CN105403710A - Ehd2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，主要包括EHD2特异抗体的制备和肺癌免疫组化检测试剂的制备。EHD2特异抗体的制备以氨基酸序列为SEQ？ID？NO：1的多肽氨基酸序列为核心序列，经修饰后作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体；肺癌免疫组化检测试剂的制备，采用前述对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体。

Description

EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用。
背景技术
肺癌的全称为“原发性支气管肺癌”，其发病率及死亡率近年来上升速度极快。我国肺癌发病的重点在城市，发病率男性为癌症发病的第一位，女性为癌症发病的第三位。肺癌的治愈率很低，尚属于一种很难治愈的癌症，究其原因在于病程进展快，发现、诊断和治疗则相对较晚，早期的发现和诊断对肺癌的治愈至关重要。
目前在临床上对肺癌的恶性度判别主要还是基于在组织病理水平对肿瘤组织和肿瘤细胞进行常规形态学观察，它对癌细胞的分化程度和侵犯特性有较强的辨别能力。但是，这种基于形态学的解读一方面受病理医师经验等人为因素影响，另一方面缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据。对肺癌的发生根源，即基因或相关功能性蛋白等分子进行检测，对肺癌诊断及预后判断具有重要意义，免疫组织化学检测是深刻认识和有效控制肿瘤恶性本质的非常重要的方法。
免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分子抗原的特异性识别，以及化学标记(荧光素、酶、金属离子、同位素等)的第二抗体的显色等作用来检测组织细胞内目标抗原(多肽和蛋白质)的表达量及其亚细胞定位。近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认识的不断深入，免疫组化在肿瘤的分子诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。
本申请项目前期研究发现EHD2蛋白的表达与定位在肺癌中产生异变，自主研发的EHD2特异抗体可用于肺癌的免疫组化检测。EHD2(Epsinhomology(EH)-domain-containingprotein2)是EHD蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白，含有高度保守的EH结构域。参与受体内吞等胞膜转运的多步调控，是整个胞膜转运机制的必不可少的重要环节，在多种细胞中起分子与物质运输及信号传导等关键作用，它的失调将导致细胞信号应答失当及细胞功能紊乱，并可能进而引发疾病。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特性。目前，由EHD2特异抗体制备的免疫组化试剂未见报道，EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用也没有先例。
为解决上述问题，本发明公开了一种EHD2特异抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用。
发明内容
为解决背景技术中提到的目前在临床上对肿瘤的判别主要还是基于在组织病理水平对肿瘤组织和肿瘤细胞进行常规形态学观察，受病理医师经验等人为因素影响较大，缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据的问题，本发明公布了EHD2特异抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用。
本发明解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，是以一种对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体。
所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601，所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_055416。
所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体，其特征在于，所述抗体能特异性识别人EHD2蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQIDNO：1-543，由该氨基酸序列构成的一种多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO：1。
以所述多肽的氨基酸序列为核心序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肽N端连接一个半胱氨酸；修饰后的所述多肽经纯化后作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体并进行抗原纯化。
所述肺癌免疫组化检测试剂，用于对肺癌组织中EHD2的表达水平和定位进行检测，其特征是采用前述对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体，配以常规免疫组化试剂如二抗、显色剂及缓冲剂。
有益效果
本发明的有益效果为：
本发明公开了EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，由于EHD2蛋白参与受体与胞膜转运的多步调控，以及在各种细胞中对维持物质运输与信号传导等起关键作用，与肿瘤等疾病的发生密切相关。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地从分子水平反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特点，符合肿瘤的精准医疗原则和趋势。
本发明公开的EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，以对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体，制备肺癌免疫组化检测试剂，制备出的试剂特异性好，灵敏度高，显色性好。
附图说明
图1为免疫印迹检测结果。
图2为肺癌组织200倍镜下免疫组化图。左上为癌旁正常组织，右下为癌组织。
图3为肺癌组织200倍镜下免疫组化图。
图4为肺癌组织400倍镜下免疫组化图。
具体实施方式
实施例1：EHD2特异抗体的制备
1)实验材料来源
新英格兰大白兔购于上海强耀生物。
多肽CDEEFALASHLIEAKLEGHGLPANLPRRLVPPSKRRHKGSAE由天津赛尔生物技术有限公司定制并与KLH偶联。
