CN105378071B - 用于产生稳定转染细胞的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了涉及高产细胞系的方法和组合物。一些实施方案涉及用于筛选这类细胞系以及用于产生这类细胞系的有效方法。这些细胞系可以用来生产大量的蛋白质。为了快速地产生用于临床前研究和临床试验两者的大量重组蛋白或疫苗，几乎所有药物开发都将面临同样的挑战性障碍，即迅速地产生高稳定性的生产者。开发和鉴定稳定细胞系是生物制药发展的关键部分。

Description

用于产生稳定转染细胞的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/794,785,3的优先权权益，通过引用将其整体并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明一般地涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于产生稳定转染细胞的新的方法和组合物。

2.相关技术说明

为了快速地产生用于临床前研究和临床试验两者的大量重组蛋白质或疫苗，几乎所有药物开发都将面临同样的挑战性障碍，即迅速地产生高稳定性的生产者。开发和鉴定稳定细胞系是生物制药开发的关键部分。然而，稳定细胞系的开发是一个复杂的过程，通常包括转染、选择、克隆/筛选、比较研究、表征和稳定性研究。转染是该过程的第一步，其将决定在所要求的时间线内是否可以产生具有高效价和良好产品质量的稳定细胞系。许多现有的转染方法已表现出低的转染效率(如PEI和脂质方法)或具有中度转染效率的低细胞生存力(其他EP方法)(Tait 2004年；Derouazi 2004；Reisinger 2009；Florea 2002)。这两个限制因素导致需要冗长的、复杂的、耗时的和资源密集型的选择过程。通常，将筛选几千个克隆以鉴定良好的稳定克隆(Dharshanan 2011；Shi 2011)并且该领域中的许多制药公司投资并使用了用于液体处理和克隆挑选/选择两者的扩增自动化系统，例如AmbrTM系统、ClonePiX、FACS分选和SimCell系统(Dharshanan 2011；Shi 2011；Moses 2012；Lindgren2009；Sleiman 2008，Carroll 2004；Thomas 2008)。其他人也已经开发了特定的专有表达构建体和细胞系以产生高产率的稳定细胞系(de la Cruz 2006；Fan 2012；Nair 2011)。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及产生外源蛋白质或基因产物的稳定细胞系，包括高产细胞系。可以产生并且使用非常高浓度的抗生素(即，通常将杀伤细胞(即使其被转染了赋予抗生素抗性的基因)的浓度水平)鉴定这样的细胞系。一些实施方案涉及使用包括“条件致死浓度”的选择剂的培养条件，“条件致死浓度”指的是在该浓度下孵育至少6天后，当对未转染的细胞相对于转染的细胞的生存力百分比进行比较时，将杀伤至少10％以上细胞的选择剂(例如，抗体)的浓度水平。

因此，在一些实施方案中，有用于产生表达外源多肽、多肽的复杂组装(例如，病毒样颗粒，VLP)或核苷酸和其他分子的复杂组装(例如，基因治疗病毒载体，例如慢病毒、腺病毒或腺相关病毒)之稳定细胞系的方法，所述方法包括使用电穿孔将表达构建体转染进细胞中，其中所述表达构建体包含：i)可选择基因和ii)编码一个或更多个外源多肽本身或者连同其他分子的序列；以及在包含条件致死浓度的选择剂的培养条件下根据可选择基因的表达进行选择。在本文所描述的方法中使用电穿孔将核酸递送进细胞中。步骤包括用所期望的核酸对细胞进行电穿孔以使得一个或更多个核酸分子进入细胞中。

术语“外源多肽”指的是由这样的核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列的全部或部分序列最初由本文所讨论的转染过程引入细胞。当然，表达外源多肽的细胞可以是已转染了外源序列的亲本细胞的后代(progeny)。例如，细胞可以转染有表达构建体，所述表达构建体提供转染前细胞基因组不表达的或已经由细胞表达(但是在转染的核酸表达后，细胞增加了生产能力)之多肽的表达。在一些实施方案中，细胞可能产生一种形式的多肽(内源多肽)并且外源多肽可以是该多肽的改变形式。在一个实施方案中，所述改变形式是多肽的野生型形式。在另一个实施方案中，所述改变形式是可能用作例如诱饵(decoy)的内源多肽的截短形式。在另一些实施方案中，可以产生的外源基因产物不仅仅限于多肽。外源多肽可连同外源基因产物(即，不编码多肽但是作为RNA分子发挥功能的RNA转录本)一起产生。RNA分子可以是RNAi、siRNA、miRNA或其他RNA分子。

在某些实施方案中，使用流式电穿孔(flow electroporation)对细胞进行电穿孔。流式电穿孔指的是这样的过程，其包括：将细胞的悬浮液和装载分子转移到由流体室(fluid chamber)或流体流道(flow path)构成的设备中；所述流体室或流体流道由沿着流体室或流体流道的侧面设置并且被配置为使所述流体室或流体流道内的生物颗粒受到适合于电穿孔的电场的电极构成；以及将经电穿孔的细胞悬浮液从设备中转移出。该方法对于大规模体积的细胞特别有效。相比之下，由于与穿过液体的移动电流和相对电极之间的距离相关的约束，静态电穿孔涉及一组且体积有限的细胞的电穿孔。

“表达构建体”是编码要在靶细胞内表达之所期望基因或序列的核苷酸序列。用于所公开的方法和组合物的表达构建体可以是，例如，寡核苷酸序列、DNA分子、RNA分子、细菌质粒、染色体基因编辑系统(例如，核酸酶、整合酶、转座子/转座酶、TALEN、CRISPR/Cas9以及指导序列)、病毒载体、病毒、黏粒、人工染色体。在一些特定方面，表达构建体是细菌质粒。在某些实施方案中，表达构建体为环形。在另一些实施方案中，表达构建体为线性。在一些实施方案中，表达构建体是DNA，不过其也可以是RNA。在大多数情况下，表达构建体为双链，但在一些实施方案中，表达构建体可以为单链或包含单链区。

转染表达构建体的细胞可以是本领域普通技术人员已知的任何合适的细胞，例如哺乳动物细胞。在某些方面，所述细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于CHO细胞。

在某些方面，将表达构建体转染进细胞包括使细胞的悬浮液流过流动室中的电场，所述电场由至少部分地限定了所述流动室的相对的带相反电荷的电极产生，其中流动室的热阻小于约10℃每瓦特。在其他某些方面，转染所述细胞包括使用流式电穿孔装置，所述装置包含用于容纳待电穿孔之细胞的悬浮液的室；所述室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述室的热阻小于约10℃每瓦特。

在一些实施方案中，转染所述细胞包括使用流式电穿孔装置，所述装置包含：限定流道的壁，所述流道具有被配置为接收和暂时容纳待电穿孔细胞的悬浮液之持续流的电穿孔区域；与所述流道流体连通的流入口(inlet flow portal)，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入至所述流道中；与所述流道流体连通的流出口(outlet flow portal)，由此可通过所述出口将所述悬浮液从所述流道排出；在电穿孔区域内限定所述流道的壁，包含形成所述流道之第一壁的主要部分的第一电极和形成与所述第一壁相对的所述流道之第二壁的主要部分的第二电极，所述第一电极和第二电极是这样的，当将所述第一电极和第二电极与电能来源电连通时，在电极间形成所述悬浮液可流过的电场；并且其中所述流道的热阻小于约10℃每瓦特。在某些这类的实施方案中，第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。此外，流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm。在一些特定的实施方案中，流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为：约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或从可来源于其中的任何值。在某些实施方案中，在流道中被电穿孔的细胞基本上不会因此被热降解。

在一些方面，所述流式电穿孔装置包含用于容纳待电穿孔的细胞悬浮液的流动室；所述流动室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm。在一些特定方面，所述比为1比70cm。在另一些特定方面，所述比为约1比50cm。例如，所述比可为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或从可来源于其中的任何值。

在一些实施方案中，所述流式电穿孔装置包含限定了流道的壁，所述流道被配置为接收和暂时容纳待电穿孔的细胞悬浮液的持续流；与所述流道流体连通的流入口，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入至所述流道中；与所述流道流体连通的流出口，由此可通过所述出口将所述悬浮液从所述流道排出；限定所述流道的壁，包含形成所述流道之第一壁的至少一部分的第一电极和形成与所述第一壁相对的所述流道的第二壁的至少一部分的第二电极，所述第一电极和第二电极是这样的，当将所述第一电极和第二电极与电能来源电连通时，在电极间所述悬浮液可流过的电场；并且其中所述流道的热阻小于约10℃每瓦特。在某些方面，流道的热阻为大约0.1℃每瓦特至10℃每瓦特。例如，所述流道的热阻可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10℃每瓦特或从可来源于其中的任何热阻。所述第一电极和第二电极可彼此间隔至少1mm、至少2mm、至少3mm或可来源于其中的任何距离。在任何所公开的实施方案中，所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm。例如，所述比可为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或可来源于其中的任何值。在某些方面，所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且所述第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。在另一些方面，所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且所述第一电极和第二电极彼此间隔至少3mm。在甚至另一些方面，所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且所述第一电极和第二电极彼此间隔约3mm至约2cm。例如，所述第一电极和第二电极可彼此隔约3、4、5、6、7、8、9或10mm或从可来源于其中的任何距离，或者所述第一电极和第二电极彼此间隔约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0cm或从可来源于其中的任何距离。在这些实施方案的一些方面，在所述流道中被电穿孔的细胞基本上不会因此被热降解。

在某些公开的方法和装置中，所述室的热阻为约0.1℃每瓦特至约4℃每瓦特。在一些方面，所述室的热阻为约1.5℃每瓦特至约2.5℃每瓦特。例如，所述室的热阻可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃每瓦特或可来源于其中的任何热阻。

在某些公开的方法和装置中，所述流式电穿孔装置包含：限定了流道的壁，所述流道被配置为接收和暂时容纳包含颗粒之悬浮液的持续流；与所述流道流体连通的流入口，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入至所述流道中；与所述流道流体连通的流出口，由此可通过所述流出口将所述悬浮液从所述流道排出；限定所述流道的壁，包含形成所述流道之第一壁的第一电极板和形成与所述第一壁相对的所述流道之第二壁的第二电极板；其中选择与所述悬浮液接触的电极面积以及所述电极之间的距离以使得所述流道的热阻小于约4℃每瓦特；使成对的电极与电能来源电连通，由此在所述电极之间形成电场；由此流过所述流道的颗粒的悬浮液可经受所述电极之间形成的电场。在某些方面，限定了所述流道的所述电极板还包含：由非导电材料形成的且设置在所述第一电极板和第二电极板之间以使电极板维持互相间隔关系的垫圈(gasket)，所述垫圈限定出通道，其中形成所述流道之相对的侧壁。垫圈可以例如与第一电极板和第二电极板各自形成密封。在一些实施方案中，所述装置包含多个流道，并且所述垫圈包含多个通道，形成多个通道各自相对的侧壁。在一些方面，流入口和流出口中的一个包含在一个电极板中形成并且与所述流道流体连通的孔。流入口和流出口中的另一个可包含在一个电极板中形成并且与所述流道流体连通的孔。在某些方面，流入口和流出口包含在另一个电极板中形成并且与所述流道流体连通的孔。在任何所公开的实施方案中，所述装置可还包含与所述流道有效关联以散热的冷却元件。例如，所述冷却元件可包含热电冷却元件。作为另一个实例，所述冷却元件可包含与所述电极接触流动的冷却流体。作为再一个实例，所述冷却元件可包含与电极有效关联的散热器。所述流道的热阻可小于约3℃每瓦特。在一些实施方案中，所述流道的热阻为约0.5℃每瓦特至4℃每瓦特，或者所述流道的热阻为约1℃每瓦特至3℃每瓦特。例如，所述流道的热阻可为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃每瓦特或可来源于其中的任何值。

在某些公开的方法和装置中，所述第一电极可包含长形导电结构，其中所述第二电极包含管状的导电结构；其中所述电极被同心地布置以使得第二管状电极围绕与其为隔开关系的所述第一电极；并且所述流道设置在所述第一电极和第二电极之间限定的环形空间内。所述电极可形成限定所述流道的壁的至少一部分。在一些实施方案中，用于维持所述第一电极和第二电极的隔开的同心关系的同心环形垫片(spacer)。在某些方面，所述装置与第二类似装置串联或并联布置。

在某些涉及通过流式电穿孔转染细胞的方法中，流道的热阻小于约10℃每瓦特。在一些涉及通过流式电穿孔转染细胞的方法中，所述方法包括使待电穿孔的细胞悬浮液流过流道，并且当流过所述流道时使所述悬浮液暴露于电场，所述电场的强度大于0.5kV/cm。例如，所述电场的强度可大于约3.5kV/cm。在某些方面，所述电场的强度大于约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.5kV/cm或可来源于其中的任何值。

在涉及通过电穿孔转染的某些方法中，大于50％的通过电穿孔转染的细胞表达外源多肽。例如，约50％至95％的通过电穿孔转染的细胞表达外源多肽。作为另一个实例，约60％至90％的通过电穿孔转染的细胞表达外源多肽。作为再一个实例，约70％至80％的通过流式电穿孔转染的细胞表达外源多肽。在一些具体的方面，约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或可来源于其中的任何百分比的通过电穿孔转染的细胞表达外源多肽。

在任何所公开的方法中，在选择之前和/或之后，大于约50％的通过流式电穿孔转染的细胞可有活力。在某些方面，在选择之前和/或之后，大于约60％、70％、80％或90％的通过流式电穿孔转染的细胞有活力。在另一些方面，在选择之前和/或之后，约50％至90％的通过流式电穿孔转染的细胞有活力。在另一些方面，在选择之前和/或之后，约60％至90％的通过流式电穿孔转染的细胞有活力。例如，在选择之前和/或之后，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或可来源于其中的任何百分比的通过流式电穿孔转染的细胞可有活力。

任何所公开的方法可包括采用有限稀释的所选择的转染细胞以获得单细胞集落的步骤。如本文所使用的术语“有限稀释”指的是显著地稀释细胞培养物的过程，目的是在每种培养物中取得单个细胞。当这样的分离的单个细胞进行繁殖时，所得培养物将仅包含原始细胞的克隆。例如，可使用多孔板来获得单细胞培养物或集落。

在涉及根据选择基因的表达进行选择的任何所公开的方法中，可以在分批培养或悬浮培养条件下进行选择。在所公开的方法中可以使用本领域技术人员已知的任何选择基因和选择剂。在某些方面，选择基因是抗生素抗性基因并且选择剂是抗生素。例如，抗生素抗性基因可赋予对新霉素、嘌呤霉素、博来霉素、G418、潮霉素、腐草霉素或杀稻瘟素的抗性。在一些具体的实施方案中，抗生素抗性基因赋予对新霉素的抗性并且选择剂可以是G418或其衍生物。

在某些方面，可通过补充或从细胞培养基除去特定的营养物或添加剂来控制选择基因在本文所描述的方法中是有用的。在某些方面，选择基因可以是受物理、化学或生物试剂直接或间接在药理学上控制的基因。例如，可通过缺失或突变DHFR基因来制备DHFR(二氢叶酸还原酶)-缺陷型细胞(minus cell)。缺乏DHFR的细胞需要某些营养物来生长，例如，次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷甘氨酸和谷氨酰胺。DHFR基因可用作标志物，通过排除DHFR缺陷型细胞生长所需要的营养物来选择表达DHFR的细胞。另一个实例是谷氨酰胺合成酶(GS)选择系统。在不表达足够量的GS的细胞中，可通过铺板在无谷氨酰胺的培养基上将GS基因用作选择标志物。或者，GS抑制剂甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine，MSX)可用于抑制内源的GS活性以使得只有具有额外GS活性的转染子可以存活。

在另一些实施方案中，特别考虑将不需要添加选择剂以用于转染细胞的存活的选择系统排除在外。

在其中抗生素用作选择方法的方法中，可以用所述抗生素以条件致死浓度培养转染的细胞至少4至21天。在一些方面中，用抗生素以条件致死浓度培养转染的细胞4至10天。例如，用抗生素以条件致死浓度培养转染的细胞4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或可来源于其中的任何时间长度。

