CN105368725A

CN105368725A - 一种培养铁皮石斛漆斑病菌的培养方法

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Publication number: CN105368725A
Application number: CN201510968258.5A
Authority: CN
Inventors: 王连平; 方丽; 王汉荣
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: CN105368725B

Abstract

本发明提供一种培养铁皮石斛漆斑病菌的方法，该方法包括：提供荷叶煎汁培养基，其中该荷叶煎汁培养基的组成为：荷叶200g，蔗糖20g，琼脂20g，添加水至1000ml。使用本发明的培养基和培养方法可以大量获得该病菌的孢子。

Description

一种培养铁皮石斛漆斑病菌的培养方法

技术领域

本发明属于微生物领域，特别的，属于采用培养方法来培养铁皮石斛漆斑病菌的培养方法。

背景技术

铁皮石斛(DendrobiumSw.)又名黑节草、云南铁皮，是兰科(Orchidaceae)多年生附生草本植物，是一种珍贵的中药材。早在《神农本草经》中就有记载，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身、镇痛消炎的功效。同时现代研究表明，石斛药材除具有本草记载的等功效外，还具有抗肿瘤、抗辐射、抗血小板凝集及增强机体免疫力等功效。近年来石斛药材的需求量不断增加，而栽培技术的不断创新使得人工种植石斛的面积不断增大，然而随着集中种植面积的增加，出现的问题也不断增多，石斛种植出现多种不同的病害，例如铁皮石斛漆斑病。叶片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小点，后扩展为1～2mm大小的圆形或椭圆形病斑，中间凹陷、灰白色，病健交界处似围绕一条淡褐色至黑褐色的边界线。叶鞘和花梗染病后常引起休眠枝干的早衰老或顶部枯死。这不仅影响石斛的品质，也影响石斛的产量，具统计漆斑病导致产量损失5％-10％。防止漆斑病的发生和扩增有助于提高石斛生产的产量和品质，确保石斛产业健康有序的发展。为了研究如何防治铁皮石斛的漆斑病，就需要首先培养漆斑病来进行一些方面的研究，例如研究该病菌的生物学特性，药效试验等筛选出合适的药物进行防治。但是，这种病菌难以培养，而且产量低，为此，需要提供如何高效率的培养漆斑病病菌进行相关方面的研究。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种培养铁皮石斛漆斑病菌的方法，该方法包括：提供荷叶煎汁培养基，其中该荷叶煎汁培养基的组成为：荷叶200g，蔗糖20g，琼脂20g，添加水至1000ml。

优选的，荷叶煎汁培养基经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g荷叶，煮沸5min，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

优选的，培养的PH值为7或8.

优选的，培养的温度为25-30摄氏度。

优选的，所述的铁皮石斛漆斑病菌为露湿漆斑菌(MyrotheciumroridumTodeexFr.)。

另一方面，本发明提供荷叶煎汁培养基在制作培养铁皮石斛漆斑病菌培养基中的用途，其中所述的荷叶煎汁培养基由下列组分组成：荷叶200g，蔗糖20g，琼脂20g。

优选的，优选的，荷叶200g经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g荷叶，煮沸5min，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

优选的，培养的PH值为7或8。

优选的，培养的温度为25-30摄氏度。

另一方面，本发明提供一种培养铁皮石斛漆斑病菌的培养基,该培养的组成如下：氮源化合物3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，糖源物质30g，琼脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物质为蔗糖、葡萄糖、半乳糖、菊糖。

优选的，糖源物质为菊糖。

优选的，所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸钾。

优选的，所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸。

一种培养基在用于制备培养铁皮石斛漆斑病菌培养基中的用途，其中，所述的培养基的组成如下：氮源化合物3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，糖源物质30g，琼脂20g，其中所述的糖源物质为麦芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纤维乙糖。

优选的，糖源物质为纤维乙糖。

优选的，所述的氮源化合物为，L-脯氨酸、亚硝酸钠、L-丙氨酸。

有效效果

通过本发明的特异培养基和培养方法，可以获得优质、大量的漆斑病菌，为研究漆斑病菌提供了有益的材料。

具体实施例子

1材料与方法

1.1铁皮石斛漆斑病病样采集及病原菌的分离

田间铁皮石斛漆斑病病样采集于浙江省乐清县雁荡山镇的乐清铁枫堂铁皮石斛基地、乐清同丰铁皮石斛基地、乐清灵岩铁皮石斛基地；采样后将标样放入保鲜袋带回实验室置于5℃冰箱，待用。切取铁皮石斛漆斑病镜检并用PSA培养基分别于进行常规组织分离和划线分离。

1.2致病性测定

分别采用分离自铁皮石斛漆斑病病样分离物的菌丝和分生孢子液(稀释成1×10⁶个/mL)，对石斛进行嫩枝活体伤口和无伤接种，在25℃的XT5401-CD275TJH智能生物人工气候箱内，RH98％以上，12小时光照12小时黑暗接种后培养，以健康的枝条为对照，重复3次，每天定时观察记录发病情况，分析致病性。

