CN105403610A - 一种鉴别粉条或粉丝中是否掺杂异种蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴别粉条或粉丝中是否掺杂异种蛋白的方法，主要解决了现有粉条或粉丝掺杂掺假无法有效鉴别的问题，该粉条或粉丝鉴别方法主要是利用测定粉条或粉丝中蛋白构成和分子量的不同，来确定其是否掺杂掺假，主要方法为：分别对蛋白标准溶液和待测样品溶液通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行测定，然后对蛋白进行染色，通过比对待测样品与标准溶液的色条判定待测样品中含有何种蛋白。本发明只需要超声装置、电泳仪及离心机等设备，且检出限低、操作简单，易于粉条或粉丝的快速鉴别，易于大范围推广。

Description

一种鉴别粉条或粉丝中是否掺杂异种蛋白的方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种鉴别粉条或粉丝中是否掺杂异种蛋白的方法。

背景技术

我国是薯类种植和生产大国，年产量居世界首位，是列于稻谷、玉米、小麦之后的第四大主要粮食作物。淀粉是薯类的主要组成成分，约占其干重的50-80％，在食品工业中主要被用于制作粉丝粉条等。薯类粉丝粉条是我国及广大亚洲国家和地区普遍喜爱的一种传统食品，畅销韩国、日本等多个国家和地区。

然而，由于缺乏相关检测标准与方法，同时由于市场上玉米淀粉、木薯淀粉与马铃薯淀粉、甘薯淀粉价格的差异较大，一些企业和个体加工户受经济利益的驱使，在马铃薯淀粉或甘薯淀粉中掺杂掺假再制成粉丝粉条，造成马铃薯及甘薯粉丝粉条的品质不一、恶意竞争现象严重，导致马铃薯及甘薯粉丝粉条生产企业的合法权益收到侵害，极大地阻碍了马铃薯及甘薯加工产业的发展。

传统的粉条粉丝鉴别方法为灯检或火检，其存在的问题是：只能通过观察透明度或闻味来初步推测粉条粉丝中有无其他杂质或有无添加对人体有害的物质。

目前，以薯类为原料的粉条或粉丝掺假鉴别方法的报道尚属空白。建立粉条或粉丝鉴别方法，对于保障我国薯类粉条或粉丝加工生产企业的合法权益，促进我国薯类加工业的可持续发展，保障我国粮食安全和改善居民膳食营养具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鉴别粉条或粉丝中是否掺杂异种蛋白的方法，所述方法通过测定粉条或粉丝中蛋白构成、分子量的不同实现，所述鉴别方法包括如下步骤：

(1)制备待测样品溶液：向粉碎后的粉条或粉丝样品中加入蛋白溶解液，混合均匀即得；

(2)制备标准品溶液：分别向多种蛋白标准品中加入蛋白溶解液，混合均匀即得；

(3)对标准品进行检测：分别向每个所述标准品溶液中加入上样缓冲溶液，然后采用凝胶电泳法进行检测；

(4)对待测样品溶液进行检测：向所述待测样品溶液中加入上样缓冲溶液，然后采用与所述标准品溶液相同的凝胶电泳法进行检测；

(5)结果判定：电泳结束后，采用染色法对蛋白染色并与标准品蛋白的电泳结果比对，判定待测样品中是否掺杂异种蛋白。

其中，所述蛋白标准品为甘薯蛋白、马铃薯蛋白、木薯蛋白、玉米蛋白中的一种或多种。

采用上述鉴别方法，以马铃薯蛋白、甘薯蛋白、木薯蛋白、玉米蛋白为标准品，可用于鉴定马铃薯粉条或粉丝、甘薯粉条或粉丝中是否掺杂有玉米淀粉和/或木薯淀粉，达到快速准确的对马铃薯或甘薯粉条、粉丝质量监控的目的。

其中，所述蛋白溶解液可选自本领域常规的物质，本发明优选为二甲基亚砜、Tris-HCl缓冲溶液、尿素溶液中的一种。采用上述蛋白溶解液能够使水溶性蛋白、盐溶性蛋白或醇溶性蛋白最大限度的溶解，提高检测的准确度。

优选地，本发明所述的Tris-HCl缓冲溶液中添加有十二烷基硫酸钠(SDS)和甘油，加入SDS和甘油能够增加样品的表面活性，更好的帮助蛋白溶解，进一步优选地，本发明所述的Tris-HCl缓冲溶液中添加有2％十二烷基硫酸钠(SDS)和4％甘油。该Tris-HCl缓冲溶液的制备方法为：取市售Tris-HCl缓冲溶液(pH值7.4)100ml，向其中添加2gSDS和4g甘油，即得。