在其中用抗生素以条件致死浓度培养细胞的方法中，用所述抗生素以条件致死浓度培养后，将所述细胞维持在具有较低浓度抗生素的培养基中。例如，抗生素的较低浓度可以为条件致死浓度的约10％至90％。作为另一个实例，抗生素的较低浓度可以为条件致死浓度的约50％。在某些实施方案中，抗生素的较低浓度可以为条件致死浓度的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％或可来源于其中的任何百分比。在任何这样的方法中，其中将细胞维持在与抗生素的条件致死浓度相比具有较低浓度抗生素的培养基中，可将细胞维持在较低浓度3至20天。例如，可将细胞维持在较低浓度约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或可来源于其中的任何时间。当将细胞维持在与抗生素的条件致死浓度相比较低浓度的抗生素中时，可将细胞维持在较低的浓度，之后使用有限稀释对稳定转染的细胞进行克隆。如本文所使用的术语“克隆”指的是通过使单个祖细胞复制来产生遗传上相同的细胞(或遗传上基本相同的细胞)之群体的过程(其可以被称为“无性系的”)。

在任何所公开的方法中，可以采用包括对克隆分离并选择的细胞进行扩增以产生表达外源多肽之克隆细胞的步骤。在一些方面，在包含抗生素的培养基中扩增经克隆分离的细胞。例如，在扩增期间抗生素的浓度可以不超过抗生素条件致死浓度的50％。作为另一个实例，在扩增期间抗生素的浓度可以不超过抗生素条件致死浓度的25％。在某些方面，在扩增期间抗生素的浓度为不超过抗生素条件致死浓度的25％、30％、35％、40％、45％或50％或可来源于其中的任何百分比。

在涉及对克隆的分离的细胞进行扩增的所公开的方法中，扩增可用于大规模生产。例如，可在大于1L的体积中扩增细胞，或者可在大于3L的体积中扩增细胞。在某些方面，在大于1.0、1.5、2.0、2.5或3.0L或可来源于其中的任何值的体积中扩增细胞。可在包含抗生素的培养基中扩增细胞，并且这样的培养基可包含条件致死浓度的抗生素。

在所公开的任何方法中，可在无血清培养基中培养细胞。在一些方法中，采用包括分离或纯化由细胞产生的外源多肽的另外步骤。

在某些方面，所选择的细胞产生至少约0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2g/L或3g/L的外源多肽。例如，所选择的细胞产生至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0g/L或可来源于其中的任何范围的外源多肽。在另一些方面，所选择的细胞在被转染的5、6、7、8、9、10、11或12周(或可来源于其中的任何范围)内产生至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0g/L(或可来源于其中的任何范围)的外源多肽。在一些特定方面，扩增的克隆细胞在被转染的6、7、8、9或10周(或可来源于其中的任何范围)内产生至少约0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2g/L或3g/L(或可来源于其中的任何范围)的外源多肽。在另一些特定方面，扩增的克隆细胞在被转染后的5、6、7、8、9、10、11或12周(或可来源于其中的任何范围)内产生至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0g/L(或可来源于其中的任何范围)。在甚至另一些方面，扩增的克隆细胞在被转染的6、7、8、9或10周(或可来源于其中的任何范围)内每个细胞每天产生大于10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80皮克(或可来源于其中的任何范围)的外源蛋白质。

在一些实施方案中，与对照细胞相比，扩增的克隆细胞每个细胞每天多产生大于10％的蛋白质，其中对照细胞与转染细胞相似，但用不超过条件致死浓度50％之浓度的抗生素进行孵育。在另一些实施方案中，与对照细胞相比，扩增的克隆细胞每个细胞每天多产生大于约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(或可来源于其中的任何百分比)的蛋白质，其中对照细胞与转染细胞相似，但用不超过条件致死浓度50％之浓度的抗生素进行孵育。在某些方法中，在60代后转染的细胞产生的外源蛋白质的水平是在10至20代外源蛋白质水平的至少50％。

在任何所公开的方法中，可采用包括对转染并且选择的细胞进行冷冻的另一个步骤。还可采用再一个步骤，其中扩增先前冷冻的转染并且选择的细胞。

在一些方面，其中被转染并进行选择的细胞是CHO细胞，其中选择基因是新霉素并且选择剂是G418或其衍生物。在某些涉及CHO细胞的这些方面，G418或其衍生物的条件致死浓度为至少约0.8mg/ml。在涉及CHO细胞的另一些方面，G418或其衍生物的条件致死浓度大于约1.0mg/ml。例如，G418或其衍生物的条件致死浓度可以为至少约或至多约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5或4mg/ml或可来源于其中的任何值。在涉及CHO细胞的任何这些公开的方法中，选择剂可以是G418。

在所公开的方法中，如本领域普通技术人员所理解的，可基于所使用的特定选择剂来选择所述选择剂的条件致死浓度。例如，G418或其衍生物的条件致死浓度可大于约1.0mg/ml。作为另一个实例，G418或衍生物的条件致死浓度大于约1.6mg/ml。在某些方面，G418或其衍生物的条件致死浓度大于约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5mg/ml或可来源于其中的任何值。在涉及抗生素作为选择剂的任何公开的方法中，抗生素可以是G418。

公开了用于产生稳定CHO细胞表达系的其他方法，其包括：a)使用流式电穿孔装置将包含i)编码赋予G418抗性的多肽的序列和ii)编码外源多肽的序列的表达构建体转染进CHO细胞中；b)在包含大于约1.6mg/ml G418的培养基中选择转染的CHO细胞；c)通过有限稀释分离选择的转染的CHO细胞以获得克隆细胞；以及，d)扩增分离的转染的CHO细胞以产生稳定的CHO细胞表达系。

在所公开的方法中，细胞培养物可包含本领域普通技术人员已知的任何其他成分，如本领域普通技术人员基于所培养的细胞类型容易地选择。例如，可在丁酸钠或相当的盐中培养细胞。

在所公开的方法中，可采用包括对克隆分离并选择的细胞进行扩增以产生表达外源多肽的克隆细胞的另一个步骤。

另一些实施方案涉及用于产生稳定CHO细胞表达系的方法，其包括：a)使用电穿孔装置将包含i)编码赋予G418抗性的多肽的序列和ii)编码一种或更多种外源多肽的序列的表达构建体转染进CHO细胞中；b)在包含大于约1.6mg/ml G418的培养基中选择转染的CHO细胞；c)通过有限稀释分离选择的转染的CHO细胞以获得克隆细胞；以及，d)扩增分离的转染的CHO细胞以产生稳定的CHO细胞表达系。在一个具体的实施方案中，所述电穿孔装置是流式电穿孔装置。这样的方法可还包括收集由复制的转染的CHO细胞产生的外源多肽。在涉及产生稳定的CHO细胞表达系的某些方法中，将转染的细胞维持在包含1.6mg/ml G418的培养基中至少6天。在某些方法中，稳定的CHO细胞表达系在培养基中产生大于约2g/L的外源蛋白质。

另一些实施方案涉及用于筛选高产CHO细胞系的方法，其包括：a)使用电穿孔装置将包含i)编码赋予G418抗性的多肽的序列和ii)编码一种或更多种外源多肽的序列的表达构建体转染进CHO细胞中；b)在包含大于约1.6mg/ml G418的培养基中选择转染的CHO细胞至少6天；c)通过有限稀释分离选择的转染的CHO细胞以获得克隆细胞；d)扩增分离的转染的CHO细胞以产生稳定的CHO细胞表达系；以及，e)就所述外源多肽的生产对细胞进行评估。在一个具体的实施方案中，所述电穿孔装置是流式电穿孔装置。在涉及用于筛选高产CHO细胞系之方法的这样的实施方案中，可采用包括鉴定作为外源多肽之高产者(highproducer)的CHO细胞系的另一个步骤。

还公开了某些用于产生蛋白质的方法，其包括以上所描述的任何方法的步骤并且包括分离或纯化外源多肽的步骤。在某些实施方案中，所述方法还涉及合并(pooling)分离的或纯化的外源多肽。

还公开了纯化的或基本上纯化的蛋白质的组合物。纯化的蛋白质指的是这样的制备物，其中所述蛋白质是制备物中最主要的蛋白质。“基本上纯化的蛋白质”指的是相对于核酸和其他蛋白质，组合物的纯度大于80％(w/w)。

这样的蛋白质可通过以下方法产生，所述方法包括：a)使用电穿孔装置将包含i)编码赋予抗生素抗性的多肽的序列和ii)编码一种或更多种外源多肽的序列的表达构建体转染进细胞中；b)在含有条件致死浓度的抗生素的培养基中选择转染的细胞；c)通过有限稀释分离选择的转染细胞以获得克隆细胞；d)扩增分离的转染细胞以产生稳定的细胞表达系；以及，e)收集外源多肽。在一个具体的实施方案中，所述电穿孔装置是流式电穿孔装置。

如本文说明书中所使用的，没有数词限定的表述可意指一个/种或更多个/种。当与词语“包括/包含”一起使用时，如本文权利要求中所使用的词语“一个/种”可指一个/种或多于一个/种。

权利要求书中使用术语“或”意指“和/或”，除非明确指明为仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管公开内容支持所指仅仅是替代方案以及“和/或”的定义。如本文所使用的“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多。

在整个本申请中，术语“约”用来表示数值包括装置和确定数值所采用的方法的误差的固有变化，或者研究对象之间存在的变化。

根据下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，这些详细描述和具体实施例虽然说明了本发明的一些优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分并包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参考一个或更多个这些附图结合本文中所出现的一些具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。

图1：用Maxcyte STX静态和流式电穿孔转染技术的稳定细胞系开发过程。附图描绘了稳定细胞产生的工作流程。在电穿孔后，可将细胞培养一段时间而不进行选择以使其从电穿孔过程中恢复(图中未示出)。在电穿孔后，在选择剂存在下通过培养细胞来选择细胞(选择阶段)。在选择阶段后，在选择剂存在下于较低密度下培养细胞以使得进行有限稀释克隆(维持/克隆选择阶段)。在产生克隆群后，筛选表达外源多肽的克隆并扩增(克隆筛选和扩增阶段)。在筛选后，使具有所期望活性的克隆在更大规模上生长以用于生产目的(大规模扩大阶段)，或使其进行长期保存(例如低温保存)。

图2：使用MaxCyte静态和流式电穿孔之大于95％的CHO细胞转染效率和细胞生存力。使用小规模的静态电穿孔在MaxCyte STX上用编码绿色荧光蛋白的质粒转染CHO-S细胞(1μg DNA/1E6细胞)。在电穿孔后24小时通过流式细胞术(FACS)测量GFP表达和生存力。转染效率和细胞生存力两者都＞95％。

图3：使用MaxCyte静态和流式电穿孔进行的迅速的稳定细胞系开发。使用CHO2电穿孔方案在MaxCyte STX上将人源化mAb DNA质粒转染进CHO-S细胞中。在G418选择培养基中从稳定库(stable pool)进行有限稀释克隆。在第6周产生细胞系并进行规模扩大以用于生产和加入细胞库(cell bank)。以补料分批生产率＞3g/L。

图4：高效价抗体产生。

图5：逐渐提高电穿孔后的细胞密度增加了分泌的抗体效价。

图6：不同大小的培养瓶对抗体产生的作用。

图7：使用MaxCyte静态和流式电穿孔进行的迅速稳定细胞系开发。

图8：用G418处理的细胞杀伤曲线。

图9：示例性电穿孔的样品条件和结果(NS：未选择)

具体实施方案

I.稳定细胞系开发

稳定细胞系开发是一个漫长并充满挑战的过程。产生稳定细胞系的时间、劳动力和费用的限制是促进蛋白质治疗发展的主要障碍。稳定细胞系开发中的关键步骤之一是CHO细胞的转染效率，因为CHO细胞系是一个难以转染的细胞系。这种困难导致了产生潜在高表达的稳定细胞系的第一个主要瓶颈。然而，对于许多难以转染的细胞系(例如CHO细胞、Jurkat细胞系、干细胞和原代细胞系)，MaxCyte STX电穿孔(EP)转染技术已经示出极大的转染效率(＞90％的效率)。此外，在EP后所有这些转染的细胞都具有高的细胞生存力(＞90％)，这为稳定的选择提供了非常健康的转染细胞。MaxCyte转染技术的这些独特的转染特征使得按照非常高严格的选择方式(1.6g/L G418)进行选择过程，从而迅速地清除未转染的和低表达的稳定细胞，增加稳定细胞系开发的成功率并产生高表达的稳定细胞系。本发明的实施方案证明，可在4至6周内鉴定具有超过3g/L效价的高产率稳定细胞系并且可在8至9周内通过使用MaxCyte转染技术来完成补料分批生产。

在一些实施方案中，在电穿孔后，可将细胞培养一段时间而不进行选择以使其从电穿孔过程中恢复(未在图中示出)。在另一些实施方案中，在电穿孔恢复后，在选择剂存在下通过培养细胞来选择细胞(选择阶段)。在又一些实施方案中，在电穿孔后不进行恢复，在选择剂存在下通过培养细胞来选择细胞(选择阶段)。在选择阶段后，在选择剂存在下于较低密度下培养细胞以使得进行有限稀释克隆(维持/克隆选择阶段)。在产生克隆群后，筛选表达外源多肽的克隆并扩增(克隆筛选和扩增阶段)。筛选后，使具有所期望活性的克隆在更大规模上生长以用于生产目的(大规模扩大阶段)，或使其进行长期保存(例如低温保存)(图1)。

在所述方法的一个实施方案中，将细胞和DNA悬浮于电穿孔缓冲液中，转移至电穿孔室，并进行一系列的电脉冲。在电穿孔后，将细胞转移至培养基并培养过夜(恢复阶段)。第二天，将1.6g/L G418添加至培养物，并将细胞培养14天以杀伤其中质粒DNA未整合的细胞(选择阶段)。14天后，将细胞以每孔0.3细胞的计算密度转移至96孔板并在较低的G418浓度存在下再培养14天(维持/克隆选择阶段)。14天后，通过免疫测定筛选各孔的条件化培养基以鉴定生产高抗体效价的克隆(克隆筛选&扩增阶段)。将所得克隆在摇瓶中扩增以确认生产率(大规模扩大阶段)并产生用于通过低温保存库存(banking)的细胞(图1)。

II.电穿孔

电穿孔

某些实施方案涉及使用电穿孔以促进一种或更多种核酸分子进入宿主细胞。

如本文所使用的，“电穿孔”或“电加载(electroloading)”指的是将电流或电场施加至细胞以促进核酸分子进入细胞。本领域技术人员将理解，本发明包括电穿孔的任何方法和技术。

在本发明的某些实施方案中，可以按照以下描述的进行电加载，美国专利号5,612,207(通过引用明确并入本文)、美国专利号5,720,921(通过引用明确并入本文)、美国专利号6,074,605(通过引用明确并入本文)；美国专利号6,090,617(通过引用明确并入本文)；美国专利号6,485,961(通过引用明确并入本文)；美国专利号7,029,916(通过引用明确并入本文)、美国专利号7,141,425(通过引用明确并入本文)、美国专利号7,186,559(通过引用明确并入本文)、美国专利号7,771,984(通过引用明确并入本文)以及美国公开号2011/0065171(通过引用明确并入本文)。

在本发明的上下文中可使用的用于电加载的另一些方法和装置也描述在，例如，公开的PCT申请号WO 03/018751和WO 2004/031353；美国专利申请号10/781,440、10/080,272和10/675,592；以及美国专利号6,773,669、6,090,617、6,617,154中，所有这些均通过引用并入。

在本发明的某些实施方案中，可按照2002年8月21日提交的美国专利申请序列号10/225,446中所描述的进行电穿孔，通过引用将其全部公开内容明确并入本文。

在本发明的另一些实施方案中，使用MaxCyte

MaxCyte

或MaxCyte

流式电穿孔仪器进行流式电穿孔。

要求保护的通过电穿孔(优选流式电穿孔)转染细胞的方法能够实现大于40％、大于50％及大于60％、70％、80％或90％(或可来源于其中的任何范围)的转染效率。可通过表达基因产物的细胞的百分比或由基因表达的产物的分泌水平来测量转染效率。在电穿孔过程中以及电穿孔过程之后，细胞维持高的生存力。生存力通常大于50％或更高。电穿孔细胞的生存力是开始未电穿孔群或转染了对照构建体的电穿孔群之生存力的至多或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(或可来源于其中的任何范围)。

