CN105400838A

CN105400838A - 一种生物酶催化制备磷脂型dha的方法

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Publication number: CN105400838A
Application number: CN201511017385.3A
Authority: CN
Inventors: 许素霞; 刘华英; 陈芳芳
Original assignee: Xiamen Kingdomway Group Co
Current assignee: XIAMEN KINGDOMWAY BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN105400838B

Abstract

本发明提供一种生物酶催化制备磷脂型DHA的方法，所述方法包括将磷脂与含有DHA的物质经生物酶催化制得所述磷脂型DHA。本发明的方法不需要提前将DHA油脂解离为游离的二十二碳六烯酸，工艺操作简单安全，且反应副产物少，经过一次操作即可快速得到大量产物，从而简化了操作工艺，减少了设备的投入。

Description

一种生物酶催化制备磷脂型DHA的方法

技术领域

本发明涉及生物酶催化合成领域，具体涉及一种生物酶催化制备磷脂型DHA的方法。

背景技术

DHA(二十二碳六烯酸)是一种人体自身难以合成的必需脂肪酸，需由食物提供。它能使心脑血管柔软且富有弹性，对大脑神经的保护和功能发挥起到很好的促进作用，因此被誉为“护脑专家”。研究表明，DHA可促进脑细胞的生长和发育，调节脑细胞抗氧化能力和清除自由基，延缓脑衰老和预防老年痴呆症等，是覆盖婴幼儿到中老年人群的健康卫士，在人的一生中都起到重要作用。DHA还有助于眼部健康，增强视网膜细胞膜的流动性，加速视觉信息的传递和处理，改善视力；在抑制血小板凝聚、抗血栓、调血脂、提高免疫力、抑制炎症和癌症、糖尿病等方面也表现出良好的功效。

但单纯服用DHA会造成胃肠负担，而且DHA不容易通过血脑屏障。通过体外培养实验发现单纯DHA的摄入不能对神经2A细胞起到保护作用。目前，DHA的主要来源是鱼油和藻油，且主要以甘油三酯型被人体摄入和以被动扩散的方式被人体吸收，但人体吸收率仅为50％左右。

而近几年的研究发现，磷脂型DHA在人体的吸收率远远高于现有的甘油三酯型，其在体内以主动吸收的方式被吸收，吸收率接近100％。并且当DHA与磷脂结合后就能实现对神经2A细胞的保护功能。这是因为磷脂可作为DHA的一种载体，当DHA结合到磷脂甘油骨架上时，其脑部细胞吸收效率是非酯化DHA的10倍并且稳定性更高，更易通过血脑屏障，进入脑中。另外，DHA结合在磷脂上之后，相对于甘油脂型DHA，氧化稳定性更好。除此之外，磷脂自身生物利用度极高，加上磷脂本身具有改善脂肪代谢、增强免疫力等活性，所以当磷脂型DHA以分子形态被细胞摄取后，可在细胞内分解为DHA和磷脂，显示出增效作用。目前含DHA的海洋磷脂(DHA-PS)已被世界医学和营养界公认为最好的DHA脑供体。因此磷脂型DHA可能成为替代甘油脂型DHA的新兴产品，将在食品添加剂、保健品和药品领域产生极大的商业价值。

1942年美国科学家Floch首次在牛脑中发现了含DHA的磷脂酰丝氨酸分子的存在，并通过实验证明：DHA是被连接到磷脂甘油基的第二位上(简称2-DHA-PS，如下所示)。但出于疯牛病的影响，不适宜从牛脑中萃取获得含DHA的磷脂。

虽然从深海鱼和鸡蛋中富集得到含DHA的磷脂是可以实现的，如中国发明专利从鱼内脏中提取含有多不饱和脂肪酸组成的磷脂脂质混合物的方法(CN03807522.9)和一种提取富含二十二碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)磷脂的方法(CN200810016223.1)，这些从动物中提取磷脂型DHA的方法，存在提取和分离过程较复杂、溶剂用量大、成本高和环保压力大的缺陷；并且提取得到的产品多是富含各类脂肪酸的磷脂型化合物组成的混合物，如要得到单一的磷脂型DHA，还需要经过进一步的提纯分离。

