CN105388223B - 一种地西他滨中间体中残留溶剂的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地西他滨杂质中吡啶的含量测定方法，以甲醇‑N‑甲基吡咯烷酮‑三乙胺混合液为溶剂，采用直接进样气相色谱法进行测定。解决了地西他滨的原料糖苷稳定性差、不易溶解，现有检测方法的回收率严重偏低和易受溶剂峰干扰的问题。该方法经验证空白溶剂对残留溶剂吡啶测定无干扰峰出现、精密度良好，相对标准偏差(RSD)仅为0.46％，重现性好，线性关系良好、平均回收率高，能准确定量检出糖苷中可能残留的吡啶。本发明对制备地西他滨的原料糖苷中二类溶剂吡啶实现了有效的质量控制，同时确保了地西他滨的质量及用药的安全。

Description

一种地西他滨中间体中残留溶剂的测定方法

技术领域

本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种地西他滨杂质中吡啶的含量测定方法。

背景技术

地西他滨，英文名为Decitabine，属胞嘧啶核苷类药物，是由SuperGen公司研发并由MGIPHARMA公司上市，2006年5月在美国被批准用于治疗骨髓增生异常综合征。

糖苷是地西他滨合成时在对接反应步骤中用到的原料，该糖苷结构式如下：

在合成糖苷的过程中用到二类溶剂吡啶，吡啶健康危害：有强烈刺激性；能麻醉中枢神经系统；对眼及上呼吸道有刺激作用；高浓度吸入后，轻者有欣快或窒息感，继之出现抑郁、肌无力、呕吐；重者意识丧失、大小便失禁、强直性痉挛、血压下降；误服可致死。慢性影响：长期食入出现头晕、头痛、失眠、步态不稳及消化道功能紊乱；可发生肝肾损害。可引起皮炎。

根据中国药典2010年版二部附录ⅧP第二法中对残留溶剂的定义为在原料药、辅料的生产中，以及制剂制备过程中会使用的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。当残留溶剂的残留高于安全值时，如果不对药品中溶剂残留进行限度检查，将会使药品存在极大地安全隐患。

气相色谱法测定原料药中有机溶剂残留量通常采用顶空进样或直接进样两种方法。顶空进样方式原料药和溶剂消耗量大，直接进样方式操作简单，试验材料需要量小。

高瑞银、魏福荣等，齐鲁药事，2011，30(7)：383-384，公开了气相色谱法测定吡非尼酮中残留溶剂含量，采用溶液直接进样气相色谱法，色谱柱为 HP－INNOWAX毛细管柱长30m，内径0.53mm，膜厚2.65μm，载气为氮气，以 N，N－二甲基甲酰胺为溶剂，测定了吡非尼酮原料药中异丙醚、丙酮、二氯甲烷、乙腈、二氧六环与吡啶的残留量。但是上述方法中糖苷的溶解性欠佳，且在检测糖苷中吡啶时回收率严重偏低，平均回收率约为20％，不满足回收率在80％～ 120％之间的要求，故不能准确定量检出糖苷中可能残留的吡啶。

王辉、常先平、周成钥等，中国药业，2012，21(22):57-58，公开了气相色谱法测定非布索坦中残留有机溶剂含量，采用溶液直接进样气相色谱法,色谱柱为SPB-5填充柱，柱长30m、内径0.53mm、膜厚5.0μm，载气为氮气，以 N-甲基吡咯烷酮为溶剂,测定了非布索坦原料药中乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、吡啶、二甲基甲酰胺的残留量。结果6种有机溶剂完全分离,在所考察的质量浓度范围内线性关系良好。该方法也存在着在检测酸性较强的糖苷中吡啶时回收率严重偏低，平均回收率约为25％，不满足回收率在80％～120％之间的要求，故不能准确定量检出糖苷中可能残留的吡啶。