在一些实施方案中，本方法使用流式电穿孔设备以用于颗粒悬浮液的电刺激，所述设备包含具有一个或更多个流入口、一个或更多个流出口和一个或更多个流道的流式电穿孔单元组件(cell assembly)，所述流道由两个或更多个壁构成，所述流道被进一步被配置为接收和暂时容纳来自流入口的悬浮液中颗粒的持续流；以及相对于所述流道设置的成对电极，以使得每个电极形成所述流道的至少一个壁，所述电极还包括使电极与电能来源电联通，由此流过所述流道的颗粒的悬浮液可经受在电极之间形成的电场。

在一些实施方案中，本方法使用流式电穿孔来克服样品尺寸的限制。用这种方法，使细胞悬浮液通过包含在流动池(优选一次性的)中的平行棒电极。应该理解的是，不同结构的流动池都可用于本方法。在该通过期间，使细胞经受具有预定特征的电脉冲。例如，用于制备样品细胞的具体配置为：电压，750V；脉冲宽度，650微秒；脉冲之间的时间，100微秒；在一个脉冲串(burst)中有2个双相脉冲；脉冲串之间的时间，12秒；流量，0.05mL/秒。然后分子或目的分子可随着浓度和/或电梯度扩散进细胞中。本发明任选地能够使细胞经受一定范围的电场强度。

本流式电穿孔法的另一个优点是可以转染大群细胞的速度。例如，可通过使样品在少于5小时，优选少于4小时且最优选少于3小时以及最优选少于2小时内进行电穿孔来通过电穿孔转染淋巴细胞群。电穿孔的时间是样品通过流式电穿孔过程处理的时间。在某些实施方案中，使用流式电穿孔在30分钟或更短的时间内转染1E10细胞。在另一些实施方案中，使用流式电穿孔在30分钟或60分钟或更短的时间内转染2E11细胞。

对于流式电穿孔，通过将流动池与具有必要的流体和样品的容器中的溶液和细胞悬浮液连接而起始该过程。通过向电穿孔系统提供所需的指令将预充液(Primingsolution)(盐水)和细胞悬浮液引入，其控制着泵和夹管阀(pinch valves)的运行。当细胞经过电极之间的流道时，施加选择了电压、持续时间和频率的电脉冲。将产物和废液收集在指定的容器中。

用户将所期望的电压及其他参数输入至本发明的流式电穿孔系统中。如上所述，可任选地使用一系列的设置。计算机与塔中的电子元件通讯以将电容器组充电至所期望的电压。然后由适当的开关操纵电压，之后将其递送至流道以产生电场(开关提供交替的脉冲或脉冲串以使由延长暴露于电场所带来的电极损耗最小化)。由操作者根据持续时间和频率参数设置将电压递送至本发明的流式电穿孔系统中。现在详细地描述本发明的流式电穿孔系统。

可以通过，例如使电穿孔室与容器中的溶液和细胞悬浮液流体连通(例如，通过管)来起始流式电穿孔过程，其可以在无菌或灭菌环境中进行。可使用一个或更多个泵、真空、阀、改变电穿孔室内部的气压或体积的其他机械装置以及其组合将细胞悬浮液和/或其他试剂引入至电穿孔室，这可导致细胞悬浮液和/或其他试剂以期望的时间和期望的速率流入电穿孔室中。如果一部分细胞悬浮液和/或其他试剂位于电穿孔室中，则具有期望的电压、持续时间和/或间隔的电脉冲被施加至细胞悬浮液和/或其他试剂。在电穿孔后，可使用一个或更多个泵、真空、阀、改变电穿孔室内部的位移、压力或体积的其他电力、机械、气动或微流体装置以及其组合将经处理的细胞悬浮液和/或其他试剂从电穿孔室移除。在某些实施方案中，重力或手动输送可用于移动样品或经处理的样品流入或流出电穿孔室。如果需要的话，可将新的细胞悬浮液和/或其他试剂引入至电穿孔室中。可以独立于还未被电穿孔的样品来收集电穿孔的样品。通过与例如电子电路(例如，提供电脉冲的电子电路)、泵、真空、阀、其组合以及实现和控制样品流进入和流出电穿孔室的其他组件偶联的计算机来暂时协调前述一系列事件。作为一个实例，电穿孔过程可由计算机来实施，包括由操作员通过监视器上的图形用户界面和/或键盘来实施。合适的阀的实例包括夹管阀、蝶阀和/或球阀。合适的泵的实例包括离心泵或正位移泵。

作为一个实例，流式电穿孔装置可包含由垫片隔开的至少两个电极，其中垫片与至少两个电极限定了腔。在一些实施方案中，电穿孔室还可包含穿过垫片的至少三个端口(port)，其中第一端口用于样品流入室，第二端口用于经处理的样品流出室，而第三端口用于非样品流体流入或流出室。在一些实施方案中，当样品流入室时，非样品流体流出室，而当经处理的样品流出室时非样品流体流入室。作为另一个实例，流式电穿孔装置可包含具有顶部和底部部分的电穿孔室，其包含至少两个平行的电极，所述室形成于这两个电极之间并且在电穿孔室的底部部分中具有两个室端口以及在电穿孔室的顶部部分中具有两个室端口。这样的装置还可包含通过室底部部分中之第一室端口与电穿孔室流体连通的至少一个样品容器，并且电穿孔室可通过室顶部部分的第二室端口与所述样品容器流体连通，从而形成第一流体通路。此外，至少一个产品容器可通过室底部部分中的第三室端口与电穿孔室流体连通，并且电穿孔室可通过室顶部部分中的第四室端口与所述产品容器流体连通，从而形成第二流体通路。在一些实施方案中，可使用单个端口的电穿孔室。在另一些实施方案中，可使用电极、垫片、端口和容器的多种其他合适的组合。电穿孔室可包含约1至10mL的内部体积；然而，在另一些实施方案中，电穿孔室可包含更小的内部体积(例如，0.75mL、0.5mL、0.25mL或更小)或者更大的内部体积(例如，15mL、20mL、25mL或更大)。在一些实施方案中，电穿孔室和相关的组件可以是一次性的(例如，医用等级VI材料)，例如PVC袋、PVC管、连接器、硅泵管(silicone pump tubing)等。

任何数目的容器(例如，1、2、3、4、5、6或更多)都可与电穿孔室流体连通。所述容器可以是可收缩、可扩展或固定体积的容器。例如，第一容器(例如，样品来源或样品容器)可包含细胞悬浮液并且可以包含或不包含在电穿孔期间进入细胞悬浮液之细胞中的物质。如果不包含所述物质，则可包括包含该物质的第二容器以使得所述物质在进入电穿孔室之前在管线内(inline)混合或在电穿孔室中混合。在另一种配置中，可连接另一个容器，所述容器可容纳将被丢弃的流体。一个或更多个额外容器可用作经处理的样品或产品的容器。经处理的样品或产物的容器将保留细胞或电穿孔过程产生的其他产物。此外，一个或更多个额外容器可包含多种非样品流体或气体，所述非样品流体或气体可用于将样品分离成离散体积或单位体积。非样品流体或气体的容器可通过第三端口和/或第四端口与电穿孔室流体连通。非样品流体或气体的容器可以被并入经处理样品的容器或样品的容器中(例如，非样品流体的容器可包含一部分经处理样品的容器或样品的容器)；因此，在样品的处理过程中，非样品流体或气体可以从经处理样品的容器传送至另一个容器(其可包括样品的容器)中。非样品流体或气体的容器可以被并入室，只要非样品流体或气体的压缩不影响电穿孔即可。本发明的另一些方面可包括偶联至样品的容器并且可向室提供试剂或其他样品的其他容器。

在某些方面，电穿孔期间的细胞密度是受控变量。电穿孔期间的细胞密度可能会变化或根据但不限于以下而变化：细胞类型、期望的电穿孔效率或期望的所得电穿孔细胞的生存力。在某些方面，整个电穿孔过程中细胞密度是恒定的。在另一些方面，在电穿孔过程期间细胞密度是变化的。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁴细胞/mL至(y)×10⁴，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁵细胞/mL至(y)×10⁵，其中y是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁶细胞/mL至(y)×10⁶，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至(y)×10⁷，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10或者可来源于其中的任何范围。在另一些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至1×10⁸细胞/mL、1×10⁸细胞/mL至1×10⁹细胞/mL、1×10⁹细胞/mL至1×10¹⁰细胞/mL、1×10¹⁰细胞/mL至1×10¹¹细胞/mL或1×10¹¹细胞/mL至1×10¹²细胞/mL。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为(y)×10⁶，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或者可来源于其中的任何范围。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为(y)×10¹⁰，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000(或可来源于其中的任何范围)。

在某些方面，在电穿孔期间的细胞密度是受控变量。电穿孔期间，细胞的细胞密度可能会变化或根据但不限于以下而变化：细胞类型、期望的电穿孔效率或期望的所得电穿孔细胞的生存力。在某些方面，在整个电穿孔过程中细胞密度是恒定的。在另一些方面，在电穿孔过程期间细胞密度是变化的。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁴细胞/mL至(y)×10⁴，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁵细胞/mL至(y)×10⁵，其中y是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁶细胞/mL至(y)×10⁶，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至(y)×10⁷，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至1×10⁸细胞/mL、1×10⁸细胞/mL至1×10⁹细胞/mL、1×10⁹细胞/mL至1×10¹⁰细胞/mL、1×10¹⁰细胞/mL至1×10¹¹细胞/mL或1×10¹¹细胞/mL至1×10¹²细胞/mL。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为(y)×10⁶，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为(y)×10¹⁰，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000(或可来源于其中的任何范围)。

在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁴细胞/mL至(y)×10⁴，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9、或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁵细胞/mL至(y)×10⁵，其中y是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁶细胞/mL至(y)×10⁶，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至(y)×10⁷，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至1×10⁸细胞/mL、1×10⁸细胞/mL至1×10⁹细胞/mL、1×10⁹细胞/mL至1×10¹⁰细胞/mL、1×10¹⁰细胞/mL至1×10¹¹细胞/mL或1×10¹¹细胞/mL至1×10¹²细胞/mL(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为(y)×10e6，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为(y)×10¹⁰，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000(或可来源于其中的任何范围)。

在某些实施方案中，可以对任何原核或真核细胞进行电穿孔。在一些方面，电穿孔涉及人细胞的电穿孔。在另一些方面，电穿孔涉及动物细胞的电穿孔。在某些方面，电穿孔涉及细胞系或杂交细胞类型的电穿孔。在一些方面，细胞或被电穿孔的细胞是癌细胞、肿瘤细胞或无限增殖化细胞。在一些情况下，肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系是被诱导的，而在另一些情况下，肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系自然地进入其各自的状态或状况。在某些方面，被电穿孔的细胞或细胞系可以是A549、B细胞、B16、BHK-21、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUXB11 COS-1、Cos-7、CV-1、树突细胞、DLD-1、胚胎干(ES)细胞或衍生物、H1299、HEK、293、293T、293FT、Hep G2、造血干细胞、HOS、Huh-7、诱导性多潜能干(iPS)细胞或衍生物、Jurkat、K562、L5278Y、LNCaP、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、间充质细胞、Min-6、单核细胞、Neuro2a、NIH 3T3、NIH3T3L1、NK细胞、NS0、Panc-1、PC12、PC-3、外周血细胞、浆细胞、原代成纤维细胞、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-MES-1、SK-N-SH、SL3、SW403、刺激触发获得多潜能性(Stimulus-triggeredAcquisition of Pluripotency,STAP)细胞或衍生物SW403、T细胞、THP-1、肿瘤细胞、U2OS、U937或Vero细胞。

在某些实施方案中，细胞是本领域中已知难以转染的细胞。这样的细胞是本领域中已知的，包括例如，原代细胞、昆虫细胞、SF9细胞、Jurkat细胞、CHO细胞、干细胞、缓慢分裂细胞和非分裂细胞。

在一些情况下，在一定量的时间内可电穿孔一定数目的细胞。考虑到所描述平台的灵活性、一致性和再现性，在少于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒(或可来源于其中的任何范围)内，可电穿孔至多或大于约(y)×10⁴、(y)×10⁵、(y)×10⁶、(y)×10⁷、(y)×10⁸、(y)×10⁹、(y)×10¹⁰、(y)×10¹¹、(y)×10¹²、(y)×10¹³、(y)×10¹⁴或(y)×10¹⁵个细胞(或可来源于其中的任何范围)，其中y可以是以下的任何值：1、2、3、4、5、6、7、8或9(或可来源于其中的任何范围)。在另一些情况下，在少于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分钟(或可来源于其中的任何范围)内，可电穿孔至多或大于约(y)×10⁴、(y)×10⁵、(y)×10⁶、(y)×10⁷、(y)×10⁸、(y)×10⁹、(y)×10¹⁰、(y)×10¹¹、(y)×10¹²、(y)×10¹³、(y)×10¹⁴或(y)×10¹⁵个细胞(或可来源于其中的任何范围)，其中y可以是以下的任何值：1、2、3、4、5、6、7、8或9(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时(或可来源于其中的任何范围)内，可电穿孔至多或大于约(y)×10⁴、(y)×10⁵、(y)×10⁶、(y)×10⁷、(y)×10⁸、(y)×10⁹、(y)×10¹⁰、(y)×10¹¹、(y)×10¹²、(y)×10¹³、(y)×10¹⁴或(y)×10¹⁵个细胞(或可来源于其中的任何范围)，其中y可以是以下的任何值：1、2、3、4、5、6、7、8或9(或可来源于其中的任何范围)。

表达式“(y)×10^e”理解为意指可取任何数值的变量“y”乘以被升至指数值e的10。例如，(y)×10⁴，当y是2时，应理解为意指2×10⁴，这相当于2×10,000，等于20,000。(y)×10e4也可以写为(y)＊10e4或(y)×10⁴或(y)＊10⁴。

细胞或培养基的体积可根据待电穿孔的细胞的量、待筛选的细胞的数目、待筛选的细胞的类型、将要产生的蛋白质的类型、所期望的蛋白质的量，细胞生存力以及与所期望的细胞浓度相关的某些细胞特征而变化。在方法和组合物中可使用的体积的实例包括但不限于：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000mL或L(或可来源于其中的任何范围)，以及可来源于其中的任何范围。考虑将可容纳这样体积的容器用于本文所述的实施方案中。这样的容器包括但不限于：细胞培养皿、培养皿、烧瓶、生物袋、生物容器、生物反应器或瓮(vat)。特别考虑用于大规模体积的容器，例如能够容纳大于10L或更大的那些。在某些实施方案中，使用100L或更大的体积。

III.细胞培养

A.宿主细胞

如本文所使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括新鲜分离的细胞和离体培养的活化的或扩增的细胞两者。所有这些术语还包括其后代，其后代是任何和所有接下来的代。应当理解的是，由于有意或无意的突变，所有后代可以不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”指的是原核细胞或真核细胞，并且其包括能够复制载体或表达由载体编码的异源基因之任何可转化的生物体。宿主细胞可以用作并且已经用作为载体或病毒的接受者。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指的是通过其将外源核酸(例如重组的蛋白质编码序列)转移或引入宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。