与传统的提取纯化技术相比，生物酶法具有成本低、污染小、无高温加工过程等优势，所以采用生物酶法制备磷脂型DHA有利于市场大规模的推广，前景看好。

以DHA-PS为例，目前生物酶催化制备方法主要是通过富含DHA磷脂酰胆碱(DHA-PC)、DHA磷脂酰乙醇胺(DHA-PE)等产品与L-丝氨酸在磷脂酶D催化作用下发生磷脂酯交换反应合成。而原料DHA磷脂酰胆碱等可来源于包含大量多元不饱和脂肪酸的鱿鱼、金枪鱼、沙丁鱼等深海鱼类的组织、植物大豆卵磷脂，也可来自于采用多元不饱和脂肪酸饲料饲养的禽类鸡蛋中。

例如日本Hosokawa等(J.Agric.FoodChem.，2000，48:4550-4554.)以鱿鱼皮卵磷脂与L-丝氨酸为原料在磷脂酶D催化的双相体系中制备出含有二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸，并且在优化了各种条件后可得DHA含量为43.1％的DHA-PS产品。2007年，李兆杰等(CN101157946A)对上述工艺进行了优化改进；以鱿鱼卵磷脂和L-丝氨酸为原料，在无溶剂体系中利用磷脂酶D₂催化制备出富含高不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸。

美国专利US5965413则介绍了以富含DHA的天然蛋黄卵磷脂等为原料，在磷脂酶D的催化下与L-丝氨酸进行磷脂交换反应得到富含DHA的磷脂酰丝氨酸。

上述方法普遍存在磷脂分子中所含的不饱和脂肪酸的种类较多的问题，因此反应得到的一般为含多种不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸(如DHA-PS、EPA-PS等)的混合物。提取和分离的过程比较复杂，无法获取高纯度DHA-PS；另外，这类方法还存在供给不稳定、原料高价等缺陷。

在生物酶作用下催化富含DHA的藻油或鱼油与大豆磷脂进行酯交换反应是获取磷脂型DHA的另一种常用方法。中国海洋大学孙兆敏等在中国发明专利CN101195637B中介绍了一种在亚临界R134a体系中，采用固定化磷脂酶A1催化大豆卵磷脂和富含EPA和DHA的游离脂肪酸进行酯交换反应制备富含多不饱和脂肪酸磷脂的工艺。天津科技大学路福平教授等在中国发明专利CN1040024797中，采用PCR技术实现定向进化得到了2-DHA-PS：首先令磷脂酰胆碱和丝氨酸在脂肪酶D催化下生成磷脂酰丝氨酸，得到的磷脂酰丝氨酸再与游离的二十二碳六烯酸(DHA)在脂肪酶A2的催化下生成2-DHA-PS。

上述这类合成方法，不仅存在大豆磷脂成分复杂(多是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸组成的混合物)，选择性不高的缺陷；反应中还需先将藻油或鱼油DHA油脂解离为游离的二十二碳六烯酸后再进行酯交换反应，步骤较为繁琐且酯交换反应转化率不高，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的发明人通过大量创造性劳动，发现一种生物酶催化技术，通过控制催化反应条件可显著提高磷脂型DHA的收率和纯度，本发明即是基于以上发现而完成。

本发明第一方面提供一种磷脂型DHA的制备方法，其包括将磷脂与含有DHA的物质经生物酶催化制得所述磷脂型DHA。

在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括在催化过程中加入水和乳化剂。

在本发明的一个实施方案中，所述含有DHA的物质为微生物藻类发酵提取物(即藻油)，其含有DHA的脂肪酸酯和/或游离的DHA，优选地，其DHA的含量为30％(wt)以上，例如35％(wt)以上，例如50％(wt)以上，例如55％(wt)以上。