中国发明专利CN103926359A，公开了一种原料药米非司酮中残留溶剂的测定方法，通过建立顶空气相色谱分析法，将测定的四氢呋喃、乙醇、异丙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、吡啶、乙腈和苯的标准品溶液色谱与原料药米非司酮供试品溶液的色谱进行比较、计算，来完成原料药米非司酮中残留溶剂的检测方法。但是顶空实验检测碱性较强的吡啶，吡啶易吸附于不锈钢管道上，对设备要求高。该方法溶剂是二甲基亚砜，同样存在在检测酸性较强的糖苷中吡啶时回收率严重偏低，回收率约为20％，故同样不能准确定量检出糖苷中可能残留的吡啶。

糖苷稳定性很差，呈较强的酸性，吡啶呈碱性，糖苷与吡啶作用，易使糖苷测定回收率偏低，而且糖苷直接采用已公开的现有方法检测，会出现稳定性差、溶解性差、现有检测方法在检测糖苷中吡啶时回收率严重偏低，溶剂峰会干扰糖苷中吡啶峰的测定等问题。

目前尚未有报道糖苷中吡啶的含量测定方法，因此，根据药品审评中心指导原则要求，需要建立一种地西他滨杂质中吡啶的含量测定方法，并规定合理的限定，对确保地西他滨的安全用药具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服现有技术的不足，提供了一种地西他滨杂质中吡啶的含量测定方法。解决了制备地西他滨的原料糖苷稳定性差、不易溶解、现有检测方法在检测糖苷中吡啶时回收率严重偏低和易受溶剂峰干扰的问题。

本发明人对糖苷中吡啶残留量做过大量的实验，摸索出一种地西他滨杂质中吡啶的含量测定方法，本发明提供的方法检测时准确度高、专属性强，精密度试验验证良好、线性关系良好、回收率在80％～120％之间，相对标准偏差小于10％，方法回收率良好。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种地西他滨中间体中残留溶剂的测定方法，包括如下步骤：

A、供试品溶液制备：取中间体样品，用甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的混合溶液溶解并稀释成0.1g/ml的溶液，混匀，备用；

B、对照品溶液制备：取中间体的残留溶剂样品，用甲醇-N-甲基吡咯烷酮- 三乙胺的混合溶液稀释制成20μg/ml的溶液，混匀，备用；

C、检测方法：取供试品溶液和对照品溶液各2μl，分别注入气相色谱仪的气相色谱柱中，依次记录色谱图；

D、含量计算：按外标法以峰面积计算残留溶剂的含量；

其中所述的中间体为糖苷。

其中所述的中间体的残留溶剂为吡啶；所述步骤C中检测方法是直接进样气相色谱法。

作为优选，所述气相色谱仪型号为Agilent 7890A、货号为HP-INNOWAX、色谱柱型号为：以聚乙二醇为固定液的石英毛细管柱，该石英毛细管柱的柱长30m、内径0.32mm、液膜厚度0.5μm。

作为优选，所述甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为45～48:45～ 48:4～10。

进一步的，所述甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为47.5：47.5：5。

进一步的，供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪的气相色谱柱中，该气相色谱柱条件为：

柱温：程序升温；

进样口温度：230～270℃；

火焰离子化检测器温度：280～320℃；

载气：氮气；

载气流速：2～4ml/min；

分流比：10～30:1。

进一步的，气相色谱柱条件为：

柱温：程序升温方法是初始温度40℃保持8分钟，然后以每分钟20℃的速率升温至220℃，保持19分钟；

进样口温度：250℃；

火焰离子化检测器温度：300℃；

载气：氮气；

载气流速：3.0ml/min；

分流比：20:1。

制备地西他滨原料糖苷中残留溶剂的测定方法，该方法需要方法学验证，包括空白试验、精密度试验、检出限与定量限、线性试验和回收试验，其中所述测定方法中验证线性试验，包括如下步骤：

1)配制甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为47.5：47.5：5的混合溶液，混匀，备用。

2)精密称取对照品吡啶20mg置于100ml容量瓶中，用步骤1)中所述混合溶液稀释成200μg/ml的溶液，混匀，备用。

3)分别移取0.5、1.0、2.5、5.0、10ml于50ml容量瓶中，用步骤1)中所述混合溶液稀释定容，摇匀，备用。

4)分别精密量取步骤3)中样品各2μl进样，记录色谱图。

5)以浓度为x轴，峰面积为y轴，作线性回归。

其中所述测定方法中验证回收试验步骤如下：

1)分别配制吡啶的浓度为16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺溶液；所述甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺体积比为47.5：47.5：5；所述吡啶的浓度为16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺溶液为对照品溶液；

