CN105368801A - 小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，小麦中发现一个新蛋白TaPPDK1，将其导入拟南芥中，转基因植物的抗盐性高于目的植物，为培育抗盐植物提供基础。

Description

小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
据估计，全球有超过6％的土地和近20％的耕地受到盐胁迫的影响，土壤的盐碱化问题日益威胁着人类赖以生存的有限土地资源。农作物绝大部分品种是盐敏感的，土壤盐渍化阻滞作物生长导致减产甚至绝收。培育耐盐性作物品种具有成本低、见效快、长远持久的特点，是提高盐渍土壤作物产量水平和经济效益的有效方法。而耐盐基因的挖掘及耐盐种质的创制是耐盐育种的重要保障。小麦作为世界上分布最广、种植面积最大、加工制品最为丰富的粮食作物之一，其农业地位的重要性不可忽视。然而由于非生物胁迫应答是由多基因控制的复杂性状，且小麦作为异源六倍体，小麦耐盐基因挖掘及耐盐分子机理的研究仍然进展缓慢。研究表明植物丙酮酸磷酸双激酶(pyruvateorthophosphatedikinase，PPDK；EC2.7.9.1)是C4光合途径中一个非常重要的限速酶，但其在植物抵御逆境胁迫中的作用尚不清楚，在小麦中更是空白。
发明内容
本发明的一个目的是提供小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白，命名为TaPPDK1，是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育高抗逆性植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，上述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性；
所述抗逆性为抗盐性；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
本发明的另一个目的是提供一种培育具有高抗逆性转基因植物的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。
上述方法中，所述抗逆性为抗盐性；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
本发明的实验证明，本发明在小麦中发现蛋白TaPPDK1，将该蛋白对应的基因在拟南芥中过表达，转基因植物的抗盐性高于野生型对照，验证了该基因具有提高植物抗盐性的功能，为培育抗盐植物提供候选基因。
附图说明
图1为盐胁迫条件下小麦根(Root)和叶片(Leaf)中PPDK在基因表达及酶活性方面的变化。
图2为TaPPDK1转化拟南芥的表达载体构建。
图3为TaPPDK1基因Pgfpgus-plus载体的构建及鉴定。
图4为35S:TaPPDK1转基因拟南芥纯系TaPPDK1mRNA表达量检测。
图5为盐胁迫下野生型和转基因拟南芥株系的萌发(A)和相对萌发率(B)。
图6为野生型和35S:TaPPDK1株系在盐胁迫下根长测量。
图7为在盐胁迫下野生型和3个转基因株系幼苗表型(A)及存活率(B)。
图8为在盐胁迫下野生型和3个转基因株系苗期表型(A)及盐胁迫第7天叶绿素含量(B)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小麦材料为济麦19(记载在如下文献中：宋建民,刘建军,刘爱峰,李豪圣,吴祥云,赵振东。济麦19面团流变学和淀粉特性与面条品质分析，麦类作物学报，2004,24(1)：15-17)幼苗，正常及350mMNaCl胁迫培养3天。
拟南芥生态型为Col-0型，种子消毒后播种于培养基上，幼苗移栽到穴盘后放入人工培养室中培养，培养条件为相对湿度80％，温度20～24℃，光照强度80～200μmol/(m2·s)，光周期为16h光照和8h黑暗。
大肠杆菌菌株为DH5α农杆菌菌株为GV3101。
实施例1、TaPPDK1基因的发现及克隆
1、TaPPDK1基因克隆
取盐胁迫及正常培养的小麦幼苗，通过iTRAQshotgun蛋白质组学的方法比较二者蛋白表达差异，RNA-seq方法比较二者基因表达差异。