在本发明的一个实施方案中，所述微生物藻类发酵提取物可以为吾肯氏壶菌、裂殖壶菌、隐甲藻、硅藻、小球藻等微生物发酵提取物。

在本发明的一个实施方案中，所述DHA的脂肪酸酯选自DHA甲酯、DHA乙酯、DHA甘油酯、DHA异丙酯、DHA磷脂等中的至少一种，优选地，其为DHA甘油酯(例如DHA单甘油酯或DHA双甘油酯)。

在本发明的一个实施方案中，所述磷脂为磷酸甘油酯，例如，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇以及磷脂酰丝氨酸中的至少一种，优选地，所述磷脂为磷脂酰丝氨酸，更优选地，所述磷脂酰丝氨酸的纯度在20％以上，例如50％以上。

本发明所述的生物酶催化剂为具有酯化活性的脂肪酶、磷脂酶A或磷脂酶B，所述的脂肪酶可选自白地霉脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、近平滑假丝酵母脂肪酶、色杆菌脂肪酶、爪哇毛霉脂肪酶、毛霉菌脂肪酶、荧光假单胞脂肪酶、米根霉脂肪酶、日本根霉脂肪酶、少根根霉脂肪酶和娄地青霉脂肪酶中的一种或多种。在本发明的一个实施方案中，所述生物酶催化剂选自Novozym435、LipozymeRMIM、LipozymeTMIM、LipozymePSIM中的至少一种，优选地，所述生物酶催化剂为Novozym435。

在本发明的一个实施方案中，所述乳化剂选自非离子型乳化剂，例如为酯类非离子型乳化剂，例如选自单双甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸脂和蔗糖脂肪酸酯中的一种或多种。

优选地，所述磷脂与含有DHA的物质的重量比为1：(4-10)，优选1：(5-7)。

优选地，所述生物酶催化剂的用量为含有DHA的物质的1-20％(wt)，优选6-15％(wt)。

优选地，步骤(1)中所述乳化剂用量为含有DHA的物质的0.1-1％(wt)，优选0.5-1％(wt)。

优选地，其中所述水的用量为含有DHA的物质的0.1-10％(wt)，优选1-6％(wt)，更优选4-6％(wt)。

在本发明的优选实施方案中，所述方法包括将磷脂酰丝氨酸(优选含量在20％以上)与DHA甘油酯(优选含量在55％以上)在水和选自聚甘油脂肪酸酯、单双甘油酸脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯的乳化剂的存在下经Novozyme435催化制得所述磷脂型DHA。

在本发明的一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有DHA的物质溶于有机溶剂中，加入生物酶催化剂、水和乳化剂，得混合物，调节混合物的pH值至6.0-8.0(例如7.0)，得混合溶液，加入磷脂的有机溶液进行反应；

(2)反应结束后产物经分离、纯化即得所述磷脂型DHA。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)中所述有机溶剂为脂肪烃类有机溶剂，例如选自正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷或石油醚中的一种或多种。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)中每1g含有DHA的物质溶于3-10ml(优选5-8ml)有机溶剂。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)中在加入所述磷脂的有机溶液前，还包括将所述混合溶液升温至30-60℃的步骤，优选升温至40-50℃。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)中还包括搅拌的操作，搅拌速度例如为50-200r/min，优选120-150r/min。

在本发明的一个实施方案中，所述搅拌的操作在溶解所述含有DHA的物质的过程中、在制备所述混合物的过程中、在调节所述混合物的pH过程中和/或在加所述磷脂的有机溶液过程中进行。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)中每1g磷脂溶于2-15ml(优选5-7ml)有机溶剂。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)中反应温度为40-65℃，优选40-50℃，反应时间为8-48h，例如12-30h，例如15-27h，例如12-24h。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)中反应在惰性气体保护下进行，所述惰性气体优选氮气。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(2)中所述分离、纯化步骤具体操作如下：回收催化剂，反应液经水洗、浓缩得残余物，萃取所述残余物、分离不溶物，用萃取溶剂洗涤所述不溶物，干燥，得到所述磷脂型DHA。