在某些实施方案中，电穿孔后的细胞培养可在任何原核细胞或真核细胞上进行。在一些方面，细胞培养涉及人细胞的细胞培养。在另一些方面，细胞培养涉及动物细胞的细胞培养。在某些方面，细胞培养涉及细胞系或杂交细胞类型的细胞培养。在一些方面，细胞或被培养的细胞是癌细胞、肿瘤细胞或无限增殖化细胞。在一些情况下，肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系是被诱导的，而在另一些情况下，肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系自然地进入其各自的状态或状况。在某些方面，培养的细胞或细胞系可以是A549、B细胞、B16、BHK-21、C2C12、C6、CaCo-2、CAP、CAP-T、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、COS-1、Cos-7、CV-1、树突细胞、DLD-1、胚胎干(ES)细胞或衍生物、H1299、HEK、293、293T、293FT、Hep G2、造血干细胞、HOS、Huh-7、诱导性多潜能干(iPS)细胞或衍生物、Jurkat、K562、L5278Y、LNCaP、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、间充质细胞、Min-6、单核细胞、Neuro2a、NIH 3T3、NIH3T3L1、NK细胞、NS0、Panc-1、PC12、PC-3、外周血细胞、浆细胞、原代成纤维细胞、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-MES-1、SK-N-SH、SL3、SW403、刺激触发获得多潜能性(STAP)细胞或衍生物SW403、T细胞、THP-1、肿瘤细胞、U2OS、U937或Vero细胞。

B.可选择的试剂

在某些方面，在电穿孔后，通过负选择来选择已经将电穿孔构建体内在化的细胞。在另一些方面，在电穿孔后，通过正选择来选择已经将电穿孔构建体内在化的细胞。在一些方面，选择包括使细胞暴露于将危害在电穿孔期间未获得选择抗性基因或未表达选择抗性基因的细胞的生存力之浓度的选择剂。在一些方面，选择包括使细胞暴露于条件致死浓度的选择剂。在某些方面，选择剂或化合物是抗生素。在另一些方面，选择剂是单独或组合的G418(也称为遗传霉素和G418硫酸盐)、嘌呤霉素、博来霉素、潮霉素、腐草霉素或杀稻瘟素。在某些方面，选择剂的条件致死浓度为0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5mg/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L或100g/L至500g/L(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，选择剂的条件致死浓度为(y)g/L，其中“y”可以是任何值，包括但不限于：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100(或可来源于其中的任何范围)。在一些实施方案中，选择剂以以下的条件致死浓度存在于培养基中：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10g/L(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，G418的浓度为约0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5mg/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L或100g/L至500g/L(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，G418的浓度为(y)g/L、其中“y”可以是任何值，包括但不限于：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100(或可来源于其中的任何范围)。在一些实施方案中，G418以以下的浓度存在于培养基中：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10g/L(或可来源于其中的任何范围)。

在某些方面，选择剂是G418并且以条件致死浓度存在。在一些实施方案中，所述条件致死浓度为至少0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1或3.2mg/mL。在另一些实施方案中，G418的条件致死浓度为至多1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7mg/mL。在另一些实施方案中，G418的条件致死浓度为1mg/mL至1.5mg/mL、1mg/mL至1.75mg/mL、1mg/mL至2mg/mL、1mg/mL至2.25mg/mL、1mg/mL至2.5mg/mL、1mg/mL至2.75mg/mL、1mg/mL至3mg/mL、1mg/mL至3.25mg/mL、1mg/mL至3.5mg/mL、1mg/mL至4mg/mL、1mg/mL至4.5mg/mL、1mg/mL至5mg/mL、1mg/mL至5.5mg/mL、1.25mg/mL至1.5mg/mL、1.25mg/mL至1.75mg/mL、1.25mg/mL至2mg/mL、1.25mg/mL至2.25mg/mL、1.25mg/mL至2.5mg/mL、1.25mg/mL至2.75mg/mL、1.25mg/mL至3mg/mL、1.25mg/mL至3.25mg/mL、1.25mg/mL至3.5mg/mL、1.25mg/mL至4mg/mL、1.25mg/mL至4.5mg/mL、1.25mg/mL至5mg/mL、1.25mg/mL至5.5mg/mL、1.5mg/mL至1.75mg/mL、1.5mg/mL至2mg/mL、1.5mg/mL至2.25mg/mL、1.5mg/mL至2.5mg/mL、1.5mg/mL至2.75mg/mL、1.5mg/mL至3mg/mL、1.5mg/mL至3.25mg/mL、1.5mg/mL至3.5mg/mL、1.5mg/mL至4mg/mL、1.5mg/mL至4.5mg/mL、1.5mg/mL至5mg/mL、1.5mg/mL至5.5mg/mL、1.75mg/mL至2mg/mL、1.75mg/mL至2.25mg/mL、1.75mg/mL至2.5mg/mL、1.75mg/mL至2.75mg/mL、1.75mg/mL至3mg/mL、1.75mg/mL至3.25mg/mL、1.75mg/mL至3.5mg/mL、1.75mg/mL至4mg/mL、1.75mg/mL至4.5mg/mL、1.75mg/mL至5mg/mL、1.75mg/mL至5.5mg/mL、2mg/mL至2.25mg/mL、2mg/mL至2.5mg/mL、2mg/mL至2.75mg/mL、2mg/mL至3mg/mL、2mg/mL至3.25mg/mL、2mg/mL至3.5mg/mL、2mg/mL至4mg/mL、2mg/mL至4.5mg/mL、2mg/mL至5mg/mL、2mg/mL至5.5mg/mL、2.25mg/mL至2.5mg/mL、2.25mg/mL至2.75mg/mL、2.25mg/mL至3mg/mL、2.25mg/mL至3.25mg/mL、2.25mg/mL至3.5mg/mL、2.25mg/mL至4mg/mL、2.25mg/mL至4.5mg/mL、2.25mg/mL至5mg/mL、2.25mg/mL至5.5mg/mL、2.5mg/mL至2.75mg/mL、2.5mg/mL至3mg/mL、2.5mg/mL至3.25mg/mL、2.5mg/mL至3.5mg/mL、2.5mg/mL至4mg/mL、2.5mg/mL至4.5mg/mL、2.5mg/mL至5mg/mL、2.5mg/mL至5.5mg/mL、2.75mg/mL至3mg/mL、2.75mg/mL至3.25mg/mL、2.75mg/mL至3.5mg/mL、2.75mg/mL至4mg/mL、2.75mg/mL至4.5mg/mL、2.75mg/mL至5mg/mL或2.75mg/mL至5.5mg/mL。

在某些方面，选择剂是潮霉素并且以条件致死浓度存在。在一些实施方案中，所述条件致死浓度为至少0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1或3.2mg/mL。在另一些实施方案中，潮霉素的条件致死浓度为至多1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7mg/mL。在另一些实施方案中，潮霉素的条件致死浓度为1mg/mL至1.5mg/mL、1mg/mL至1.75mg/mL、1mg/mL至2mg/mL、1mg/mL至2.25mg/mL、1mg/mL至2.5mg/mL、1mg/mL至2.75mg/mL、1mg/mL至3mg/mL、1mg/mL至3.25mg/mL、1mg/mL至3.5mg/mL、1mg/mL至4mg/mL、1mg/mL至4.5mg/mL、1mg/mL至5mg/mL、1mg/mL至5.5mg/mL、1.25mg/mL至1.5mg/mL、1.25mg/mL至1.75mg/mL、1.25mg/mL至2mg/mL、1.25mg/mL至2.25mg/mL、1.25mg/mL至2.5mg/mL、1.25mg/mL至2.75mg/mL、1.25mg/mL至3mg/mL、1.25mg/mL至3.25mg/mL、1.25mg/mL至3.5mg/mL、1.25mg/mL至4mg/mL、1.25mg/mL至4.5mg/mL、1.25mg/mL至5mg/mL、1.25mg/mL至5.5mg/mL、1.5mg/mL至1.75mg/mL、1.5mg/mL至2mg/mL、1.5mg/mL至2.25mg/mL、1.5mg/mL至2.5mg/mL、1.5mg/mL至2.75mg/mL、1.5mg/mL至3mg/mL、1.5mg/mL至3.25mg/mL、1.5mg/mL至3.5mg/mL、1.5mg/mL至4mg/mL、1.5mg/mL至4.5mg/mL、1.5mg/mL至5mg/mL、1.5mg/mL至5.5mg/mL、1.75mg/mL至2mg/mL、1.75mg/mL至2.25mg/mL、1.75mg/mL至2.5mg/mL、1.75mg/mL至2.75mg/mL、1.75mg/mL至3mg/mL、1.75mg/mL至3.25mg/mL、1.75mg/mL至3.5mg/mL、1.75mg/mL至4mg/mL、1.75mg/mL至4.5mg/mL、1.75mg/mL至5mg/mL、1.75mg/mL至5.5mg/mL、2mg/mL至2.25mg/mL、2mg/mL至2.5mg/mL、2mg/mL至2.75mg/mL、2mg/mL至3mg/mL、2mg/mL至3.25mg/mL、2mg/mL至3.5mg/mL、2mg/mL至4mg/mL、2mg/mL至4.5mg/mL、2mg/mL至5mg/mL、2mg/mL至5.5mg/mL、2.25mg/mL至2.5mg/mL、2.25mg/mL至2.75mg/mL、2.25mg/mL至3mg/mL、2.25mg/mL至3.25mg/mL、2.25mg/mL至3.5mg/mL、2.25mg/mL至4mg/mL、2.25mg/mL至4.5mg/mL、2.25mg/mL至5mg/mL、2.25mg/mL至5.5mg/mL、2.5mg/mL至2.75mg/mL、2.5mg/mL至3mg/mL、2.5mg/mL至3.25mg/mL、2.5mg/mL至3.5mg/mL、2.5mg/mL至4mg/mL、2.5mg/mL至4.5mg/mL、2.5mg/mL至5mg/mL、2.5mg/mL至5.5mg/mL、2.75mg/mL至3mg/mL、2.75mg/mL至3.25mg/mL、2.75mg/mL至3.5mg/mL、2.75mg/mL至4mg/mL、2.75mg/mL至4.5mg/mL、2.75mg/mL至5mg/mL或2.75mg/mL至5.5mg/mL。

在某些方面，选择剂是博来霉素并且以条件致死浓度存在。在一些实施方案中，所述条件致死浓度为至少0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1或3.2mg/mL。在另一些实施方案中，博来霉素的条件致死浓度为至多1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7mg/mL。在另一些实施方案中，博来霉素的条件致死浓度为1mg/mL至1.5mg/mL、1mg/mL至1.75mg/mL、1mg/mL至2mg/mL、1mg/mL至2.25mg/mL、1mg/mL至2.5mg/mL、1mg/mL至2.75mg/mL、1mg/mL至3mg/mL、1mg/mL至3.25mg/mL、1mg/mL至3.5mg/mL、1mg/mL至4mg/mL、1mg/mL至4.5mg/mL、1mg/mL至5mg/mL、1mg/mL至5.5mg/mL、1.25mg/mL至1.5mg/mL、1.25mg/mL至1.75mg/mL、1.25mg/mL至2mg/mL、1.25mg/mL至2.25mg/mL、1.25mg/mL至2.5mg/mL、1.25mg/mL至2.75mg/mL、1.25mg/mL至3mg/mL、1.25mg/mL至3.25mg/mL、1.25mg/mL至3.5mg/mL、1.25mg/mL至4mg/mL、1.25mg/mL至4.5mg/mL、1.25mg/mL至5mg/mL、1.25mg/mL至5.5mg/mL、1.5mg/mL至1.75mg/mL、1.5mg/mL至2mg/mL、1.5mg/mL至2.25mg/mL、1.5mg/mL至2.5mg/mL、1.5mg/mL至2.75mg/mL、1.5mg/mL至3mg/mL、1.5mg/mL至3.25mg/mL、1.5mg/mL至3.5mg/mL、1.5mg/mL至4mg/mL、1.5mg/mL至4.5mg/mL、1.5mg/mL至5mg/mL、1.5mg/mL至5.5mg/mL、1.75mg/mL至2mg/mL、1.75mg/mL至2.25mg/mL、1.75mg/mL至2.5mg/mL、1.75mg/mL至2.75mg/mL、1.75mg/mL至3mg/mL、1.75mg/mL至3.25mg/mL、1.75mg/mL至3.5mg/mL、1.75mg/mL至4mg/mL、1.75mg/mL至4.5mg/mL、1.75mg/mL至5mg/mL、1.75mg/mL至5.5mg/mL、2mg/mL至2.25mg/mL、2mg/mL至2.5mg/mL、2mg/mL至2.75mg/mL、2mg/mL至3mg/mL、2mg/mL至3.25mg/mL、2mg/mL至3.5mg/mL、2mg/mL至4mg/mL、2mg/mL至4.5mg/mL、2mg/mL至5mg/mL、2mg/mL至5.5mg/mL、2.25mg/mL至2.5mg/mL、2.25mg/mL至2.75mg/mL、2.25mg/mL至3mg/mL、2.25mg/mL至3.25mg/mL、2.25mg/mL至3.5mg/mL、2.25mg/mL至4mg/mL、2.25mg/mL至4.5mg/mL、2.25mg/mL至5mg/mL、2.25mg/mL至5.5mg/mL、2.5mg/mL至2.75mg/mL、2.5mg/mL至3mg/mL、2.5mg/mL至3.25mg/mL、2.5mg/mL至3.5mg/mL、2.5mg/mL至4mg/mL、2.5mg/mL至4.5mg/mL、2.5mg/mL至5mg/mL、2.5mg/mL至5.5mg/mL、2.75mg/mL至3mg/mL、2.75mg/mL至3.25mg/mL、2.75mg/mL至3.5mg/mL、2.75mg/mL至4mg/mL、2.75mg/mL至4.5mg/mL、2.75mg/mL至5mg/mL或2.75mg/mL至5.5mg/mL。

在某些方面，选择剂是嘌呤霉素并且以条件致死浓度存在。在一些实施方案中，所述条件致死浓度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40或45μg/mL。在另一些实施方案中，嘌呤霉素的条件致死浓度为至多11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或55μg/mL。在另一些实施方案中，嘌呤霉素的条件致死浓度为5μg/mL至10μg/mL、5μg/mL至15μg/mL、5μg/mL至20μg/mL、5μg/mL至25μg/mL、5μg/mL至30μg/mL、5μg/mL至35μg/mL、5μg/mL至40μg/mL、5μg/mL至45μg/mL、5μg/mL至50μg/mL、5μg/mL至55μg/mL、10μg/mL至15μg/mL、10μg/mL至20μg/mL、10μg/mL至25μg/mL、10μg/mL至30μg/mL、10μg/mL至35μg/mL、10μg/mL至40μg/mL、10μg/mL至45μg/mL、10μg/mL至50μg/mL、10μg/mL至55μg/mL、15μg/mL至20μg/mL、15μg/mL至25μg/mL、15μg/mL至30μg/mL、15μg/mL至35μg/mL、15μg/mL至40μg/mL、15μg/mL至45μg/mL、15μg/mL至50μg/mL、15μg/mL至55μg/mL、20μg/mL至25μg/mL、20μg/mL至30μg/mL、20μg/mL至35μg/mL、20μg/mL至40μg/mL、20μg/mL至45μg/mL、20μg/mL至50μg/mL、20μg/mL至55μg/mL、25μg/mL至30μg/mL、25μg/mL至35μg/mL、25μg/mL至40μg/mL、25μg/mL至45μg/mL、25μg/mL至50μg/mL、25μg/mL至55μg/mL、30μg/mL至40μg/mL、30μg/mL至50μg/mL、30μg/mL至55μg/mL或40μg/mL至55μg/mL。