CNBr活化的凝胶珠，褔氏完全佐剂及褔氏不完全佐剂购自Invitrigen公司。
2)动物免疫
取4月龄新西兰大白兔3只，将100ug抗原多肽溶于0.2ml0.1MPBS(pH7.2)，与等体积褔氏完全佐剂充分混匀，腹部皮下多点注射。第一次免疫后第15和29天，分别用100ug多肽/0.2mlPBS与等体积褔氏不完全佐剂充分混合后加强免疫。
3)EHD2抗血清的制备
于免疫结束后一周颈动脉取血，37℃静置3小时后离心取血清。
4)抗原凝胶珠制备
CNBr活化的凝胶珠于1mMHCl中浸泡30分钟，用偶联缓冲液(含0.1MNaHCO3pH8.3，和0.5MNaCl)清洗，按1mg多肽加1ml凝胶的比例混合反应体系，4度偶联过夜，1M乙醇胺浸泡3小时后用清洗液1(含50mMTris,1MNaCl，pH8.0)和清洗液2(含50mM甘氨酸,1MNaCl，pH3.5)交叉清洗八遍，PBS清洗1遍。
5)EHD2抗体的纯化
血清与上述抗原凝胶珠按体积比为20:1的混合，加与混合后体系等体积的PBS，混匀1小时后离心，用PBS清洗凝胶珠，用pH3柠檬酸钠溶液洗脱联在凝胶珠上的抗体，调pH至6.5-7.5，得到纯化后的EHD2抗体。
实施例2：对EHD2抗体采用免疫印迹法进行特异性检测
1)实验材料来源
293T细胞购于美国AmericanTypeCultureCollection(ATCC)公司,RPMI1940培养液、BSA、HRP标记抗兔二抗、Lipo2000转染试剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂、ECL化学发光检测试剂等购于Invitrogen公司，EHD1、EHD2、EHD3、EHD4表达质粒为自制。
2)细胞培养
293T细胞培养于RPMI1940培养液中，37℃、5％CO2培养贴壁生长；细胞传代时先弃去培养液，再用磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)洗两遍，加入0.05％胰蛋白酶消化2分钟，加入培养基终止消化。细胞保持良好状态，两天传一代。转染时分别加入表达EHD1、EHD2、EHD3、EHD4的质粒及转染试剂，2天后收取细胞做免疫印迹实验。
3)免疫印迹方法
将各种细胞预留足够数量至离心管中，离心后RIPA裂解液裂解细胞，煮样，再离心。制得样品后，使用BCA检测试剂进行蛋白浓度的测定。每个样品分别取80ug蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF膜上，室温5％牛奶封闭1小时。洗涤后，与一抗(实施例1中制备的抗体以1:2000加入PBS和5％BSA)在室温孵育1小时。然后与1:5000稀释的抗兔二抗室温孵育1小时。最后用化学发光检测试剂检测。
4)结果
上述抗体对EHD2蛋白具有高度的特异性，表现为仅仅针对EHD2才有信号，而对高度同源的其它EHD蛋白也不能识别。检测结果见图1，图中：样品Ve为空表达载体，无信号；样品1过表达EHD1蛋白，无信号；样品2过表达EHD2蛋白，在对应分子量70kd位置呈一条主带，信号清晰，并没有其它明显背景条带；样品3过表达EHD3蛋白，无信号；样品4过表达EHD4蛋白，无信号。综上，本实施例提供的抗体在正常位置70kd处具有强烈的信号，而且在其他位置均无信号，结果表明本发明提供的抗体具有很好的特异性。
实施例3：EHD2免疫组织化学检测
1)实验材料来源
肺癌切片取自天津市肿瘤医院肿瘤组织标本库，常规脱蜡。一抗稀释液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的通用二抗、二氨基联苯胺(DAB)底物、底物稀释液等购自中杉金桥。
2)免疫组化检测试剂组配条件及样本组织中EHD2表达与定位的检测方法
方法主要步骤为：
组织切片脱蜡至水，抗原修复，内源过氧化物酶阻断，以1:200滴加实施例(1)制备得到的抗体作为一抗，4℃孵育过夜。缓冲液洗3次每次5min。滴加通用HRP酶标二抗，在室温下孵育30分钟。缓冲液洗3次每次5min。DAB显色，复染，脱水封片后显微镜下观察染色情况。
3)结果
癌旁正常组织中EHD2在上皮细胞核中强着色、浆或膜表达阳性(见图2左上部)。癌组织中，EHD2表达水平和定位发生异常，或几乎为阴性(见图2右下部)；或表达减弱(见图3)；或核中阴性浆中增强(图4)。
以上实验结果表明，采用本发明提供抗体为核心的免疫组化检测方法，能很好地检测肺癌组织细胞中EHD2的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读EHD2在癌组织细胞中的定位和表达情况，并以此为依据判别肺癌的个体化异质性。
本发明是以所述的自制备的对人EHD2特异的抗体为核心抗体或一抗，配合不同是二抗、显色剂和缓冲剂，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，其特征在于，是以一种对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体，配以常规免疫组化试剂，制备肺癌免疫组化检测试剂，用于对肺癌组织中EHD2的表达水平和定位进行检测。
2.如权利要求1所述的EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，其特征在于，所述常规免疫组化试剂包括二抗、显色剂和缓冲剂。
3.如权利要求1所述的EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，其特征在于，所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601，所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_055416；所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体，能特异性识别人EHD2蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQIDNO：1-543，由所述氨基酸序列构成的一种多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO：1；以所述多肽的氨基酸序列为核心序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肽N端连接一个半胱氨酸；修饰后的所述多肽经纯化后作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体并进行纯化。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110456067A (zh) * 2019-07-31 2019-11-15 四川大学华西医院 Ehd2自身抗体检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途
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