在本发明的一个具体实施方案中，上述萃取所用溶剂为可溶解油脂和水，但不能溶解磷脂的溶剂，例如，选自丙酮，丁酮，乙酸乙酯，以及乙醚-丙酮、氯仿-丙酮和三氯乙烯-丙酮的混合溶剂，优选丙酮。

在本发明的一个具体实施方案中，上述萃取溶剂用量为含有DHA的物质的4-7(v/w)倍，优选5-6(v/w)倍，更优选为5(v/w)倍。

在本发明的一个具体实施方案中，上述萃取过程优选在低温下进行，优选在-40℃-10℃进行，例如-30℃-0℃，再例如-20℃--10℃。

在本发明的一个具体实施方案中，上述干燥优选真空干燥，干燥的温度为30-45℃，优选35℃。

发明的有益效果

(1)本发明通过生物酶催化磷脂与含有DHA的物质发生酯交换反应合成得到磷脂型DHA，该合成方法不需要提前将DHA油脂解离为游离的二十二碳六烯酸；工艺操作简单安全，且反应副产物少，经过一次操作即可快速得到大量产物；从而简化了操作工艺，减少了设备的投入；

(2)在本发明的一个实施方案中，筛选得到了一系列脂肪酶、磷脂酶A和磷脂酶B(例如Novozym435、LipozymeRMIM、LipozymeTMIM和LipozymePSIM)，其可大大提高酯交换反应效率，提高产品纯度；

(3)在本发明的一个实施方案中，向反应体系中加入少量的水和乳化剂，有助于生物酶活性的释放，油水界面上反应使其催化能力达到最高，提高酯交换反应效率和转化率；

(4)在本发明的一个实施方案中，本发明以较高纯度的磷脂为原料(例如采用纯度在20％以上的磷脂酰丝氨酸)，酯交换的效率明显优于大豆磷脂；而且避免了大豆磷脂中的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙酰胺等成分也与DHA油脂进行酯交换反应，由此保证了产品的高纯度，避免了后续繁琐的分离提纯操作；

(5)在本发明的一个实施方案中，以藻油DHA为原料，由于藻油富含DHA，而EPA、DPA的含量极低，由此可获得高纯度的磷脂酰丝氨酸型DHA，因此这类磷脂酰丝氨酸型DHA产品可以添加进婴幼儿奶粉中，不仅有利于DHA的高效吸收，而且更加符合母乳配方的要求；

(6)在本发明的一个实施方案中，采用本发明的方法制备得到的磷脂酰丝氨酸型DHA，将DHA分子引入到磷脂酰丝氨酸分子中，利用磷脂的乳化性将DHA分子带入细胞中，尤其是脑细胞中，解决脑神经细胞对DHA吸收困难的难题。另外该合成产品通过补充DHA可以促进磷脂酰丝氨酸的积累从而发挥抑制神经细胞死亡的功能，具有DHA和磷脂酰丝氨酸的协同作用，更有利于大脑保健。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

生物酶催化剂：购自诺维信制剂公司；

藻油DHA甘油脂：购自厦门金达威集团股份有限公司，质量纯度为55％。

实施例1

(1)称取5.0g藻油DHA甘油脂溶解于25mL正己烷中,得到藻油DHA酯的正己烷溶液；加入0.31g的Novozyme435固定化脂肪酶和0.30g水，然后加入0.025g的聚甘油脂肪酸酯，调节混合物的pH值为6.7；将上述混合溶液在惰性气体N₂的保护下置于恒温水浴锅及磁力搅拌装置上，提前加热至50℃左右，边加热边以125r/min的转速搅拌15～30min。搅拌下缓慢滴加磷脂酰丝氨酸(纯度为25％)的正己烷溶液(1.01g磷脂酰丝氨酸溶于7mL正己烷)，N₂保护下在50℃水浴条件下恒速搅拌反应18h。

(2)反应结束后静置过滤回收催化剂生物酶；有机相加入30mL的水洗，而后在60℃的水浴下减压蒸馏，回收溶剂；之后加入25mL的丙酮，冷却至-40℃，将产物洗涤出来。然后离心分离、收集沉淀并用10mL丙酮洗涤两次，滤饼在40℃烘箱中真空恒温干燥，得到1.07g产品。