在某些方面，选择剂是杀稻瘟素并且以条件致死浓度存在。在一些实施方案中，所述条件致死浓度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140或160μg/mL。在另一些实施方案中，杀稻瘟素的条件致死浓度为至多15、20、30、40、50、60、80、100、120、140或160μg/mL。在另一些实施方案中，杀稻瘟素的条件致死浓度为5μg/mL至10μg/mL、5μg/mL至20μg/mL、5μg/mL至30μg/mL、5μg/mL至40μg/mL、5μg/mL至50μg/mL、5μg/mL至60μg/mL、5μg/mL至70μg/mL、5μg/mL至80μg/mL、5μg/mL至90μg/mL、5μg/mL至100μg/mL、5μg/mL至120μg/mL、5μg/mL至140μg/mL、5μg/mL至160μg/mL、10μg/mL至20μg/mL、10μg/mL至30μg/mL、10μg/mL至40μg/mL、10μg/mL至50μg/mL、10μg/mL至60μg/mL、10μg/mL至70μg/mL、10μg/mL至80μg/mL、10μg/mL至90μg/mL、10μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至120μg/mL、10μg/mL至140μg/mL、10μg/mL至160μg/mL、20μg/mL至30μg/mL、20μg/mL至40μg/mL、20μg/mL至50μg/mL、20μg/mL至60μg/mL、20μg/mL至70μg/mL、20μg/mL至80μg/mL、20μg/mL至90μg/mL、20μg/mL至100μg/mL、20μg/mL至120μg/mL、20μg/mL至140μg/mL、20μg/mL至160μg/mL、30μg/mL至40μg/mL、30μg/mL至50μg/mL、30μg/mL至60μg/mL、30μg/mL至70μg/mL、30μg/mL至80μg/mL、30μg/mL至90μg/mL、30μg/mL至100μg/mL、30μg/mL至120μg/mL、30μg/mL至140μg/mL、30μg/mL至160μg/mL、40μg/mL至50μg/mL、40μg/mL至60μg/mL、40μg/mL至70μg/mL、40μg/mL至80μg/mL、40μg/mL至90μg/mL、40μg/mL至100μg/mL、40μg/mL至120μg/mL、40μg/mL至140μg/mL、40μg/mL至160μg/mL、50μg/mL至60μg/mL、50μg/mL至70μg/mL、50μg/mL至80μg/mL、50μg/mL至90μg/mL、50μg/mL至100μg/mL、50μg/mL至120μg/mL、50μg/mL至140μg/mL、50μg/mL至160μg/mL、60μg/mL至70μg/mL、60μg/mL至80μg/mL、60μg/mL至90μg/mL、60μg/mL至100μg/mL、60μg/mL至120μg/mL、60μg/mL至140μg/mL、60μg/mL至160μg/mL、70μg/mL至80μg/mL、70μg/mL至90μg/mL、70μg/mL至100μg/mL、70μg/mL至120μg/mL、70μg/mL至140μg/mL、70μg/mL至160μg/mL、80μg/mL至90μg/mL、80μg/mL至100μg/mL、80μg/mL至120μg/mL、80μg/mL至140μg/mL、80μg/mL至160μg/mL、90μg/mL至160μg/mL、100μg/mL至160μg/mL或120μg/mL至160μg/mL。

在某些方面，选择剂是腐草霉素并且以条件致死浓度存在。在一些实施方案中，所述条件致死浓度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200μg/mL。在另一些实施方案中，腐草霉素的条件致死浓度为至多50、75、100、125、200、225、250或300μg/mL。在另一些实施方案中，腐草霉素的条件致死浓度为15μg/mL至25μg/mL、15μg/mL至75μg/mL、15μg/mL至100μg/mL、15μg/mL至125μg/mL、15μg/mL至150μg/mL、15μg/mL至175μg/mL、15μg/mL至200μg/mL、15μg/mL至225μg/mL、15μg/mL至250μg/mL、15μg/mL至300μg/mL、25μg/mL至75μg/mL、25μg/mL至100μg/mL、25μg/mL至125μg/mL、25μg/mL至150μg/mL、25μg/mL至175μg/mL、25μg/mL至200μg/mL、25μg/mL至225μg/mL、25μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至300μg/mL、50μg/mL至75μg/mL、50μg/mL至100μg/mL、50μg/mL至125μg/mL、50μg/mL至150μg/mL、50μg/mL至175μg/mL、50μg/mL至200μg/mL、50μg/mL至225μg/mL、50μg/mL至250μg/mL、50μg/mL至300μg/mL、60μg/mL至75μg/mL、60μg/mL至100μg/mL、60μg/mL至125μg/mL、60μg/mL至150μg/mL、60μg/mL至175μg/mL、60μg/mL至200μg/mL、60μg/mL至225μg/mL、60μg/mL至250μg/mL、60μg/mL至300μg/mL、80μg/mL至100μg/mL、80μg/mL至125μg/mL、80μg/mL至150μg/mL、80μg/mL至175μg/mL、80μg/mL至200μg/mL、80μg/mL至225μg/mL、80μg/mL至250μg/mL、80μg/mL至300μg/mL、100μg/mL至125μg/mL、100μg/mL至150μg/mL、100μg/mL至175μg/mL、100μg/mL至200μg/mL、100μg/mL至225μg/mL、100μg/mL至250μg/mL、100μg/mL至300μg/mL、120μg/mL至150μg/mL、120μg/mL至175μg/mL、120μg/mL至200μg/mL、120μg/mL至225μg/mL、120μg/mL至250μg/mL、120μg/mL至300μg/mL、140μg/mL至175μg/mL、140μg/mL至200μg/mL、140μg/mL至225μg/mL、140μg/mL至250μg/mL、140μg/mL至300μg/mL、160μg/mL至175μg/mL、160μg/mL至200μg/mL、160μg/mL至225μg/mL、160μg/mL至250μg/mL、160μg/mL至300μg/mL、180μg/mL至200μg/mL、180μg/mL至225μg/mL、180μg/mL至250μg/mL、180μg/mL至300μg/mL、200μg/mL至225μg/mL、200μg/mL至250μg/mL、200μg/mL至300μg/mL、220μg/mL至250μg/mL、220μg/mL至300μg/mL或240μg/mL至300μg/mL。

在某些方面，选择剂是博来霉素并且以条件致死浓度存在。在一些实施方案中，所述条件致死浓度为至少30、35、40、45、50、75、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、525、550、575、600、625、650、675、700、800或900μg/mL。在另一些实施方案中，博来霉素的条件致死浓度为至多125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、800或900μg/mL。在另一些实施方案中，博来霉素的条件致死浓度为30μg/mL至125μg/mL、30μg/mL至150μg/mL、30μg/mL至175μg/mL、30μg/mL至200μg/mL、30μg/mL至225μg/mL、30μg/mL至250μg/mL、30μg/mL至275μg/mL、30μg/mL至300μg/mL、30μg/mL至325μg/mL、30μg/mL至350μg/mL、30μg/mL至375μg/mL、30μg/mL至400μg/mL、30μg/mL至425μg/mL、30μg/mL至450μg/mL、30μg/mL至475μg/mL、30μg/mL至500μg/mL、30μg/mL至600μg/mL、30μg/mL至700μg/mL、50μg/mL至125μg/mL、50μg/mL至150μg/mL、50μg/mL至175μg/mL、50μg/mL至200μg/mL、50μg/mL至225μg/mL、50μg/mL至250μg/mL、50μg/mL至275μg/mL、50μg/mL至300μg/mL、50μg/mL至325μg/mL、50μg/mL至350μg/mL、50μg/mL至375μg/mL、50μg/mL至400μg/mL、50μg/mL至425μg/mL、50μg/mL至450μg/mL、50μg/mL至475μg/mL、50μg/mL至500μg/mL、50μg/mL至600μg/mL、50μg/mL至700μg/mL、100μg/mL至125μg/mL、100μg/mL至150μg/mL、100μg/mL至175μg/mL、100μg/mL至200μg/mL、100μg/mL至225μg/mL、100μg/mL至250μg/mL、100μg/mL至275μg/mL、100μg/mL至300μg/mL、100μg/mL至325μg/mL、100μg/mL至350μg/mL、100μg/mL至375μg/mL、100μg/mL至400μg/mL、100μg/mL至425μg/mL、100μg/mL至450μg/mL、100μg/mL至475μg/mL、100μg/mL至500μg/mL、100μg/mL至600μg/mL、100μg/mL至700μg/mL、150μg/mL至175μg/mL、150μg/mL至200μg/mL、150μg/mL至225μg/mL、150μg/mL至250μg/mL、150μg/mL至275μg/mL、150μg/mL至300μg/mL、150μg/mL至325μg/mL、150μg/mL至350μg/mL、150μg/mL至375μg/mL、150μg/mL至400μg/mL、150μg/mL至425μg/mL、150μg/mL至450μg/mL、150μg/mL至475μg/mL、150μg/mL至500μg/mL、150μg/mL至600μg/mL、150μg/mL至700μg/mL、175μg/mL至200μg/mL、175μg/mL至225μg/mL、175μg/mL至250μg/mL、175μg/mL至275μg/mL、175μg/mL至300μg/mL、175μg/mL至325μg/mL、175μg/mL至350μg/mL、175μg/mL至375μg/mL、175μg/mL至400μg/mL、175μg/mL至425μg/mL、175μg/mL至450μg/mL、175μg/mL至475μg/mL、175μg/mL至500μg/mL、175μg/mL至600μg/mL、175μg/mL至700μg/mL、200μg/mL至225μg/mL、200μg/mL至250μg/mL、200μg/mL至275μg/mL、200μg/mL至300μg/mL、200μg/mL至325μg/mL、200μg/mL至350μg/mL、200μg/mL至375μg/mL、200μg/mL至400μg/mL、200μg/mL至425μg/mL、200μg/mL至450μg/mL、200μg/mL至475μg/mL、200μg/mL至500μg/mL、200μg/mL至600μg/mL、200μg/mL至700μg/mL、225μg/mL至250μg/mL、225μg/mL至275μg/mL、225μg/mL至300μg/mL、225μg/mL至325μg/mL、225μg/mL至350μg/mL、225μg/mL至375μg/mL、225μg/mL至400μg/mL、225μg/mL至425μg/mL、225μg/mL至450μg/mL、225μg/mL至475μg/mL、225μg/mL至500μg/mL、225μg/mL至600μg/mL、225μg/mL至700μg/mL、250μg/mL至275μg/mL、250μg/mL至300μg/mL、250μg/mL至325μg/mL、250μg/mL至350μg/mL、250μg/mL至375μg/mL、250μg/mL至400μg/mL、250μg/mL至425μg/mL、250μg/mL至450μg/mL、250μg/mL至475μg/mL、250μg/mL至500μg/mL、250μg/mL至600μg/mL、250μg/mL至700μg/mL、275μg/mL至300μg/mL、275μg/mL至325μg/mL、275μg/mL至350μg/mL、275μg/mL至375μg/mL、275μg/mL至400μg/mL、275μg/mL至425μg/mL、275μg/mL至450μg/mL、275μg/mL至475μg/mL、275μg/mL至500μg/mL、275μg/mL至600μg/mL、275μg/mL至700μg/mL、300μg/mL至325μg/mL、300μg/mL至350μg/mL、300μg/mL至375μg/mL、300μg/mL至400μg/mL、300μg/mL至425μg/mL、300μg/mL至450μg/mL、300μg/mL至475μg/mL、300μg/mL至500μg/mL、300μg/mL至600μg/mL、300μg/mL至700μg/mL、325μg/mL至350μg/mL、325μg/mL至375μg/mL、325μg/mL至400μg/mL、325μg/mL至425μg/mL、325μg/mL至450μg/mL、325μg/mL至475μg/mL、325μg/mL至500μg/mL、325μg/mL至600μg/mL、325μg/mL至700μg/mL、350μg/mL至375μg/mL、350μg/mL至400μg/mL、350μg/mL至425μg/mL、350μg/mL至450μg/mL、350μg/mL至475μg/mL、350μg/mL至500μg/mL、350μg/mL至600μg/mL、350μg/mL至700μg/mL、375μg/mL至400μg/mL、375μg/mL至425μg/mL、375μg/mL至450μg/mL、375μg/mL至475μg/mL、375μg/mL至500μg/mL、375μg/mL至600μg/mL、375μg/mL至700μg/mL、400μg/mL至425μg/mL、400μg/mL至450μg/mL、400μg/mL至475μg/mL、400μg/mL至500μg/mL、400μg/mL至600μg/mL、400μg/mL至700μg/mL、425μg/mL至450μg/mL、425μg/mL至475μg/mL、425μg/mL至500μg/mL、425μg/mL至600μg/mL、425μg/mL至700μg/mL、450μg/mL至475μg/mL、450μg/mL至500μg/mL、450μg/mL至600μg/mL、450μg/mL至700μg/mL、475μg/mL至500μg/mL、475μg/mL至600μg/mL、475μg/mL至700μg/mL、425μg/mL至450μg/mL、425μg/mL至475μg/mL、425μg/mL至500μg/mL、500μg/mL至600μg/mL或500μg/mL至700μg/mL。

在一些实施方案中，在电穿孔后，在培养期间使细胞暴露于一定浓度的选择剂一定量的时间以选择已经内在化和/或表达所述选择剂抗性基因的细胞。在某些方面，在选择期间或选择后，选择导致形成稳定的细胞库。在一些情况下，可在该过程的选择阶段期间使细胞暴露于选择剂预定量的时间。在另一些方面，在培养的同时使细胞暴露于选择剂的时间量可能会变化。在一些实施方案中，在选择阶段、维持/克隆选择阶段、克隆筛选和扩增阶段或大规模扩大阶段使细胞暴露于选择剂1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒(或可来源于其中的任何范围)。在另一些实施方案中，在选择阶段、维持/克隆选择阶段、克隆筛选和扩增阶段或大规模扩大阶段将细胞暴露于选择剂同时培养至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分钟(或可来源于其中的任何范围)。在再一些实施方案中，在选择阶段、维持/克隆选择阶段、克隆筛选和扩增阶段或大规模扩大阶段将细胞暴露于选择剂同时培养至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156或168小时(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，在选择阶段、维持/克隆选择阶段、克隆筛选和扩增阶段或大规模扩大阶段将细胞暴露于选择剂同时培养至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天(或可来源于其中的任何范围)。在另一些实施方案中，在选择阶段、维持/克隆选择阶段、克隆筛选和扩增阶段或大规模扩大阶段将细胞暴露于选择剂同时培养至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26周(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，该过程的选择阶段导致形成在细胞的基因组中已稳定地整合了电穿孔构建体的细胞库。在另一些实施方案中，稳定的细胞库表示细胞已经稳定地整合了电穿孔构建体。在某些方面，稳定整合表示将整个构建体或构建体的一些部分整合进细胞的基因组中。在某些方面，对于任何考虑的如上所述的培养时间间隔，可降低、升高选择剂的浓度或可改变或省略选择剂。

在某些方面，在选择阶段后，通过使细胞暴露于将危害未表达选择抗性基因或在电穿孔期间未获得选择抗性基因的细胞的生存力之浓度的选择剂来维持稳定的细胞库。在某些方面，选择剂或化合物是抗生素。在另一些方面，选择剂是单独或组合使用的G418、嘌呤霉素、博来霉素、潮霉素、腐草霉素或杀稻瘟素。在某些方面，在维持期间选择剂的浓度为0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5mg/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L或100g/L至500g/L(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，在维持期间选择剂的浓度为(y)g/L，其中“y”可以是任何值，包括但不限于：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100(或可来源于其中的任何范围)。在一些实施方案中，在维持期间选择剂以以下浓度存在于培养基中：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10g/L(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，在维持期间G418的浓度为0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5mg/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L或100g/L至500g/L(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，在维持期间G418的浓度为(y)g/L，其中“y”可以是任何值，包括但不限于：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100(或可来源于其中的任何范围)。在一些实施方案中，在维持期间G418以以下浓度存在于培养基中：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10g/L或可来源于其中的任何范围。

在一些实施方案中，在维持期间或维持后，细胞可进行有限稀释方法以使得能够扩增细胞的克隆群。有限稀释克隆的方法是本领域技术人员公知。已经描述将这样的方法例如用于杂交瘤，但是可应用于任何细胞。这样的方法在(Cloning hybridoma cells bylimiting dilution，Journal of tissue culture methods，1985，第9卷，第3期，第175至177页，由Joan C.Rener，Bruce L.Brown和Roland M.Nardone)中描述，其通过引用方式并入本文。