根据蛋白质组学方法找到的盐胁迫下差异表达蛋白Q7XYB5(Pyruvateorthophosphatedikinase)的网上蛋白序列，在NCBI上找到其对应的部分cds序列，基因编号AF475130.1，再在NCBI上找到包含AF475130.1序列在内的AK333343.1序列。在此序列中设计引物：Q7XYB5-CF：5'-ATGCCGTCGGTTTCGAG-3'；Q7XYB5-CR：5'-TCAGACAAGGACCTGGGCT-3'。
以济麦19的根的cDNA为模板，用上述引物Q7XYB5-CF和Q7XYB5-CR进行PCR扩增，得到2820bp的PCR扩增产物。
电泳检测PCR产物，回收目的片段并连接到pGEM-Teasy载体(Promega公司)，阳性克隆送上海生工测序，PCR扩增产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该PCR扩增产物所示的基因命名为TaPPDK1，序列1为该基因的cDNA，将其编码的蛋白命名为TaPPDK1，该蛋白的氨基酸序列命名为序列2。
以济麦19根的基因组DNA为模板，用表1所示的引物进行扩增；利用DNAStar软件对获得的序列进行拼接和初步分析，得到TaPPDK1基因组DNA，经过测序，其核苷酸序列为序列3。
表1为TaPPDK1基因组序列扩增引物序列
2、TaPPDK1基因表达分析
以正常及盐胁迫下小麦根和叶cDNA为模板，进行RT-PCR检测，分析TaPPDK1基因表达变化情况。引物：RT-F:5'-CAGGCTTGGTATTTCGTATCC-3'；RT-R:5'-CCAGCTTTGTAATCAATGGTTTT-3'。以小麦Actin基因为内参，引物Actin-f：5'-GGAAAAGTGCAGAGAGACACG-3'，Actin-r：5'-TACAGTGTCTGGATCGGTGGT-3'。
结果如图1所示，JN：济麦19正常培养条件；JS：济麦19盐胁迫培养条件；A：半定量RT-PCR(引物RT-F和RT-R)；B：荧光定量RT-PCR(引物RT-F和RT-R)；C：PPDK酶活性分析；可以看出，正常条件下，在小麦根和叶片中表达量很低，而在盐胁迫条件下显著上调表达(图1A，B)；且盐胁迫下，小麦根中的PPDK酶活性显著升高(图1C)，但是在叶片中PPDK酶活性变化不大(图1C)。
实施例2、TaPPDK1基因的功能验证
一、基因植物表达载体的构建
根据TaPPDK1基因序列和表达载体pGFPGUS的多克隆位点特征，将载体上GUS切掉，并设计添加酶切位点BglⅡ和PmlⅠ的引物，
PPDK-BamHI-CF:5'-gaagatcttcATGCCGTCGGTTTCGAG-3'；
PPDK-XbaI-CR:5'-gtgTCAGACAAGGACCTGGGCT-3'。
以济麦19根cDNA为模板，用PPDK-BamHI-CF和PPDK-XbaI-CR为引物进行PCR扩增，得到2833bp的PCR产物，为基因TaPPDK1。
将序列1所示的基因TaPPDK1替换掉pGFPGUS载体(王敏娟,侯文胜,王庆钰,等.过表达GmNHX1基因提高大豆根系的耐盐性.大豆科学,2011,30(06):889-894；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)的BglⅡ和PmlⅠ酶切位点间的GUS基因得到的载体，命名为TaPPDK1:Pgfpgus，为基因植物表达载体，由35S启动子驱动TaPPDK1基因的表达(图2)。
二、转TaPPDK1拟南芥的制备与验证
将上述重组载体TaPPDK1:Pgfpgus转入农杆菌GV3101中，得到重组菌GV3101/TaPPDK1:Pgfpgus。
BglⅡ和PmlⅠ酶切验证重组菌，结果如图3所示，M：DL2000marker，1-7：挑取不同单菌落PCR扩增结果，8：阴性对照，得到2000bp的为阳性重组菌。
将上述阳性重组菌GV3101/TaPPDK1:Pgfpgus采用农杆菌介导法转化拟南芥(Arabidopsisthaliana)col-0的花(参照农杆菌介导的拟南芥蘸花侵染法参照Clough与Bent(1998)方法(CloughSJ,BentAF.1998.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ,16:735～743)：