实施例2

(1)称取6.0g藻油DHA甘油脂溶解于42mL正己烷中,得到藻油DHA酯的正己烷溶液；加入0.72g的磷脂酶A1和0.06g的水，然后加入0.06g的聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯，调节混合物的pH值为7.2；将上述混合溶液在惰性气体N₂的保护下置于恒温水浴锅及磁力搅拌装置上，提前加热至50℃，边加热边以130r/min的转速搅拌15～30min。搅拌下缓慢滴加溶磷脂酰丝氨酸(纯度为50％)的正己烷溶液(0.97g磷脂酰丝氨酸溶于5mL正己烷)。N₂保护下在60℃水浴条件下恒速搅拌反应27小时。

(2)反应结束后静置过滤回收催化剂生物酶；有机相加入30mL的水洗，而后在60℃的水浴下减压蒸馏，回收溶剂。之后加入30mL的丙酮，冷却至10℃，将产物洗涤出来。然后离心分离、收集沉淀并用10mL丙酮洗涤两次，滤饼在40℃烘箱中真空恒温干燥，得到1.19g产品。

实施例3

(1)称取7.0g藻油DHA甘油脂溶解于56mL正己烷中，得到藻油DHA酯的正己烷溶液；加入1.05g的磷脂酶A2和0.28g的水，然后加入0.06g的蔗糖脂肪酸酯，调节混合物的pH值为7.5；将上述混合溶液在惰性气体N₂的保护下置于恒温水浴锅及磁力搅拌装置上，提前加热至50℃，边加热边以150r/min的转速搅拌15～30min。搅拌下缓慢滴加磷脂酰丝氨酸(纯度为50％)的正己烷溶液(1.07g磷脂酰丝氨酸溶于7mL正己烷)；N₂保护下在60℃水浴条件下恒速搅拌反应26小时。

(2)反应结束后静置过滤回收催化剂生物酶；有机相加入30mL的水洗，而后在60℃的水浴下减压蒸馏，回收溶剂。之后加入35mL的丙酮，冷却至-10℃，将产物洗涤出来。然后离心分离、收集沉淀并用10mL丙酮洗涤两次，滤饼在35℃烘箱中真空恒温干燥，得到1.14g产品。

实施例4

(1)称取7.0g藻油DHA甘油脂溶解于27mL正己烷中,得到藻油DHA酯的正己烷溶液；加入0.700gLipozymeRMIM脂肪酶和0.35g的水，然后加入0.056g的聚甘油脂肪酸酯，调节混合物的pH值为8.0；将上述混合溶液在惰性气体N₂的保护下置于恒温水浴锅及磁力搅拌装置上，提前加热至50℃，边加热边以150r/min的转速搅拌15～30min。搅拌下缓慢滴加磷脂酰丝氨酸(纯度为70％)的正己烷溶液(1.04g磷脂酰丝氨酸溶于6mL正己烷)；N₂保护下在55℃水浴条件下恒速搅拌反应24小时。

(2)反应结束后静置过滤回收催化剂生物酶；有机相加入30mL的水洗，而后在60℃的水浴下减压蒸馏，回收溶剂。之后加入35mL的丙酮，冷却至-20℃，将产物洗涤出来。然后离心分离、收集沉淀并用10mL丙酮洗涤两次，滤饼在40℃烘箱中真空恒温干燥，得到1.20g产品。

实施例5～9

(1)称取6.0g藻油DHA甘油脂溶解于25mL有机溶剂中,得到藻油DHA酯溶液；加入适量Novozyme435固定化脂肪酶和水，然后加入乳化剂，调节混合物的pH值为7.0；将上述混合溶液在惰性气体N₂的保护下置于恒温水浴锅及磁力搅拌装置上，提前加热至50℃左右，边加热边以140r/min的转速搅拌15～30min。搅拌下缓慢滴加溶于6mL上述有机溶剂的1.03g磷脂酰丝氨酸(纯度为50％)；N₂保护下在55℃水浴条件下恒速搅拌反应15h。