在一些实施方案中，在电穿孔之前或电穿孔后培养细胞。在另一些实施方案中，在电穿孔后的选择阶段期间培养细胞。在再一些实施方案中，在维持和克隆选择以及初始扩增阶段期间培养细胞。在又一些实施方案中，在筛选阶段期间培养细胞。在另一些实施方案中，在大规模生产阶段期间培养细胞。培养悬浮和贴壁细胞的方法是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，使用市售的细胞培养容器和细胞培养基在悬浮液中培养细胞。可用于一些实施方案中的市售培养容器的实例包括ADME/TOX板、细胞室载玻片(Cell ChamberSlides)和盖玻片、细胞计数装置、细胞培养表面(Cell Culture Surfaces)、CorningHYPERFlask细胞培养容器、包被的培养皿(Cultureware)、Nalgene低温皿(Cryoware)、培养室、培养皿、玻璃培养瓶、塑料培养瓶、3D培养器皿(format)、多孔培养板、培养板插入物、玻璃培养管、塑料培养管、可堆叠的细胞培养容器、低氧培养室、培养皿和烧瓶载体(flaskcarrier)、Quickfit培养容器，使用滚瓶、旋转瓶(Spinner Flask)、3D细胞培养或细胞培养袋的扩大细胞培养(Scale-UP Cell Culture)。

在另一些实施方案中，可使用本领域技术人员公知的组分配制培养基。在以下文献中详细地描述了培养细胞的制剂和方法：Short Protocols in Cell BiologyJ.Bonifacino等编辑，John Wiley&Sons，2003，第826页；Live Cell Imaging：ALaboratory Manual D.Spector&R.Goldman编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2004，第450页；Stem Cells Handbook S.Sell编辑，Humana Press，2003，第528页；Animal Cell Culture：Essential Methods，John M.Davis，John Wiley&Sons，3月16日，2011；Basic Cell CultureProtocols，Cheryl D.Helgason，Cindy Miller，Humana Press，2005；Human Cell Culture Protocols，系列：Methods in Molecular Biology，第806卷，Mitry，Ragai R.；Hughes，Robin D.(编辑)，第3版.2012，XIV，435，第89页，Humana Press；Cancer Cell Culture：Method and Protocols，Simon P.Langdon，Springer，2004；Molecular Cell Biology.第4版，Lodish H，Berk A，Zipursky SL等，New York：w.H.Freeman；2000.，第6.2节Growth of Animal Cells in Culture，所有这些均通过引用并入本文。

在一些实施方案中，在筛选和扩增阶段期间和/或在大规模生产阶段(也称为补料分批和比较)期间，扩增的由选择所得到的电穿孔细胞可以组成性地表达衍生自外源引入之构建体或核酸的多肽。在另一些实施方案中，在筛选和扩增阶段期间和/或在大规模生产阶段期间，可诱导扩增的由选择所得到的电穿孔细胞来表达衍生自外源引入之构建体或核酸的多肽。在某些方面，在筛选和扩增期间和/或在大规模生产期间，所表达的由外源引入的核酸、构建体或分子产生的多肽浓度可以为约，至少约或至多约0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5m/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L或100g/L至500g/L或从可来源于其中的任何范围。在另一些实施方案中，所表达的由外源引入的核酸、构建体或分子产生的多肽浓度可以为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750或10000mg/L或可来源于其中的任何范围。

IV.蛋白质组合物

在一些实施方案中，用提供异源表达手段的核酸、核酸构建体或载体对细胞进行电穿孔，其包括但不限于，克隆基因、修饰的克隆基因、重组基因、融合蛋白、盒、开放阅读框或表达的序列标签。在某些实施方案中，电穿孔的细胞表达或能够表达包括但不限于，分泌性蛋白、表面受体、膜蛋白、胞浆蛋白、GPCR、离子通道、核受体、激酶或适配体。在一些具体实施方案中，电穿孔的细胞表达抗体。在另一些实施方案中，电穿孔的细胞表达抗体融合蛋白，其中编码抗体的重组核酸与编码另一多肽的另一核酸融合。在另一些实施方案中，电穿孔的细胞是稳定转染的电穿孔细胞。

要求保护的方法可用于将任何遗传物质引入至细胞或细胞片段中。遗传物质可编码特定蛋白质或可以是反义遗传物质。通过引入编码蛋白质或多肽的表达载体，可引入至宿主细胞中之所述蛋白质和多肽的实例包括，但不限于，编码b细胞分化因子、b细胞生长因子、促有丝分裂细胞因子、趋化细胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、粘附因子(钙黏着蛋白、选择蛋白、整联蛋白、NCAM、ICAM和L1)、t细胞取代因子、分化因子、转录因子、mRNA、热休克蛋白、核蛋白复合物和RNA/DNA寡聚物的基因。可使用本发明的流式电穿孔引入至宿主细胞中之编码特定因子的核酸包括但不限于，IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、瘦蛋白、肌生长抑制素(myostatin)(生长分化因子)、巨噬细胞刺激蛋白及其衍生物、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β、NGF、CD40L、CD137L/4-1BBL、人淋巴毒素-β、TNF相关凋亡诱导配体(trail))、单克隆抗体、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、PDGF、IL1-α、IL1-beta、FGF IFN-γ、IP-10、PF4、GRO和9E3、促红细胞生成素(EPO)、内皮抑制素及其片段、制管张素及其片段、成纤维细胞生长因子(FGF)、VEGF、可溶性受体及其任意片段或组合。

V.核酸

在某些实施方案中，存在编码本文所述之蛋白质、多肽或肽的重组多核苷酸。预期的多核苷酸序列包括编码抗体或其结合部分的那些。

如本申请中所使用的术语“多核苷酸”是指重组的或已分离的游离于从总基因组核酸的核酸分子。术语“多核苷酸”中包括寡核苷酸(长度为100个残基或更短的核酸)、重组载体，其包括，例如，质粒、黏粒、噬菌体、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括基本上从其天然存在的基因或蛋白质编码序列中分离出来的调控序列。多核苷酸可以为单链(编码链或反义链)或双链，并且可以是RNA、DNA(基因组DNA，cDNA或合成DNA)、其类似物，或其组合。另外的编码序列或非编码序列可以但不一定存在于多核苷酸内。

在此方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白质、多肽或肽的核酸(包括合适的转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。如本领域技术人员将理解的，该术语涵盖表达或可适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、表达盒、cDNA序列和更小的工程核酸片段。编码全部或部分多肽的核酸可包含编码全部或部分这样的多肽的连续核酸序列。还可预期，可通过包含具有稍位不同之核酸序列的变化，但是仍编码相同的或基本上相似的蛋白质的核酸来编码特定的多肽(见上文)。

在一些特定的实施方案中，存在并入了编码多肽(例如，抗体或其片段)之核酸序列的分离的核酸片段和重组载体。术语“重组”可结合多肽或具体多肽的名称使用，并且其通常是指由已在体外操作的核酸分子或者为这样的分子的复制产物产生的多肽。

不管编码序列自身的长度如何，核酸片段可与其他核酸序列组合，例如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等，使得其总长度可以有很大变化。因此可预期的是，可使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选受制备的方便性和在预期的重组核酸方案中应用的限制。在一些情况下，核酸序列可与另外的异源编码序列一起编码多肽序列，例如以允许纯化多肽、转运、分泌、翻译后修饰或治疗益处例如靶向或功效。如以上所讨论，可将标签或其他异源多肽添加至经修饰的多肽编码序列，其中“异源”是指与经修饰的多肽不同的多肽。

A.载体

可通过核酸分子编码多肽。核酸分子可以是核酸载体的形式。术语“载体”用于指载体核酸分子，可将异源核酸分子插入其中以引入细胞中，在所述细胞中其可被复制和表达。核酸序列可以是“异源的”，这意指其相对于将载体引入其中的细胞或将其并入的核酸来说是外来物的情况，其包括与细胞中的序列或核酸同源但是在宿主细胞或核酸内通常不存在的位置处的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将通过标准重组技术(例如，Sambrook等，2001；Ausubel等，1996；二者均通过引用并入本文)熟练地构建载体。载体可用于宿主细胞中以产生抗体。

术语“表达载体”是指包含编码至少部分基因产物的核酸序列的载体，所述核酸序列能够被转录或能够稳定地整合到宿主细胞的基因组中并且随后被转录。在一些情况下，然后将RNA分子翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指在特定的宿主生物体中有效连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体也可包含还具有其他功能并且在本文中进行了描述的核酸序列。

“启动子”是控制序列。启动子通常是控制转录的起始和速率的核酸序列区域。其可包含调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合在其上的遗传元件。术语“有效定位”、“有效连接”、“受到控制”和“受到转录控制”意指，启动子处于相对于核酸序列的正确功能位置和/或方向中以控制转录起始和该序列的表达。启动子可以与“增强子”联合使用或者可不与“增强子”联合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。

不认为用于控制肽或蛋白质编码多核甘酸之表达的特定启动子是关键的，只要其能够在靶细胞(优选细菌细胞)中表达多核苷酸即可。当靶向人细胞时，优选地将多核苷酸编码区置于邻近能够在人细胞中表达的启动子或受所述启动子控制。一般而言，这样的启动子可包括细菌、人或病毒启动子。

编码序列的有效翻译也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近的序列。可需要提供包括ATG起始密码子的外源翻译调控信号。本领域普通技术人员将能够容易地对此进行确定并且提供所需信号。

载体可包含多克隆位点(MCS)，其为包含多个限制性酶位点的核酸区域，任意所述限制性酶位点可与标准重组技术一起使用来消化所述载体(参见Carbonelli等，1999，Levenson等，1998和Cocea，1997，通过引用并入本文)。

大多数转录的真核生物RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录本中去除内含子。包含真核基因组序列的载体可需要供体和/或接受者剪接位点以确保转录本被正确的加工从而表达蛋白质(参见Chandler等，1997，通过引用并入本文。)。

载体或构建体通常将包含至少一种终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录本之特定终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑了结束RNA转录本产生的终止信号。终止子是在体内达到理想信使水平所必须的。在真核生物系统中，终止子区域还可包含特异性DNA序列，该序列可使新的转录本位点特异性切割以暴露出多腺苷酸化位点。其发出信号使特化的内源聚合酶将一段约200个A残基(polyA)的序列添加至转录本的3′末端。经这种polyA尾修饰的RNA分子似乎更稳定并且翻译效率更高。因此，在涉及真核生物的另一些实施方案中，优选终止子包含用于RNA切割的信号，并且更优选终止子信号促进信使的多腺苷酸化。

在表达中，特别在真核生物表达中，通常将包含多腺苷酸化信号以实现转录本合适的多腺苷酸化。

为了在宿主细胞中传播载体，其可包含一个或更多个复制起始位点(通常被称为“ori”)，此位点为复制起始所在的特定核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可使用自主复制序列(ARS)。

一些载体可使用允许其在原核细胞和真核细胞两者中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将进一步了解孵育所有上述宿主细胞以维持它们并且使载体复制的条件。也了解并知道允许大规模生产载体和生产通过载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。

B.核酸构建体的表达

替换变体通常包含在蛋白质内的一个或更多个位点处用一个氨基酸交换另一个氨基酸，并且可被设计来调节多肽的一种或多种性质，同时丧失或不丧失其他功能或性质。替换可以是保守的，也就是说，用一个相似形状和电荷的氨基酸代替一个氨基酸。保守的替换是本领域中公知的并且包括，例如，以下改变：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。或者，替换可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守的改变通常包括以化学相异的残基取代残基，例如用极性或带电的氨基酸替换非极性或不带电的氨基酸，反之亦然。

蛋白质可以是在体外重组或合成的。或者，可从细菌分离非重组或重组的蛋白质。还可预期的是，包含这样变体的细菌可应用于组合物和方法中。因此，不需要分离蛋白质。

本文所使用的术语“功能等同的密码子”是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，并且也指编码生物学等同之氨基酸的密码子(参见下表1)。

密码子表

还将理解的是，氨基酸和核酸序列可分别包含另外的残基，例如另外的N-或C-末端氨基酸，或5′或3′序列，并且仍然基本上如本文公开的一个序列所示，只要序列符合以上提出的标准即可，所述标准包括当涉及蛋白质表达时，生物学蛋白质活性的维持。末端序列的添加特别适用于核酸序列，例如，可包括位于编码区5′或3′部分侧翼的多种非编码序列。

以下是基于改变蛋白质的氨基酸以产生等同的或甚至改良的第二代分子的讨论。例如，可将蛋白质结构中的某些氨基酸替换为其他氨基酸而不明显丧失与例如抗体的抗原结合区域或底物分子上的结合位点之结构相互作用的结合能力。由于蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物学功能活性，因此可以在蛋白质序列中以及在其潜在DNA编码序列中进行某些氨基酸替换，并且仍产生具有相似性质的蛋白质。因此，本发明人预期，可在基因的DNA序列中做出多种改变而不明显丧失其生物学效用或活性。

在做这样的改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数对赋予蛋白质相互作用生物学功能的重要性是本领域中通常了解的(Kyte和Doolittle，1982)。一般认为，氨基酸的相对亲水特性有利于所得蛋白质的二级结构，其继而限定了蛋白质与其他分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。

在本领域中还了解的是，类似氨基酸的替换可基于亲水性而有效地进行。通过引用并入本文的美国专利4,554,101阐明，蛋白质的最大局部平均亲水性(通过其临近氨基酸的亲水性管理)与蛋白质的生物学性质相关。可以理解的是，一种氨基酸可被另一种具有相似亲水性值的氨基酸来替换并且仍能产生生物学等同和免疫学等同的蛋白质。

如上所述，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。考虑了多种前述特征的示例性替换是公知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

抗体

在一些特定的实施方案中，本文所用的“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白片段、适配体和已被改造而具有抗体样结合位点的多肽，其能够与任意类型靶分子的表位结合。可以产生本领域中已知的任意类型的抗体以特定地结合抗原表位。

抗体是具有与抗原结合之能力的免疫球蛋白。其包括通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。抗体的非限制性实例包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要其表现出期望的生物学活性即可)。抗体可以为亲和力成熟的抗体。

术语“抗体片段”仅包括完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留当所述部分存在于完整的抗体中时通常与其相关的至少一种，更优选大多数或全部功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点并且因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，例如，包含Fc区域的抗体片段保留了当Fc区域存在于完整抗体中时通常与其有关的至少一种生物学功能。例如，这样的抗体片段可包含连接至能够赋予所述片段稳定性之序列的抗原结合臂。

“分离的”或“纯化的”抗体是已被鉴定并且从其自然环境的组分分离或回收(或分离并回收)的抗体。分离的抗体的自然环境的污染物组分是将干扰抗体诊断用途的物质。这样的污染物的非限制性实例包括酶、激素和另一些蛋白质的或非蛋白质的溶质。在一些实施方案中，例如，可纯化抗体至大于蛋白质按重量计的95％(如通过Lowry法测定)，并且有时大于按重量计99％。因为抗体的自然环境的至少一种组分将不存在，所以分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，一般地，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。

本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。本文中的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其中部分重链或轻链或二者的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类之抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类之抗体中的对应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要其表现出期望的生物学活性即可。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽还包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。

“抗原”是抗体可选择性结合的预先确定的物质。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在本文的一些实施方案中，相关抗原是N-甲基-2超家族的任意成员蛋白质，其作为以下任一形式出现：1)溶液中的单一蛋白质，2)蛋白质复合物的组分，3)细胞片段的组分，或4)完整的细胞。

“表位”是抗体选择性结合的抗原部分。对于多肽抗原来说，表位通常是约四至十个氨基酸的肽部分。

本文所使用的“交叉反应性抗体”是可结合多种一级氨基酸序列不同的蛋白质的抗体。交叉反应性抗体结合多种具有相关氨基酸序列的蛋白质，但不结合另一些具有足够不同的氨基酸序列的蛋白质或具有足够修饰的组成的蛋白质，例如通过化学修饰。交叉反应性抗体可以是多克隆的或单克隆的、适配体或片段，包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv。即使是在抗体的早期工作中(Landsteiner K.The Specificity of Serological Reactions，rev.edn.New York：Dover，1962)，交叉反应性抗体的实例就是已知的。作为一个实例，使用与同源但是可变的主要组织相容性复合体(MHC)决定簇之重叠集结合的交叉反应性多克隆抗体，组织的组织相容性分型的领域得以发展(Histocompatibility Testing：Report ofa Conference and Workshop.Washington DC：National Academy of Sciences-NationalResearch Council，1965)。后来的工作确定了由每个多克隆抗体结合的特定序列，并且在氨基酸序列水平上定义了每个抗体的交叉反应性谱(Dupont B，编辑.Immunobiology ofHLA.Histocompatibility Testing 1987，第I卷，和Immunogenetics andHistocompatibility，第II卷.Springer-Verlag，New York，1988)。已发现，在许多情况下，单个氨基酸替换消除了一些交叉反应性抗体的结合，而在另一些情况下，多个替换对结合的影响可忽略不计。交叉反应性单克隆抗体与MHC决定簇也证明了类似的结果(Parham P，Brodsky FM.Partial purification and some properties of BB7.2.A cytotoxicmonoclonal antibody with specificity for HLA-A2 and a variant of HLA-A28.HumImmunol.1981 Dec；3(4)：277-99.)。

