利要求46的方法，其中所述生物样品选自血液、血浆、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。

50.一种检测循环性癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的存在情况的方法，所述方法包括检测生物样品中对csPCNA同种型特异性的自身抗体，并由此测定循环性csPCNA同种型的存在情况。

51.一种监测个体的症状缓解情况的方法，所述方法包括：

在癌症治疗之前和之后检测个体中增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的存在情况；以及

通过比较癌症治疗之前和之后循环性csPCNA同种型的水平确定所述个体的症状缓解情况。

52.权利要求51的方法，其中所述csPCNA同种型通过测定csPCNA同种型自身抗体的存在情况检测。

53.权利要求51的方法，其中所述csPCNA同种型用csPCNA同种型特异性抗体检测。

54.权利要求51的方法，其中所述csPCNA同种型通过酶联免疫吸附测定检测。