(2)反应结束后静置过滤回收催化剂生物酶；有机相加入30mL的水洗，后在60℃的水浴下减压蒸馏，回收溶剂；之后加入30mL的丙酮，冷却至-10℃，将产物洗涤出来。然后离心分离、收集沉淀并用10mL丙酮洗涤两次，滤饼在35℃烘箱中真空恒温干燥，收集得到产品。

表1实施例5～9配料表

实施例10

(1)称取6.0g藻油DHA甘油脂溶解于42mL正己烷中，得到藻油DHA酯的正己烷溶液；加入0.72g的磷脂酶A1，调节混合物的pH值为7.2；将上述混合溶液在惰性气体N₂的保护下置于恒温水浴锅及磁力搅拌装置上，提前加热至50℃，边加热边以130r/min的转速搅拌15～30min。搅拌下缓慢滴加磷脂酰丝氨酸(纯度为50％)的正己烷溶液(0.97g磷脂酰丝氨酸溶于5mL正己烷)；N₂保护下在60℃水浴条件下恒速搅拌反应27h。

(2)反应结束后静置过滤回收催化剂生物酶；有机相加入30mL的水洗，而后在60℃的水浴下减压蒸馏，回收溶剂；之后加入30mL的丙酮，冷却至10℃，将产物洗涤出来。然后离心分离、收集沉淀并用10mL丙酮洗涤两次，滤饼在40℃烘箱中真空恒温干燥得到0.98g产品。

实施例11-15

(1)称取7.0g藻油DHA甘油脂溶解于56mL正己烷中,得到藻油DHA酯的正己烷溶液；加入适量其他脂肪酶和0.28g的水，然后加入0.06g的蔗糖脂肪酸酯，调节混合物的pH值为7.5；将上述混合溶液在惰性气体N₂的保护下置于恒温水浴锅及磁力搅拌装置上，提前加热至50℃，边加热边以150r/min的转速搅拌15～30min。搅拌下缓慢滴加磷脂酰丝氨酸(纯度为50％)的正己烷溶液(1.07g磷脂酰丝氨酸溶于7mL正己烷)；N₂保护下在60℃水浴条件下恒速搅拌反应26小时。

(2)反应结束后静止过滤回收催化剂生物酶；有机相加入30mL的水洗，而后在60℃的水浴下减压蒸馏，回收溶剂。之后加入35mL的丙酮，冷却至-10℃将产物洗涤出来。然后离心分离、收集沉淀并用10mL丙酮洗涤两次，滤饼在35℃烘箱中真空恒温干燥。

表2不同脂肪酶对DHA产品的影响

项目	脂肪酶	脂肪酶用量/g	产品重量/g
				实施例11	地衣芽孢杆菌脂肪酶	1.050	1.03
实施例12	铜绿假单胞菌脂肪酶	1.050	0.98
				实施例13	黑曲霉脂肪酶	1.050	0.95
实施例14	猪胰脂肪酶	1.050	1.04
				实施例15	橘青酶脂肪酶	1.050	1.00

实施例16实施例1～实施例15中磷脂酰丝氨酸型DHA成品含量的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定产品中各组分的含量，根据磷脂酰丝氨酸标样的保留时间和峰面积，采取外标法定量。测定结果见下表：

表3实施例1～15所得产品的DHA含量

高效液相色谱法(HPLC)的检测条件为:

检测前使用甲醇定容，在高效液相色谱柱中获取磷脂酰丝氨酸的峰面积，通过标准曲线校正方程计算磷脂酰丝氨酸的浓度。采用LiChrosphere100diol色谱柱，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱，流速1.3ml/min，柱温30℃，用发光散射检测器进行检测，样品溶液进样量为5μL；其中，所述A相为正己烷：甲醇：乙酸：三乙胺＝610:150:10:0.9(v/v/v/v)，B相为甲醇：纯水：乙酸：三乙胺＝650:120:10:0.8(v/v/v/v)。梯度洗脱条件为：0～25min，流动相中A相的体积浓度从95％降至60％，B相的体积浓度从5％升至40％；25～30min，流动相中A相的体积浓度从60％降至0，B相的体积浓度从40％升至100％；30～40min，流动相中A相的体积浓度从0升至95％，B相的体积浓度从100％降至5％；40～50min，流动相中A相的体积浓度为95％，B相的体积浓度为5％。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种磷脂型DHA的制备方法，其包括将磷脂与含有DHA的物质经生物酶催化制得所述磷脂型DHA。