若需要的话，可使用本领域普通技术人员已知的任何技术进一步纯化通过任意方式产生的单克隆抗体，如过滤、离心分离和多种色谱法(如FPLC或亲和色谱法或本领域普通技术人员已知的任意其他方法)。

编码抗体基因片段的核酸可从收获自人或动物的免疫细胞获得。如果偏向有利于特定克隆的文库是期望的，则用抗原免疫对象以产生抗体应答，并且回收脾细胞和/或循环B细胞或其他外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。可通过使用合适的筛选程序分离表达特异性膜结合抗体的B细胞来获得特定反应性细胞群的另外富集。或者，使用来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其他PBL提供了可能的抗体库的更好呈现，并且也允许使用任何其中抗原不是抗原性的动物(人或非人)物种构建抗体文库。对合并体外抗体基因构建的文库来说，从对象收获干细胞以提供核酸编码未重排抗体基因区段。目的免疫细胞可从多种动物物种获得，例如人、小鼠、大鼠等。从目的细胞回收编码抗体可变基因区段的核酸并扩增。

可使用多肽期望区域的氨基酸序列设计编码多肽的核酸序列。或者，可使用cDNA序列(或其片段)。可通过本领域已知的多种方法制备编码多肽的DNA。接下来构建编码多肽的DNA分子，所述DNA分子有效地连接至表达载体(例如质粒)中的表达控制序列，其中通过转化有载体的宿主细胞识别所述控制序列。用于在原核和真核宿主细胞中表达的合适载体是本领域中已知的。任选地，编码多肽的DNA有效地连接至分泌性前导序列，从而导致表达产物被宿主细胞分泌至培养基中。用本发明的表达载体或克隆载体转染并且优选地转化宿主细胞，并在常规的营养培养基中培养宿主细胞，将所述营养培养基改良为适合于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。

纯化的多肽可附着至合适的基质(例如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、多种丙烯酸共聚物、羟基甲基丙烯酸酯凝胶聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体等)以用于噬菌体展示克隆的亲和色谱分离。或者，蛋白质可用于包被吸附板的孔、在附着吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，或者缀合至生物素用于以链霉亲和素包被的珠捕获，或者用于任何其他领域已知的用于淘选噬菌体展示文库的方法。在适于至少一部分噬菌体颗粒与吸附剂结合的条件下，使噬菌体文库样品与固定化蛋白质接触。通常，选择包括pH、离子强度、温度等的条件来模拟生理条件。洗涤并且然后洗脱结合到固相的噬菌体。此外，富集的噬菌体可在细菌培养物中生长并且进行进一步的多轮选择。

使用常规程序(例如通过使用设计来特异性地扩增来自杂交瘤或噬菌体DNA模板之目的区域的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)容易地分离并且测序编码本发明之杂交瘤衍生的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA。一旦被分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中以在重组宿主细胞内获得合成的期望的单克隆抗体。

编码本发明的Fv克隆的DNA可与已知的编码重链和/或轻链恒定区的DNA序列(例如可从Kabat等获得的合适的DNA序列，参见上文)组合以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。应当理解的是，任何同种型的恒定区均可用于此目的，其包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且可从任何人或动物物种获得这样的恒定区。Fv克隆来源于一种动物(例如人)物种的可变结构域DNA，然后与另一种动物物种的恒定区DNA融合以形成用于“杂交”的编码序列，全长重链和/或轻链包括在如本文所使用的“嵌合的”和“杂交的”抗体的定义内。在一个优选的实施方案中，将来源于人可变DNA的Fv克隆融合至人恒定区DNA以形成所有人全长或部分长度重链和/或轻链的编码序列。

也可对编码来源于本发明杂交瘤的抗体的DNA进行修饰，例如，通过替换，将人重链恒定结构域和轻链恒定结构域的编码序列替代为来源于杂交瘤克隆的同源鼠序列。可通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA。以这种方式，制备了具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体结合特异性的“嵌合的”或“杂交的”抗体。

1.抗体片段

在一些实施方案中，本发明涵盖抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段比整个抗体具有优势。

抗体片段的非限制性实例包括本文提供的抗体的Fab、Fab′、Fab′-SH和F(ab′)2片段。可通过传统的手段(例如酶促消化)来创建这些抗体片段，或者可通过重组技术产生这些抗体片段。这些片段可用于以下列出的诊断目的。

多种技术可用于产生抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化产生，例如用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶和/或通过化学还原切割二硫键。然而，现在这些片段可直接通过重组宿主细胞产生。例如，Fab，Fv和ScF抗体片段都可在大肠杆菌中表达并且由大肠杆菌分泌，因此使得容易地生产大量的这些片段。或者，本发明涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪来合成。

适配体是可通过重复的多轮体外选择进行工程化以结合多种靶标的核酸分子，所述靶标包括，例如，蛋白质、核酸、细胞、组织和生物体。因为其特异性和结合能力，所以适配体具有作为诊断剂的巨大潜力。在一些情况下，适配体已经示出是比其他分子(例如抗体)更好的诊断剂。使用适配体的另一个优势是不需要动物或培养细胞即可大量生产。适配体合成可通过聚合酶链式反应(″PCR″)或寡核苷酸合成进行，并且得到的适配体在室温下稳定且具有长的保存期。

通常通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，指数富集的配体系统进化)或SELEX方法上的变化完成适配体的开发。已在Turek和Gold，1990年以及在美国专利申请No.5,270163和5,475,096中(其通过引用并入本文)描述了SELEX方法。也报道了SELEX方法上的变化，例如光-SELEX，反向-SELEX、化学-SELEX、嵌合-SELEX、混合-SELEX和自动化-SELEX。通过SELEX，允许大群的寡核苷酸与目的靶标(例如，细菌细胞或从细菌细胞表面分离的蛋白质)相互作用。通过几种技术之一把结合到靶标的分子(称为成功的)与不结合的那些分子分开。例如，结合靶标的适配体可通过与硝化纤维素结合、亲和色谱法等从群中移出。然后可通过PCR扩增结合的适配体。

筛选方法

一些实施方案还包括用于鉴定能够结合特定蛋白质的抗体的方法。这些测定可包括筛选候选物质的大文库；或者，所述测定可用于集中于通过着眼于结构属性来选择的特定类别的化合物，认为所述结构属性使其更可能与特定蛋白质结合。

通过筛选，意味着可测定一系列候选物质结合特定蛋白质的能力。为了用这一性质鉴定抗体，如在一些实施方案中所使用的，通常将使用已知包含已知特定蛋白质、其片段或包含其特定表位的合成构建体的制备物进行免疫测定。

这种免疫测定还将包括检测候选抗体和所述制备物之间结合存在的方法。可用于鉴定已结合特定蛋白质之抗体的方法的实例包括：ELISA、RIA、CLIA、荧光测定和无标记结合测定，其中未结合的抗体通过洗涤步骤除去，并且只有已经与靶蛋白结合的抗体保持附着至固体支持物。本领域的中等技术人员知道很多类似的方法。类似的方法也可用于鉴定合适的抗体片段，包括scFv和适配体。

本领域的中等技术人员认识到其他顺序的筛选方法和其他测定形式也可用于获得基本上相同的结果，相反地，可对抗体进行筛选以选择用于结合特定蛋白质而非其他蛋白质的抗体。

当本公开内容的一个特定实施方案包括如本文所述的范围时，特别考虑到，范围和特定的值(即，浓度)可在本发明的一些实施方案中排除。也考虑到，当本公开内容包括一系列要素(例如，细胞类型)时，本发明的一些实施方案可特别地排除该系列中的一个或多个要素。

VI.实施例

包括以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，在以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明实践中良好地发挥作用的技术，并因此可被认为是用于其实践的优选方式。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解的是，可在所公开的具体实施方案中做出很多变化，并且仍然得到相同或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1-用MaxCyte STX转染技术的迅速高表达稳定细胞系开发

材料和方法

细胞：CHO-S细胞购自LifeTechnology(Cat.No.A1155701)，并且培养在补充有1×HT溶液(LifeTech.Cat.No.11067-030)和2mM GlutaMax(LifeTech.Cat.No.35050-061)的CD CHO培养基(Lifetech.Cat.No.10743029)中。将细胞维持在线性对数生长期以保持用于转染的健康细胞。

转染：在转染前一天，将细胞扩大至所需体积以具有足够的细胞用于第二天的转染。对于GFP转染，将GFP cDNA克隆到质粒载体pCI(Promega)中，并且由人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子/启动子区域驱动GFP的表达。对于抗体，将人源化的IgG1 cDNA的重链和轻链克隆到相同的pcDNA3.1载体中。用单一酶切使抗体表达载体线性化以用于稳定转染。通过MaxCyte STX转染技术使用在400μl EP缓冲液中的80μg线性化DNA和80E6 CHO-S细胞进行转染。简言之，将所需的细胞旋转沉降(spun down)并重新悬浮于MaxCyte电穿孔缓冲液中。然后将细胞与DNA良好混合，并且将细胞/DNA混合物加样到OC-400池中以用于转染。将转染的细胞转移至125ml的Erlenmeyer摇瓶在培养箱中于37℃下恢复40分钟。然后向转染的细胞添加CD CHO补充培养基。

选择和克隆：EP后二十四小时，开始稳定的选择。将细胞旋转沉降然后重新悬浮在选择培养基中，所述选择培养基是包含1.6g/L G418的补充CD CHO培养基。在两周中观察选择培养基中的克隆，并且在96孔板中以每孔0.3细胞起始有限稀释克隆。当开发出克隆时，通过使用Elisa测定开始克隆筛选。

Elisa测定：使用Elisa测定筛选和鉴定高表达克隆。将山羊抗-人IgG，Fcγ片段(Sigma，cat#：I2136-1ml)在碳酸盐缓冲液(sigma，C3041-100CAP)中稀释至2μg/ml，然后用50μl稀释的捕获抗体包被板在4℃下过夜。用PBS/0.1％Tween20洗涤板三次，然后用200μL的PBS/0.1％Tween20/BSA，在4℃下封闭过夜。将稀释的样品添加至板并且将人IgG1(Sigma，I5154-1mg)以系列稀释进行稀释并用于标准曲线。在室温下进行孵育1小时，然后用PBS/0.1％Tween洗涤板三次。按1∶20,000稀释过氧化物酶缀合的兔抗人IgG(H+L)(Sigma，A8792-2ml)并且按每个孔50μL添加。在室温下将板孵育1小时，并且如上所述进行洗涤。每个孔添加一百微升的TMB底物(Sigma，T8665)，在室温下孵育约5分钟，并且通过50μL的0.25M的硫酸(Sigma，38295-1EA)停止。通过微板Elisa读数器(FLUOstar OPTIMA)读取数据。

结果

图1示出了稳定细胞系产生过程的工作流程图。电穿孔后，可将细胞培养一段时间而不进行选择以使其从电穿孔过程恢复(图中未示出)。在电穿孔后，在选择剂的存在下通过培养细胞来选择细胞(选择阶段)。在选择阶段后，在选择剂的存在下于较低密度下培养细胞以使得进行有限稀释克隆(维持/克隆选择阶段)。在产生克隆群后，筛选表达外源多肽的克隆并扩增(克隆筛选和扩增阶段)。在筛选后，使具有期望活性的克隆进行更大规模的生长以用于生产目的(大规模扩大阶段)，或使其进行长期保存(例如低温保存)(图1)。

STX技术能够以非常高的转染效率和细胞生存力转染许多难以转染的细胞系(包括CHO细胞)(图2)。这一独特特征允许我们开发用于稳定细胞系产生的高严格选择方法。我们使用了1.6g/L的G418浓度并成功且快速地开发出生产率＞3g/L的稳定细胞系。迄今为止，还没有报道显示，在这样高的G418选择压力下通过使用其他转染方法进行哺乳动物稳定细胞系开发具有这样的成功率和效率(Naoko 2004；Kim 2012)。

图3中的结果示出了一种最佳稳定克隆的细胞性能。在生产培养期间，该细胞系具有稳健的细胞生长和高生存力。比生产率(～27pg/c/d)和体积生产率(＞3g/L)也很高，并且与通过配备有许多先进技术的其他方法所产生的稳定细胞系相比具有相当的可比性和竞争性。

图4中的结果证明了用本权利要求的方法进行高效价抗体生产。在MaxCyte STX上分别运行三个小规模或单个大规模的电穿孔用抗体表达质粒(每1×10⁶个细胞1μg DNA)转染2.4×10⁸个或1×10¹⁰个CHO细胞。在EP后3至14天测量总IgG浓度。使用单个30分钟电穿孔运行转染1×10¹⁰个CHO细胞从2.8L培养物产生大于1g的抗体产量(图4)。MaxCyte VLX具有在单个30分钟运行内转染2×10¹¹个细胞的能力，如果预计的话，其将等同于从单个瞬时转染运行中产生超过20克的抗体。

收获1×10¹⁰个CHO细胞并且使其以2×10⁸个细胞/mL重新悬浮于50％MaxCyte电穿孔缓冲液中。通过流式电穿孔(EP)在CL-2加工组件中用抗体表达质粒(1μg DNA/1E6个细胞)瞬时转染细胞。在EP之后，将细胞分别以6百万个细胞/mL或1千万个细胞/mL的密度接种至两个摇瓶中。每日进料培养物，在EP之后24小时添加1mM丁酸钠并且在EP后24小时将培养温度降低至32℃(图5)。图5的结果证明增加电穿孔后的细胞密度增加了分泌的抗体的效价。

为了测试不同尺寸的培养烧瓶对抗体产生的作用，将CHO细胞以2×10e8个细胞/mL重新悬浮于50％MaxCyte电穿孔缓冲液中。在一个CL-2或3OC-400PA中用抗体表达质粒(1μg DNA/1×10e6个细胞)分别瞬时转染1×10e10或2.4×10e8个细胞。将来自CL-2的细胞分别接种至包含1L或50mL培养基的两个摇瓶中；将来自三个OC-400的细胞合并并接种至50mL。在全部三个摇瓶中的初始细胞密度相同。每日进料培养物，在EP之后24小时添加1％丁酸钠并且在EP之后24小时将培养温度降低至32℃。通过ELISA测量抗体效价。在全部三个瓶子中可比较的效价说明了MaxCyte转染技术的可扩展性和再现性(图6)。

为了使用MaxCyte流式电穿孔证明迅速稳定细胞系的开发，通过STX技术将人源化的mAb DNA转染进CHO-S细胞中。然后，在G418选择培养基中从稳定库(stable pool)进行有限稀释克隆。在第6周产生细胞系并且放大规模以用于生产和加入细胞库。生产条件与瞬时表达相同。以补料分批生产率＞3g/L(图7)。

图8证明了用G418处理的细胞杀伤曲线，其中在电穿孔后24小时用1.6g/L的G418处理转染的和未转染的细胞二者。未转染的细胞在第8天完全被杀伤，而转染的细胞仍具有可观量的用于有限稀释克隆之有活力的转染的细胞。

表1概述了稳定细胞系的过程和结果。结果表明克隆形成效率高(66％)。只筛选了479个克隆并且在约8周内鉴定了高表达稳定细胞系(＞3g/L的效价)，所述约8周包括加入细胞库和补料分批培养。其他方法需要用先进的仪器(例如自动化液体处理系统和高通量筛选以及通过ClonePix和FACS分选方法进行选择)筛选几千个克隆，以在约4至6个月或更长时间内鉴定具有1g/L至4g/L生产率的克隆。在资本设备成本、员工资源投资和项目管理的紧张时间线方面，使用MaxCyte STX技术开发稳定细胞系具有明显的优势。