本发明优选标准品蛋白采用二甲基亚砜蛋白溶解液、待测样品采用上述含有2％SDS和4％甘油的Tris-HCl缓冲溶液溶解，此种情况下，标准品蛋白和粉条/粉丝具有最佳的溶解效果，电泳效果良好，条带分离充分、清晰，结果准确可靠。

所述标准溶液的制备方法优选为：按照1mg蛋白标准品加入0.5-1.5mL二甲基亚砜蛋白溶解液的比例，向蛋白标准品中加入二甲基亚砜蛋白溶解液，混合均匀后超声处理，然后离心取上清液即得。

所述待测样品溶液的制备方法优选为：将粉条或粉丝样品粉碎后，过100-400目筛，按照0.1-0.5g样品加入1-3mL蛋白溶解液的比例，向粉碎后的样品中加入含有2％SDS和4％甘油的Tris-HCl缓冲溶液，混合均匀后超声处理，然后离心取上清液即得。采用此种待测样品溶液制备方法，能够最大程度使得样品中的蛋白被提取，且在进行凝胶电泳时，能够得到清晰的、分离完全的条带，确保该凝胶电泳法具有极低的检出限和精准的检测效果。

其中，所述超声处理优选在如下条件下进行：超声波频率50-60Hz，功率40-50W，超声温度25-35℃。

所述离心优选在如下条件下进行：离心速度8,000-10,000g，离心时间10-30min，温度10-25℃。

本发明所述凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳，优选为10％-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳或4％-12％梯度胶凝胶电泳，进一步优选为15％凝胶电泳。采用梯度胶凝胶电泳可分离分子量范围从几kDa至200kDa的蛋白质，对本发明待分离检测的蛋白而言，具有很好的分离效果。发明人同时对6％，20％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了平行鉴别实验，发现该凝胶电泳无法实现对于分子量较小或较大的蛋白质进行鉴别，而15％聚丙烯酰胺凝胶电泳具有极佳的分离效果，能够很好的实现对本发明涉及蛋白的鉴别。

为了得到理想的电泳结果，本发明凝胶电泳优选采用恒流或恒压方式进行，恒流或恒压操作不仅能够保证蛋白质具有高的分辨率，并且操作简化。

所述恒流的电流优选为20-30mA，恒压的电压优选为80-120V。

本发明所述的上样缓冲溶液优选为非还原型上样缓冲溶液，本发明优选所述上样缓冲溶液的体积用量为样品体积用量的3-7倍，进一步优选为5倍。

本发明最佳的鉴别方法包括如下步骤：

(1)制备待测样品溶液：向粉碎后的粉丝/粉条中加入含有2％十二烷基硫酸钠和4％甘油的Tris-HCl缓冲溶液，超声混合均匀后离心取上清液即得；

(2)制备标准品溶液：分别向多种蛋白标准品中加入二甲基亚砜，超声混合均匀后离心取上清液即得；

(3)对标准品溶液进行检测：向所述标准品溶液中加入非还原型上样缓冲液，采用10-15％的连续胶在恒流或恒压条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(4)对待测样品溶液进行检测：向所述待测样品溶液中加入非还原型上样缓冲液，然后采用与所述标准品溶液相同的凝胶电泳法进行检测；

(5)结果判定：电泳结束后，采用银染法对蛋白染色并与标准品蛋白的电泳结果比对，判定待测样品中是否掺杂有异种蛋白。

本发明具有以下优点：

(一)本发明提供的粉条鉴别方法克服了光检、火验等传统粉条掺假推测方法的缺陷，具有可准确定性、初步定量的特点，采用此种方法能够检测出3％玉米淀粉或木薯淀粉掺杂的粉条或粉丝，满足了消费者对健康饮食、明白消费的需求。

(二)本发明只需要超声装置、电泳仪及离心机等设备，且操作简单，易于粉条或粉丝的快速鉴别，易于大范围推广。

附图说明

图1为本发明实施例2中马铃薯粉条鉴别的电泳图。

其中，M，分子量标样；泳道1：100％马铃薯淀粉粉条；

泳道2：3％木薯淀粉粉条；泳道3：10％木薯淀粉粉条；

泳道4：3％玉米淀粉粉条；泳道5：10％玉米淀粉粉条。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1甘薯蛋白、马铃薯蛋白、木薯蛋白和玉米蛋白的构成和分子量对比