首先将阳性重组菌GV3101/TaPPDK1:Pgfpgus活化，然后吸取1ml菌液加入40ml含有Kan(50mg/l)和Rif(50mg/l)的LB培养基中，28℃，230rpm摇床上培养至OD600达0.8左右。将菌液转移至50ml离心管内，3000rpm，离心5min，去上清液。配制侵染液(1/2MS培养基含5％蔗糖，500μl/lSilwetl-77。pH调为5.8)。向收集菌体的离心管中加入约30ml侵染液，缓慢混匀，重悬菌液。将初花的拟南芥花序浸泡在侵染液内1min左右。暗条件下处理约12h后，置于拟南芥适宜环境内，一周后，重复侵染一次。
得到T0代转TaPPDK1拟南芥，收获得到T1代转TaPPDK1拟南芥种子。将T1代转TaPPDK1拟南芥种子播种经连续的潮霉素(50mg·L-1)抗性筛选，T3代不再分离的株系视为纯合系，命名为T3代转TaPPDK1拟南芥。
以T3代转TaPPDK1拟南芥根的cDNA为模板，用Q7XYB5-F1：GGCAGCAAGGAAAAATGG；PGFPGUS-NOS-R:CAAATGGACGAACGGATAAA进行荧光定量PCR。以拟南芥AtUBQ3基因作为内参AtUBQ3-F：5'-CGGAAAGACCATTACTCTGGA-3'；AtUBQ3-R：5'-CAAGTGTGCGACCATCCTCAA-3'。以野生型拟南芥col-0为对照。
结果如图4所示，TaPPDK1在野生型拟南芥(WT)中没有表达,TaPPDK1在T3代转TaPPDK1拟南芥中都有表达，株系P-12-27-4表达量最低的设定为1，选择TaPPDK1表达量比较高的T3代转TaPPDK1拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDK1-1)，P-12-22-18(35s:TaPPDK1-2)和P-12-23-30(35s:TaPPDK1-3)进行后续耐盐性分析。
Real-timeRT-PCR采用AtUBQ3均一化表达量。误差线来自3个独立实验。
三、转TaPPDK1拟南芥的耐盐性
1、种子萌发
T3代转TaPPDK1拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDK1-1)，P-12-22-18(35s:TaPPDK1-2)和P-12-23-30(35s:TaPPDK1-3)和野生型拟南芥(col-0)种子点种在含有150MmNaCl的MS平板中，以不含NaCl的MS培养基培养为对照，播种后，4℃春化3d后置于温室(22℃)正常培养。每个株系50个种子，实验重复3次，结果取平均值。
当种子幼根已经穿出种皮被认为萌发，每天统计种子的萌发率，并依据下列公式计算相对萌发率：
结果如图5所示，A为表型，B为相对萌发率统计结果，150MmNaCl胁迫条件下，种子萌发第二天开始，T3代转TaPPDK1拟南芥株系(35s:TaPPDK1-1)、(35s:TaPPDK1-2)和(35s:TaPPDK1-3)的相对萌发率显著高于野生型拟南芥种子，到萌发第七天，T3代转TaPPDK1拟南芥株系(35s:TaPPDK1-1)、(35s:TaPPDK1-2)和(35s:TaPPDK1-3)种子相对萌发率都在80％以上，野生型拟南芥只有64.7％；
因此过表达TaPPDK1基因可以提高了转基因植物种子萌发期的耐盐能力。
2、根长实验
T3代转TaPPDK1拟南芥株系35s:TaPPDK1-1(line1)、35s:TaPPDK1-2(line2)和35s:TaPPDK1-3(line3)和野生型拟南芥(col-0)种子种植在MS平板中萌发，萌发5d后，野生型和转基因株系36个萌发的幼苗被小心的转移到新的含有150mMNaCl的MS平板中，竖直培养7d后，测量幼苗的根长，并依据下列公式计算耐盐指数：
结果如图6所示，A为表型，B为根长测量统计；可以看出，当幼苗生长在MS平板中，转基因植株的根长相比野生型植物没有明显的不同。然而，在150mMNaCl处理条件下，转基因植物根长显著长于野生型植物的根长，野生型拟南芥由根长计算来的耐盐指数为0.66，而T3代转TaPPDK1拟南芥株系(line1)、(line2)和(line3)的耐盐指数为0.78、0.75、0.77，转基因植株的耐盐性高于野生型。
3、苗期盐胁迫下表型