2)精密称取1.0g糖苷于10ml量瓶中，用步骤1)中对照品溶液溶解后，量取2μl进样，记录色谱图；

3)另取未加入糖苷的对照品溶液，同法测定，记录色谱图，按外标法计算回收率。

其中甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比在45～48：45～48：4～10，范围内能准确定量检出糖苷中可能残留的吡啶。若N-甲基吡咯烷酮或甲醇含量太低，糖苷溶解性不好，若三乙胺含量太低，平均回收率低，均不能准确定量检出糖苷中可能残留的吡啶。

对其他酸性化合物中碱性溶剂的检测，如醋酸盐化合物、盐酸盐化合物以及其他各种酸性化合物中的哌嗪、吡啶或其他碱性溶剂，本发明也适用。

与现有技术相比，本发明带来的有益技术效果如下：

1、本发明选择N-甲基吡咯烷酮能保证糖苷具有较好的稳定性，且利于吡啶的分离；选择加入三乙胺能保证吡啶处于游离状态便于测定，且出峰时间差异较大，不干扰吡啶测定；选择加入甲醇能充分满足加入三乙胺前后溶解要求，且出峰时间差异较大不干扰吡啶测定。该溶剂体系在检测酸性较强的糖苷中吡啶时平均回收率高，满足回收率在80％～120％之间的要求，故能准确定量检出糖苷中可能残留的吡啶。

2、本发明所用气相色谱柱型号和气相色谱柱条件，专属性强，确保本发明提供的方法检测时准确度高，精密度相对标准偏差仅为0.46％，低于现有技术中相对标准偏差值，重现性更好，精密度试验验证良好；线性关系良好；平均回收率为92.73％，回收率相对标准偏差仅为0.97％，相对标准偏差小于10％，方法回收率良好。

3、本发明采用直接进样法，操作简单，对气相相关设备要求低，规避了顶空进样方式原料药和溶剂消耗量大的缺点，也没有出现直接进样带来的出峰复杂和堵柱子的缺陷。

4、本发明对糖苷中二类溶剂吡啶作了详细的研究，实现了有效的质量控制，从而保证了地西他滨合成的收率和质量。

附图说明

图1为实施例1中糖苷中残留溶剂吡啶的检测谱图。

图2为实施例1中吡啶对照品溶液色谱图。

图3为实施例1中空白溶剂色谱图。

图4为实施例1中吡啶检测限色谱图。

图5为实施例1中吡啶定量限色谱图。

图6为实施例1中吡啶的线性关系图。

具体实施方式

1、仪器：

分析天平，型号：METTLER TOLEDO ABS135-S。

气相色谱仪型号为Agilent 7890A、货号为HP-INNOWAX、色谱柱型号为：以聚乙二醇为固定液的石英毛细管柱，该石英毛细管柱的柱长30m、内径0.32mm、液膜厚度0.5μm。

2、试剂：

甲醇：分析纯；N-甲基吡咯烷酮：分析纯；三乙胺：分析纯。

3、样品：

糖苷，批号：20110301、20130601、20130701。

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1

色谱条件：

柱温：程序升温：初始温度40℃保持8分钟，然后以每分钟20℃的速率升温至220℃，保持19分钟。

进样口温度：250℃；

火焰离子化检测器温度：300℃；

载气：氮气；

载气流速：3.0ml/min；

分流比：20:1。

1、检测

A、供试品溶液制备：

首先，把甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺混合溶液按体积比为47.5：47.5：5 配制好，备用；

再次，精密称取糖苷1.0g，置10ml容量瓶中，用配制好的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的混合溶液溶解并稀释成0.1g/ml的溶液，混匀，备用；

B、对照品溶液制备：精密称取吡啶200μg，置10ml容量瓶中，用配制好的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的混合溶液稀释制成20μg/ml的溶液，备用；