甘薯蛋白、马铃薯蛋白、木薯蛋白和玉米蛋白均为实验室提取，其中甘薯蛋白、马铃薯蛋白、木薯蛋白采用酸沉碱溶的方法提取，玉米蛋白采用乙醇提取法。

1)分别取2mg上述蛋白加入1ml二甲基亚砜中，混合均匀后超声波(超声波频率为50Hz，超声波功率为40W，温度为30℃)处理30min，10,000g离心30min取上清液；

2)将所得上清液与5倍电泳上样缓冲液混合后进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用考马斯亮蓝法对蛋白进行染色与判定。

结果发现，在非还原条件下，甘薯蛋白主要有两条条带，分别为SporaminA和B，其分子量分别为31和22kDa。马铃薯蛋白主要由五条条带构成，分别是蛋白酶抑制剂(5-25kDa)，Patatin(39-45kDa)、多酚氧化酶(约69kDa)、Patatin二聚体(78-90kDa)和Patatin三聚体(117-135kDa)。木薯蛋白的分子量主要分布于20-100kDa之间。而玉米蛋白主要有3条条带，分子量分别约为22、24和44kDa。

实施例2马铃薯粉条的鉴别

分别以马铃薯淀粉，3％木薯淀粉和97％马铃薯淀粉，10％木薯淀粉和90％马铃薯淀粉，3％玉米淀粉和97％马铃薯淀粉，10％玉米淀粉和90％马铃薯淀粉为原料制备粉条，所得粉条分别记为100％马铃薯淀粉粉条、3％木薯淀粉粉条、10％木薯淀粉粉条、3％玉米淀粉粉条和10％玉米淀粉粉条。采用与实施例1相同的凝胶电泳条件对上述粉条进行鉴别，具体操作如下：

1)将上述粉条粉碎后，过100目筛，分别取0.3g加入1.5mlTris-HCl缓冲溶液(含2％SDS和4％甘油)中，混合均匀后超声波(超声波频率为50Hz，超声波功率为40W，温度为30℃)处理30min，10,000g离心30min取上清液；

2)将所得上清液与5倍电泳上样缓冲液混合后进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定。

从图1可以看出，与100％马铃薯粉条相比，添加了3％和10％木薯淀粉的粉条，在100kDa处出现一个新条带，为木薯蛋白所特有；而添加了3％和10％玉米淀粉的粉条，在24kDa处出现一个新条带，为玉米蛋白所特有，采用此种方法能够鉴别出掺杂量低至3％的木薯淀粉和玉米淀粉的马铃薯粉条，检出限低，结果可靠。

实施例3甘薯粉条的鉴别

以甘薯淀粉、3％木薯淀粉和97％甘薯淀粉、40％木薯淀粉和60％甘薯淀粉、3％玉米淀粉和97％甘薯淀粉、40％玉米淀粉和60％甘薯淀粉为原料制备粉条，所得粉条分别记为100％甘薯淀粉粉条、3％木薯淀粉粉条、40％木薯淀粉粉条、3％玉米淀粉粉条和40％玉米淀粉粉条。采用与实施例1相同的凝胶电泳条件对上述粉条进行鉴别，具体操作如下：

1)将上述粉条粉碎后，过100目筛，分别取0.3g加入1.5ml二甲基亚砜中，混合均匀后超声波(超声波频率为50Hz，超声波功率为40W，温度为30℃)处理30min，10,000g离心30min取上清液；

2)将所得上清液与5倍电泳上样缓冲液混合后进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定。

结果发现，与100％甘薯粉条相比，添加了3％和40％木薯淀粉的粉条，在100kDa处出现一个新条带，为木薯蛋白所特有；而添加了3％和40％玉米淀粉的粉条，在24kDa处出现一个新条带，为玉米蛋白所特有。采用此种方法能够鉴别出掺杂量低至3％的木薯淀粉和玉米淀粉的甘薯粉条，检出限低，结果可靠。

实施例4粉丝的鉴别

1)将已知的和待测的粉丝粉碎后，过200目筛，取0.2g加入1mlTris-HCl缓冲溶液(含2％SDS和4％甘油)，混合均匀后超声波(超声波频率为40Hz，超声波功率为30W，温度为25℃)处理40min，离心取上清液；

2)将所得上清液与5倍电泳上样缓冲液混合后进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果显示待测粉丝样品的蛋白与蛋白已知的粉丝相同。

实施例5粉条的鉴别

1)将已知的和待测的粉条粉碎后，过100目筛，取0.3g加入1.5ml二甲基亚砜，混合均匀后超声波(频率为55Hz，超声波功率为40W，温度为25℃)处理60min，离心取上清液；