总之，MaxCyte STX技术可以由独特的高严格选择过程以迅速的、有效的、划算的并且专有自由的方式开发用于药物开发的高表达稳定细胞系。其缩短了选择过程，降低了细胞处理和人工成本，提供了高选择成功率，并且不需要任何先进的技术例如自动化的液体处理和稳定克隆选择系统/平台。所以MaxCyte转染技术通过用相同高表达稳定细胞系的临床前研究至临床试验促进药物开发的迅速前进，所述高表达稳定细胞系将极大地降低成本并且缩短产品开发的时间线。其将会成为用于生物制药的药物开发的重要工具。

表1：稳定CHO细胞系开发的概述

实施例2-用Maxcyte STX技术产生稳定细胞系

Maxcyte STX技术提供了快速并且划算的平台以产生用于重组蛋白产生的稳定且高产者细胞系。以下描述了稳定细胞系产生的一个示例性方案。

在线性对数细胞生长阶段中，将CHOS细胞以1e6个细胞/mL至4e6个细胞/mL的密度维持在基本培养基(具有1X Glutamax和1×HT溶液的CD CHO)中。转染前一天将细胞分成密度为2e6个细胞/mL。在转染当天，可用电穿孔缓冲液使用浓度为400μg/mL的DNA(其可被线性化)电穿孔密度为2e8个细胞/mL的细胞。

在37℃下于5％CO₂中在培养箱中使细胞在250mL的Erlenmeyer瓶中恢复30至40。恢复之后，将细胞悬浮在40mL的基本培养基中并且用摇晃恢复培养。电穿孔之后一天，将细胞在1200RPM下沉淀10分钟并重新悬浮于40mL的选择培养基中(补充有1X选择剂的基本培养基)以开始选择。为了测定1X选择剂的浓度，通过用多个浓度的选择剂处理未转染的细胞生成杀伤曲线。

在选择培养基中约两周后细胞杀伤可以是稳定的，并且通常通过持续的10％至20％的生存力水平指明。这时候，可在补充0.3X选择剂的基本培养基中启始有限稀释克隆过程。可在集落形成起始之后通过ELISA筛选克隆。可在125mL摇瓶使用分批或补料分批培养以鉴定和选择最佳克隆来保留最高产克隆以用于进一步评估。然后可扩增克隆以产生研究细胞厍。

＊＊＊

根据本公开内容，无需过度实验就可以进行和实施本文公开和要求保护的所有方法。虽然已依据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员明显的是，可对本文所述的方法和步骤或方法步骤的顺序做出改变而不偏离本发明的观念、精神和范围。更具体地，明显的是，可用化学和生理学二者相关的某些试剂替代本文描述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。认为所有这样的对于本领域技术人员来说明显的替代或修改都在如所附权利要求限定的本发明的精神、范围和观念内。

参考文献

以下的参考文献，在某种程度上提供了对本文提到的示例性程序或其他细节的补充，其通过引用明确并入本文。

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Claims (102)

1.用于产生表达外源多肽之稳定CHO细胞系的方法，其包括：

使用流式电穿孔将浓度为400μg/mL以上的表达构建体转染进细胞中，其中所述表达构建体包含i)可选择的基因和ii)编码外源多肽的序列；

在包含G418的条件致死浓度为1.6mg/ml的培养条件下对选择基因的表达进行选择，其中将所述细胞培养两周。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体是细菌质粒、病毒载体、黏粒或人工染色体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体为环状。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体为线形。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达构建体是细菌质粒。

6.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达构建体转染进细胞中包括使所述细胞的悬浮液流过流动室中的电场，所述电场由至少部分地限定了流动室的相对的带相反电荷的电极产生，其中所述流动室的热阻小于10℃每瓦特。

7.根据权利要求1所述的方法，其中转染所述细胞包括采用流式电穿孔装置，所述装置包含用于容纳待电穿孔细胞之悬浮液的室；所述室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述室的热阻小于10℃每瓦特。

8.根据权利要求1所述的方法，其中转染所述细胞包括采用流式电穿孔装置，所述装置包含：限定流道的壁，所述流道具有被配置为接收和暂时容纳待电穿孔细胞的悬浮液之持续流的电穿孔区域；与所述流道流体连通的流入口，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入至所述流道中；与所述流道流体连通的流出口，由此可通过所述出口将所述悬浮液从所述流道排出；在电穿孔区域内限定所述流道的壁，包含形成所述流道之第一壁的主要部分的第一电极和形成与所述第一壁相对的所述流道之第二壁的主要部分的第二电极，所述第一电极和第二电极是这样的，当将所述第一电极和第二电极与电能来源电连通时，在所述电极间形成所述悬浮液可流过的电场；并且其中所述流道的热阻小于10℃每瓦特。

9.权利要求8所述的方法，其中所述第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1比100cm。

11.根据权利要求8所述的方法，其中在所述流道中电穿孔的所述细胞不会因此被热降解。

12.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述流式电穿孔装置包含用于容纳待电穿孔细胞之悬浮液的流动室；所述流动室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1比100cm。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述比为1比70cm。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述比为1比50cm。

15.根据权利要求8所述的方法，其中所述流道的热阻为0.1℃每瓦特至10℃每瓦特。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一电极和第二电极彼此间隔至少3mm。

17.根据权利要求8所述的方法，其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1比100cm，并且其中所述第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。

18.根据权利要求8所述的方法，其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1比100cm，并且其中所述第一电极和第二电极彼此间隔至少3mm。

19.根据权利要求8所述的方法，其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1至100cm，并且其中所述第一电极和第二电极彼此间隔3mm至2cm。

20.根据权利要求6所述的方法，其中所述室的热阻为0.1℃每瓦特至4℃每瓦特。

21.根据权利要求6所述的方法，其中所述室的热阻为1.5℃每瓦特至2.5℃每瓦特。

22.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述流式电穿孔装置包含：限定了流道的壁，所述流道被配置为接收和暂时容纳包含颗粒之悬浮液的持续流；与所述流道流体连通的流入口，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入至所述流道中；与所述流道流体连通的流出口，由此可通过所述流出口将所述悬浮液从所述流道排出；限定所述流道的壁，包含形成所述流道之第一壁的第一电极板和形成与所述第一壁相对的所述流道之第二壁的第二电极板；其中选择与所述悬浮液接触的电极面积以及所述电极之间的距离以使得所述流道的热阻小于4℃每瓦特；使成对的电极与电能来源电连通，由此在所述电极之间形成电场；由此流过所述流道的颗粒的悬浮液可经受所述电极之间形成的电场。

23.根据权利要求22所述的方法，其中限定了所述流道的所述电极板还包含：由非导电材料形成的且设置在所述第一电极板和第二电极板之间以使所述电极板维持互相间隔关系的垫圈，所述垫圈限定出通道，其中形成所述流道之相对的侧壁。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述垫圈与所述第一电极板和所述第二电极板各自形成密封。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述装置包含多个流道，并且其中所述垫圈包含多个通道，形成多个通道各自相对的侧壁。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述流入口和所述流出口中的一个包含在一个电极板中形成并且与所述流道流体连通的孔。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述流入口和流出口中的另一个包含在所述一个电极板中形成并且与所述流道流体连通的孔。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述流入口和流出口中的另一个包含在另一个电极板中形成并且与所述流道流体连通的孔。

29.根据权利要求22所述的方法，其还包括与所述流道有效关联以散热的冷却元件。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述冷却元件包含热电冷却元件。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述冷却元件包含与所述电极接触流动的冷却流体。

32.根据权利要求29所述的方法，其中所述冷却元件包含与所述电极相有效关联的散热器。

33.根据权利要求22的方法，其中所述流道的热阻小于3℃每瓦特。

34.根据权利要求22所述的方法，其中所述流道的热阻为0.5℃每瓦特至4℃每瓦特。

35.根据权利要求22所述的方法，其中所述流道的热阻为1℃每瓦特至3℃每瓦特。

36.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一电极包含长形导电结构，其中所述第二电极包含管状的导电结构；其中所述电极被同心地布置以使得第二管状电极围绕与其为间隔关系的所述第一电极；并且其中所述流道设置在所述第一电极和第二电极之间限定的环形空间内。

37.根据权利要求22所述的方法，其中所述电极形成限定所述流道的壁的至少一部分。

38.根据权利要求22所述的方法，其还包括用于使所述第一电极和第二电极维持间隔开的同心关系的同心环形垫片。

39.根据权利要求22所述的方法，其中所述装置与第二类似装置串联布置。

40.根据权利要求22所述的方法，其中所述装置与第二类似装置并联布置。

41.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过流式电穿孔转染细胞包括使用热阻小于10℃每瓦特的流道。

42.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过流式电穿孔转染细胞包括使待电穿孔细胞的悬浮液流过流道；并且当流过所述流道时使所述悬浮液暴露于电场，所述电场的强度大于0.5kV/cm。

43.根据权利要求42的所述方法，其中所述电场的强度大于3.5kV/cm。

44.根据权利要求1所述的方法，其中大于50％的所述通过电穿孔转染的细胞表达外源多肽。

45.根据权利要求1所述的方法，其中50％至95％的所述通过电穿孔转染的细胞表达外源多肽。

46.根据权利要求1所述的方法，其中60％至90％的所述通过电穿孔转染的细胞表达外源多肽。

47.根据权利要求1所述的方法，其中70％至80％的所述通过流式电穿孔转染的细胞表达外源多肽。

48.根据权利要求1所述的方法，其中在选择之前和/或之后，大于50％的所述通过流式电穿孔转染的细胞有活力。

49.根据权利要求1所述的方法，其中在选择之前和/或之后，大于60％的所述通过流式电穿孔转染的细胞有活力。

50.根据权利要求1所述的方法，其中在选择之前和/或之后，大于70％的所述通过流式电穿孔转染的细胞有活力。

51.根据权利要求1所述的方法，其中在选择之前和/或之后，大于80％的所述通过流式电穿孔转染的细胞有活力。

52.根据权利要求1所述的方法，其中在选择之前和/或之后，大于90％的所述通过流式电穿孔转染的细胞有活力。

53.根据权利要求1所述的方法，其中在选择之前和/或之后，50％至90％的所述通过流式电穿孔转染的细胞有活力。

54.根据权利要求1所述的方法，其中在选择之前和/或之后，60％至90％的所述通过流式电穿孔转染的细胞有活力。

55.根据权利要求1所述的方法，其还包括对选择的转染细胞采用有限稀释以获得单细胞集落。

56.根据权利要求55所述的方法，其中使用多孔板来获得单细胞集落。

57.根据权利要求1所述的方法，其中在分批培养或悬浮培养条件下进行选择。

58.根据权利要求1所述的方法，其中在用G418以条件致死浓度培养所述细胞后，将细胞维持在具有较低浓度G418的培养基中。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述较低浓度为条件致死浓度的25％至75％。

60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述较低浓度不超过条件致死浓度的50％。

61.根据权利要求58所述的方法，其中将细胞维持在所述较低浓度下4至20天。

62.根据权利要求61所述的方法，其中在使用有限稀释对稳定转染的细胞进行克隆之前将细胞维持在所述较低浓度下。

63.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞培养在丁酸钠中。

64.根据权利要求1所述的方法，其还包括对克隆分离并选择的细胞进行扩增以产生表达外源多肽的克隆细胞。

65.根据权利要求64所述的方法，其中在包含G418的培养基中扩增经克隆分离的细胞。

66.根据权利要求65所述的方法，其中在扩增期间G418的浓度不超过G418条件致死浓度的50％。

67.根据权利要求65所述的方法，其中在扩增期间G418的浓度不超过G418条件致死浓度的25％。

68.根据权利要求64所述的方法，其中扩增细胞以用于大规模生产。

69.根据权利要求64或68中任一项所述的方法，其中在大于1L的体积中扩增细胞。

70.根据权利要求69所述的方法，其中在3L或更大的体积中扩增细胞。

71.根据权利要求70所述的方法，其中在包含G418的培养基中扩增细胞。

72.根据权利要求71所述的方法，其中G418的浓度为条件致死浓度。

73.根据权利要求1所述的方法，其中在无血清培养基中培养细胞。

74.根据权利要求73所述的方法，其还包括分离或纯化由所述细胞产生的外源多肽。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述选择的细胞产生至少0.1g/L的外源多肽。

76.根据权利要求74所述的方法，其中所述选择的细胞产生至少0.5g/L的外源多肽。

77.根据权利要求74所述的方法，其中所述选择的细胞产生至少1.0g/L的外源多肽。

78.根据权利要求74所述的方法，其中所述选择的细胞产生至少1.5g/L的外源多肽。

79.根据权利要求74所述的方法，其中所述选择的细胞产生至少2g/L的外源多肽。

80.根据权利要求74所述的方法，其中所述选择的细胞产生至少3g/L的外源多肽。

81.根据权利要求64所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内产生至少0.1g/L的外源多肽。

82.根据权利要求64所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内产生至少0.5g/L的外源多肽。

83.根据权利要求64所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内产生至少1.0g/L的外源多肽。

84.根据权利要求64所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内产生至少1.5g/L的外源多肽。

85.根据权利要求64所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内产生至少2g/L的外源多肽。

86.根据权利要求64所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内产生至少3g/L的外源多肽。

87.根据权利要求81或86中任一项所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的7周内产生该浓度的外源多肽。

88.根据权利要求87所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的6周内产生该浓度的外源多肽。

89.根据权利要求64所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内每个细胞每天产生大于10皮克的外源蛋白质。

90.根据权利要求89所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内每个细胞每天产生大于20皮克的外源蛋白质。

91.根据权利要求90所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内每个细胞每天产生大于30皮克的外源蛋白质。

92.根据权利要求91所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内每个细胞每天产生大于40皮克的外源蛋白质。

93.根据权利要求92所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内每个细胞每天产生大于50皮克的外源蛋白质。

94.根据权利要求93所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内每个细胞每天产生大于60皮克的外源蛋白质。

95.根据权利要求94所述的方法，其中扩增的克隆细胞在被转染的8周内每个细胞每天产生大于80皮克的外源蛋白质。

96.根据权利要求1所述的方法，其还包括将转染并选择的细胞进行冷冻。

97.根据权利要求96所述的方法，其还包括扩增先前冷冻的转染并选择的细胞。

98.用于生产稳定的CHO细胞表达系的方法，其包括：

a)将包含i)编码赋予G418抗性的多肽的序列和ii)编码外源多肽的序列的表达构建体转染进CHO细胞中，其中使用流式电穿孔装置进行所述转染并且其中所述表达构建体的浓度为400μg/mL以上；

b)在包含1.6mg/ml G418的培养基中选择转染的CHO细胞，其中将所转染的细胞维持两周；

c)通过有限稀释分离选择的转染的CHO细胞以获得克隆细胞；以及，

d)扩增分离的转染的CHO细胞以产生稳定的CHO细胞表达系。

99.根据权利要求98所述的方法，其还包括收集由复制的转染的CHO细胞产生的外源多肽。

100.根据权利要求98至99中任一项所述的方法，其中所述稳定的CHO细胞表达系在培养基中产生大于2g/L的外源蛋白质。

101.用于筛选高产的CHO细胞系的方法，其包括：

a)将包含i)编码赋予G418抗性的多肽的序列和ii)编码外源多肽的序列的表达构建体转染进CHO细胞中，其中使用流式电穿孔装置进行所述转染并且其中所述表达构建体的浓度为400μg/mL以上；

b)在包含1.6mg/ml G418的培养基中选择转染的CHO细胞两周；

c)通过有限稀释分离选择的转染的CHO细胞以获得克隆细胞；

d)扩增分离的转染的CHO细胞以产生稳定的CHO细胞表达系；以及，

e)就所述外源多肽的生产对细胞进行评估。

102.根据权利要求101所述的方法，其还包括鉴定作为所述外源多肽之高产者的CHO细胞系。

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