C、检测方法：取供试品溶液和对照品溶液各2μl，参照中国药典2010年版二部附录ⅧP第二法测定，采用直接进样法分别注入气相色谱仪的气相色谱柱中，依次获得糖苷样品色谱图，见图1和吡啶对照品色谱图见图2。

D、含量计算：按外标法以峰面积计算残留溶剂的含量。

2、计算公式：

溶剂残留量(％)＝(Ai×V/W)/(As/Cs)×100％；

其中Ai：供试品溶液中待测溶剂峰面积；

As：吡啶对照品溶液主峰面积；

Cs：吡啶对照品溶液浓度(mg/ml)；

W：供试品溶液配制时样品的取样量(mg)；

V：供试品溶液配制体积(ml)；

3、测定结果

按照上述测定方法对三批供试品进行检测，结果均未检出，见表1。

表1：

批号	吡啶含量(％)
		20110301	未检出
20130601	未检出
		20130701	未检出

3、方法学验证

3.1空白试验

取上述配制好的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺混合溶液，在上述色谱条件下进样，空白溶剂在7min前和14.5min后岀峰，在7～14.5min之间对残留溶剂吡啶测定无干扰。甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺混合溶液出峰时间见图3。

3.2精密度试验

精密称取吡啶0.02g置100ml容量瓶中，加上述配制好的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准贮备液。

精密量取标准贮备液5.0ml置50ml容量瓶中，以上述配制好的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺混合溶液稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件试验，测定5份， RSD为0.46％，精密度良好。吡啶精密度试验结果见表2。

表2：

编号

1#

2#

3#

4#

5#

平均值

RSD

峰面积

39.89

39.48

40.00

39.91

39.74

39.80

0.46％

3.3检出限与定量限

方法：精密称取吡啶20mg，用上述配制好的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺混合溶液为溶剂，稀释成7个不同浓度的溶液，见表3。

按上述色谱条件试验，精密量取各浓度下溶液2μl，分别注入气相色谱仪的气相色谱柱，记录色谱图。

表3：

编号	浓度(μg/ml)
		1#	44.4
2#	22.2
		3#	11.1
4#	4.44
		5#	2.22
6#	0.444
		7#	0.222

实验结果：

通过逐级降低浓度法测定，按照S/N＝3计算，测得吡啶的检出限为 0.39μg/ml，相当样品中0.0004％的量；检测限图谱见图4。

通过逐级降低浓度法测定，按照S/N＝10计算，测得吡啶的定量线为 1.47μg/ml，相当样品中0.0015％的量；定量限图谱见图5。

3.4线性试验

精密称取吡啶2mg，置10ml容量瓶中，用配制好的甲醇-N-甲基吡咯烷酮- 三乙胺的混合溶液稀释制成200μg/ml的溶液，备用。

分别移取0.5、1.0、2.5、5.0、10ml于50ml容量瓶中，用配制好的甲醇-N- 甲基吡咯烷酮-三乙胺的混合溶液稀释定容，摇匀，见表4。分别量取2μl进样，记录色谱图。

表4：

编号	溶液浓度(μg/ml)	峰面积
			1#	2.22	4.12
2#	4.44	8.12
			3#	11.1	20.41
4#	22.2	41.79
			5#	44.4	81.83

结果：以浓度为x轴，峰面积为y轴，作线性回归。线性方程为 Y＝1.8475X+0.0833，相关系数R＝0.9999，吡啶在2～44μg/ml浓度范围内线性关系良好。线性关系曲线图见图6。

3.5回收试验

1)分别配制吡啶的浓度为16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺溶液；该甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺体积比为47.5：47.5：5；其中吡啶的浓度为16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺溶液为对照品溶液；

2)精密称取1.0g糖苷(批号：20130701于10ml量瓶中，用步骤1)中对照品溶液溶解后，量取2μl进样，记录色谱图；

3)另取未加入糖苷的对照品溶液，同法测定，记录色谱图，按外标法计算回收率。

精密量取对照品溶液10ml，并加入1.0g样品(批号：20130701)，溶解后，量取2μl进样，记录色谱图。另取未加入样品的对照品溶液，同法测定，按外标法计算回收率。平均回收率为92.73％，RSD为0.97％(N＝9)。回收率在80％～120％之间，RSD小于10％，方法回收率良好。