2.权利要求1的方法，其包括将磷脂与含有DHA的物质在水和乳化剂的存在下经生物酶催化制得所述磷脂型DHA。

3.权利要求2的方法，其包括以下步骤：

(2)反应结束后产物经分离、纯化即得所述磷脂型DHA。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述含有DHA的物质中含有DHA的脂肪酸酯和/或游离DHA，优选地，其中DHA的含量为30％(wt)以上，例如35％(wt)以上，例如50％(wt)以上，例如55％(wt)以上，优选地，所述DHA的脂肪酸酯选自DHA甲酯、DHA乙酯、DHA甘油酯、DHA异丙酯、DHA磷脂等中的至少一种，更优选地，其为DHA甘油酯。

5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述磷脂为磷酸甘油酯，例如，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇以及磷脂酰丝氨酸中的至少一种，优选地，所述磷脂为磷脂酰丝氨酸，更优选地，其纯度在20％以上，例如50％以上。

6.权利要求1-3任一项的方法，其中所述生物酶催化剂为具有酯化活性的脂肪酶、磷脂酶A或磷脂酶B，优选地，所述生物酶催化剂选自Novozym435、LipozymeRMIM、LipozymeTMIM、LipozymePSIM中的至少一种，更优选地，所述生物酶催化剂为Novozym435。

7.权利要求2或3的方法，其中所述乳化剂为非离子型乳化剂，例如为酯类非离子型乳化剂，例如选自单双甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸脂和蔗糖脂肪酸酯中的一种或多种。

8.权利要求3的方法，其特征在于以下的一项或多项：

a)步骤(1)中所述乳化剂用量为含有DHA的物质的0.1-1％(wt)，优选0.5-1％(wt)；

b)步骤(1)中所述水的用量为含有DHA的物质的0.1-10％(wt)，优选1-6％(wt)；

c)步骤(1)中所述磷脂与含有DHA的物质中DHA的重量比为1：(4-10)，优选1：(5-7)；

d)步骤(1)中所述生物酶催化剂用量为DHA油脂的1-20％(wt)，优选6-15％(wt)；

e)步骤(1)中所述有机溶剂为脂肪烃类有机溶剂，例如选自正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷或石油醚中的一种或多种；

f)步骤(1)中在加入所述磷脂的有机溶液前，还包括将所述混合溶液升温至30-60℃的步骤，优选升温至40-50℃；

g)步骤(1)中还包括搅拌的操作，搅拌速度例如为50-200r/min，优选120-150r/min；

h)步骤(1)中反应温度为40-65℃，优选40-50℃，反应时间为8-48h，例如12-30h，例如15-27h，例如12-24h；

i)步骤步骤(1)中所述反应在惰性气体保护下进行，所述惰性气体优选氮气；

j)步骤(2)中所述分离、纯化步骤具体操作如下：回收催化剂，反应液经水洗、浓缩得残余物，萃取所述残余物、分离不溶物，用萃取溶剂洗涤所述不溶物，干燥，得到所述磷脂型DHA；

k)第j)项萃取所用溶剂为可溶解油脂和水，但不能溶解磷脂的溶剂，例如，选自丙酮，丁酮，乙酸乙酯，以及乙醚-丙酮、氯仿-丙酮和三氯乙烯-丙酮的混合溶剂，优选丙酮；

l)第j)项所述萃取过程优选在低温下进行，优选在-40℃-10℃进行，例如-30℃-0℃，再例如-20℃--10℃；

m)第j)项所述干燥优选真空干燥，所述干燥的温度为30-45℃，优选35℃。