(1)T3代转TaPPDK1拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDK1-1或line1)，P-12-22-18(35s:TaPPDK1-2或line2)和P-12-23-30(35s:TaPPDK1-3或line3)和野生型拟南芥(col-0)种子种植于营养土与蛭石(1:1)混合土中，每盆种约500粒种子，正常培养浇水30d后，在托盘底部浇灌350mMNaCl水溶液，浇灌2次，每隔7天一次。
处理14天后，统计T3代转TaPPDK1拟南芥株系及野生型拟南芥的绿色叶片比率，结果如图7所示，A为表型，B为统计图，可以看出，野生型拟南芥受到盐胁迫后，叶片失绿严重，只有49.3％的叶片保持绿色，而3个转基因株系有82.3％，72.7％和75.7％的叶片仍然保持绿色，转基因株系耐盐能力明显高于野生型。
(2)T3代转TaPPDK1拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDK1-1或line1)，P-12-22-18(35s:TaPPDK1-2或line2)和P-12-23-30(35s:TaPPDK1-3或line3)和野生型拟南芥(col-0)种子在MS平板中萌发并生长10d后移苗至营养土与蛭石(1:1)混合土中，每盆移栽5株，正常培养浇水45d后，在托盘底部浇灌350mMNaCl水溶液，处理7天和11天后，观察T3代转TaPPDK1拟南芥株系及野生型拟南芥的表型，并测定处理7天后拟南芥植株叶绿素含量。
叶绿素含量的测定：植株的叶片被摘下，浸入水中或300mMNaCl水溶液中，测量叶绿素含量。在23℃，14h光照/10h黑暗的光照循环条件，放置36h。80％丙酮萃取叶绿素，使用DU800分光光度计(Fμllerton，CA，USA)测量663和645nm的吸光率。叶绿素含量计算公式Chl＝(0.0802×A663+0.202×A645)/W，单位为mg/g，其中A663，A645分别是叶绿素溶液在波长663nm和645nm处的吸光值。每个株系测定5个植株，W为植株重量。独立实验重复三次。
结果如图8所示，A为表型，B为统计图，发现盐胁迫7天后，和转基因拟南芥相比，野生型拟南芥失绿严重，叶绿素含量仅为0.96mg/g，而T3代转TaPPDK1拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDK1-1)，P-12-22-18(35s:TaPPDK1-2)和P-12-23-30(35s:TaPPDK1-3)叶绿素含量为1.69，1.16和1.32mg/g。处理11天后，转基因拟南芥和野生型表型差异更明显(图8A)，转基因株系苗期耐盐能力明显高于野生型。
上述实验均表明，TaPPDK1具有提高植物耐盐性的功能。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育高抗逆性植物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
9.一种培育具有高抗逆性转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述抗逆性为抗盐性；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
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CN102002496A (zh) * 2010-11-15 2011-04-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 与光合作用相关的dna分子及其应用
CN105063024A (zh) * 2015-07-24 2015-11-18 江苏省农业科学院 玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性ssr标记及其应用

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贾永光: "丙酮酸磷酸双激酶及其基因结构", 《植物生理学通讯》 *

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