表5：吡啶回收率：

实施例2

本实施例与实施例1的区别是甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为

45:45：10。

色谱条件：

柱温：程序升温：初始温度40℃保持8分钟，然后以每分钟20℃的速率升温至220℃，保持19分钟。

进样口温度：230℃；

火焰离子化检测器温度：280℃；

载气：氮气；

载气流速：2.0ml/min；

分流比：10:1。

按照上述条件，检测三批供试品溶液，其色谱图中未检测出吡啶峰，经计算，糖苷中吡啶的残留量为0％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别是甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为

48:48：4。

色谱条件：

柱温：程序升温：初始温度40℃保持8分钟，然后以每分钟20℃的速率升温至220℃，保持19分钟。

进样口温度：270℃；

火焰离子化检测器温度：320℃；

载气：氮气；

载气流速：4.0ml/min；

分流比：30:1。

按照上述条件，检测三批供试品溶液，其色谱图中未检测出吡啶峰，经计算，糖苷中吡啶的残留量为0％。

另外，供试品中其他残留溶剂也能按照上述实施例1至3提供的方法检测。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种地西他滨中间体中残留溶剂的测定方法，包括如下步骤：

A、供试品溶液制备：取中间体样品，用甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的混合溶液溶解并稀释成0.1g/ml的溶液，混匀，备用；

B、对照品溶液制备：取中间体的残留溶剂样品，用甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的混合溶液稀释制成20μg/ml的溶液，混匀，备用；

C、检测方法：取供试品溶液和对照品溶液各2μl，分别注入气相色谱仪的气相色谱柱中，依次记录色谱图；

D、含量计算：按外标法以峰面积计算残留溶剂的含量；

其中所述的中间体为糖苷；

其中所述的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为45～48:45～48:4～10；

其中所述的残留溶剂为吡啶；

其中所述的气相色谱仪型号为Agilent 7890A，色谱柱型号为HP-INNOWAX石英毛细管柱，以聚乙二醇为固定液；

其中所述的气相色谱柱条件为：

柱温：程序升温；

进样口温度：230～270℃；

火焰离子化检测器温度：280～320℃；

载气：氮气；

载气流速：2～4ml/min；

分流比：10～30:1；

其中所述的程序升温是初始温度40℃保持8分钟，然后以每分钟20℃的速率升温至220℃，保持19分钟。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤C中检测方法是直接进样气相色谱法。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的石英毛细管柱的柱长30m、内径0.32mm、液膜厚度0.5μm。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为47.5：47.5：5。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，气相色谱柱条件为：

柱温：程序升温方法是初始温度40℃保持8分钟，然后以每分钟20℃的速率升温至220℃，保持19分钟；

进样口温度：250℃；

火焰离子化检测器温度：300℃；

载气：氮气；

载气流速：3.0ml/min；

分流比：20:1。

6.如权利要求1所述测定方法的验证线性试验，包括如下步骤：

1)配制甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的体积比为47.5：47.5：5的混合溶液，混匀，备用；

2)精密称取对照品吡啶20mg置于100ml容量瓶中，用步骤1)中所述混合溶液稀释成200μg/ml的溶液，混匀，备用；

3)分别移取0.5、1.0、2.5、5.0、10ml于50ml容量瓶中，用步骤1)中所述混合溶液稀释定容，摇匀，备用；

4)分别精密量取步骤3)中样品各2μl进样，记录色谱图；

5)以浓度为x轴，峰面积为y轴，作线性回归。

7.如权利要求1所述测定方法的验证回收试验，包括如下步骤：

1)分别配制吡啶的浓度为16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的混合溶液；所述甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺体积比为47.5：47.5：5；所述吡啶的浓度为16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml的甲醇-N-甲基吡咯烷酮-三乙胺的溶液为对照品溶液；

2)精密称取1.0g糖苷于10ml量瓶中，用步骤1)中对照品溶液溶解后，量取2μl进样，记录色谱图；

3)另取未加入糖苷的对照品溶液，同法测定，记录色谱图，按外标法计算回收率。