2)将所得上清液与5倍电泳上样缓冲液混合后进行聚丙烯酰胺电泳，分离胶为4％-12％梯度胶，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果显示待测粉丝样品的蛋白与蛋白已知的粉丝相同。

实施例6粉丝的鉴别

1)将已知的和待测的粉丝粉碎后，过300目筛，取0.3g加入1.5ml二甲基亚砜，混合均匀后超声波(频率为45Hz，超声波功率为45W，温度为30℃)处理50min，离心取上清液；

2)将所得上清液与2倍电泳上样缓冲液混合后进行聚丙烯酰胺电泳，分离胶为15％的连续胶，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果显示待测粉丝样品的蛋白与蛋白已知的粉丝相同。

对比例1粉条的鉴别

1)将已知的和待测的粉条粉碎后，过100目筛，取0.3g加入1.5ml1倍电泳上样缓冲液，混合均匀后超声波(频率为55Hz，超声波功率为40W，温度为25℃)处理60min，离心取上清液；

2)将所得上清液直接进行聚丙烯酰胺电泳，分离胶为4％-12％梯度胶，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果显示已知粉条中蛋白条带显示不完全，有缺带现象出现，导致无法对待测粉丝样品进行检测。

对比例2粉丝的鉴别

1)将已知的和待测的粉丝粉碎后，过200目筛，取0.2g加入1ml蒸馏水，混合均匀后超声波(超声波频率为40Hz，超声波功率为30W，温度为25℃)处理40min，离心取上清液；

2)将所得上清液与5倍电泳上样缓冲液混合后进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果显示已知粉条中蛋白条带显示不完全，有缺带现象出现，导致无法对待测粉丝样品进行检测。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种鉴别粉条或粉丝中是否掺杂异种蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)制备待测样品溶液：向粉碎后的粉条或粉丝样品中加入蛋白溶解液，混匀即得；

(2)制备标准品溶液：分别向多种蛋白标准品中加入蛋白溶解液，混匀即得；

(3)对标准品溶液进行检测：分别向每个所述标准品溶液中加入上样缓冲溶液，然后采用凝胶电泳法进行检测；

(4)对待测样品溶液进行检测：向所述待测样品溶液中加入上样缓冲溶液，然后采用与所述标准品溶液相同的凝胶电泳法进行检测；

(5)结果判定：电泳结束后，采用染色法对蛋白染色并与标准品蛋白的电泳结果比对，判定待测样品中是否掺杂异种蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白标准品为甘薯蛋白、马铃薯蛋白、木薯蛋白、玉米蛋白中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述粉条或粉丝是由马铃薯或甘薯制备得到的。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)的具体操作为：将粉条或粉丝样品粉碎后，过100-400目筛，按照0.1-0.5g样品加入1-3mL蛋白溶解液的比例，向粉碎后的样品中加入蛋白溶解液，混合均匀后超声处理，然后离心取上清液即得。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述蛋白溶解液为二甲基亚砜、Tris-HCl缓冲溶液、尿素溶液中的一种；所述Tris-HCl缓冲溶液中优选添加有十二烷基硫酸钠和甘油，进一步优选添加有2％十二烷基硫酸钠和4％甘油。

6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳，优选为10％-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳或4％-12％的梯度胶凝胶电泳，进一步优选为15％聚丙烯酰氨凝胶电泳。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述凝胶电泳采用恒流或恒压的方式，所述恒流的电流优选20-30mA，所述恒压的电压优选80-120V。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述上样缓冲溶液为非还原型上样缓冲液，优选地，所述上样缓冲溶液体积用量为样品溶液体积用量的3-7倍，进一步优选为5倍。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述染色法为考马斯亮蓝染色法或银染法中的一种，进一步优选为银染法。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)制备待测样品溶液：向粉碎后的粉丝/粉条中加入含有十二烷基硫酸钠和甘油的Tris-HCl缓冲溶液，超声混合均匀后离心取上清液即得；

(2)制备标准品溶液：分别向多种蛋白标准品中加入二甲基亚砜，超声混合均匀后离心取上清液即得；

(3)对标准品溶液进行检测：向所述标准品溶液中加入非还原型上样缓冲液，采用10-15％的连续胶在恒流或恒压条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(4)对待测样品溶液进行检测：向所述待测样品溶液中加入非还原型上样缓冲液，然后采用与所述标准品溶液相同的凝胶电泳法进行检测；

(5)结果判定：电泳结束后，采用银染法对蛋白染色并与标准品蛋白的电泳结果比对，判定待测样品中是否掺杂有异种蛋白。