1.3病原菌的培养性状

病原菌接种于PSA上于25℃培养7d，记录菌落形态，颜色；测量100个分生孢子的大小，重复3次，记录平均值。

1.3.1不同培养基对铁皮石斛漆斑病病原菌菌丝生长及分生孢子产生的影响。

病原菌于25℃用下表中的培养基培养，每处理重复6次,5d后测量菌落直径，菌丝干重、

分生孢子器的产生情况、及其菌落色泽等。

表1：不同培养基的配方

*煎汁培养基的准备过程：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g相应的物品，煮沸5min，过滤留滤液，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

1.3.2，针对最优选的培养基(荷叶煎汁)，我们确定不同pH值对铁皮石斛漆斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响将直径4.0mm的菌丝块移于pH值4-12的不同pH值的草莓煎汁培养基上(pH值采用pHS-9V酸度计测量配制)，置于25℃培养，每处理重复6次,6d后测量菌落干重，计算分生孢子数量。

1.3.3不同温度对铁皮石斛漆斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响将直径4.0mm的菌丝块移于荷叶煎汁培养基平板上，置于5℃,10℃,15℃,20℃,25℃,30℃,35℃不同温度下培养，每处理重复6次,6d后测量菌落直径和分生孢子数量。

1.3.4不同糖源对铁皮石斛漆斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响。

经过我们的大量研究，发现，当以荷叶煎汁培养基来研究最佳糖源和氮源对该病菌培养的影响的时候，发现不同的糖源对培养的性状(菌落干重和产孢情况)并没有实质的差异，也就是说不同的糖源或氮源似乎起到同样的作用，没有实质的改善和影响，同样，在其他类似的培养基上，例如树皮煎汁培养基，甘蔗煎汁培养基，草莓煎汁培养基，燕麦培养基(OMA培养基)获得与荷叶煎汁培养基类似的结果(具体数据略)。

相反，查氏培养基为基础培养基，再分别用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、可溶淀粉、半乳糖、海藻糖、甘露醇、木糖、DEAE纤维素、乙醇、核糖、果糖、山梨糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、乳糖、麦芽糖、纤维素钠、纤维乙糖等20种不同糖源等量置换蔗糖(含量与蔗糖一样)，于25℃下培养，每处理重复6次，6d后测量菌落直径，观察菌落干重和产孢情况，获得了不同的结果，具体见结果分析。

1.3.5不同氮源对铁皮石斛漆斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响。

以查氏培养基为基础培养基，分别用谷氨酸、谷氨酰氨、天门冬酰氨、天门冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、酪氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、酪蛋白水解物、尿素、硫酸铵、硝酸钾、亚硝酸钠等26种氮源等量置换硝酸钾或硝酸钠(质量与硝酸钾一样)，置于25℃培养，每处理重复6次，6d后测量菌落直径，观察菌落干重和产孢情况。

2.0结果与分析

2.1铁皮石斛漆斑病的症状

病原菌主要侵染危害叶片,以及衰老的叶鞘和花梗，衰老或休眠的茎干。叶片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小点，后小点渐渐扩大，直至1～2mm大小。病斑圆形或椭圆形，中间凹陷、灰白色，病健交界处似围绕一条淡褐色至黑褐色的边界线。严重时，较老的叶片上出现许多大小不一的病斑，一般新叶不染病。当叶鞘和花梗衰老变得灰白时易染病，染病后在其上长出黑色小点，即病原菌的分生孢子器。衰老而灰白的叶鞘和花梗染病后常引起衰老或休眠茎干的顶部枯死，其上有时也长出黑色小点，即病原菌的分生孢子器。

2.2病原菌的分离和致病性测定

对几十个石斛漆斑病标样进行划线分离和常规组织分离，5d后，培养皿上长出少量细菌和不同的真菌，将这些细菌和真菌置于适宜的温湿度条件下对在相同铁皮石斛健康的枝叶进行柯赫法则检验，发现这些细菌大都为芽孢杆菌，均为非致病菌；其中重复分离到的一种真菌分离物为疑似病原物。将这种真菌分离物置于适宜的温湿度条件下在相同铁皮石斛健康的枝叶进行接种检验，这些真菌分离物均对石斛叶致病，发病病症与田间基本一致，通过分子生物方法鉴定为即为石斛漆斑病病原菌。

2.3病原菌分离物的形态及培养性状

该病原菌在培养基上菌落圆形；边缘圆整，与多数菌不同，肉眼末见明显的因生长面成的放射状缺刻；扩展较慢。在PSA培养基上白色，在有些人工添加氨基酸或无机氮的培养基上其菌落背面呈粉红色。该病原菌在PDA、PSA培养基上培养10～15d后产生可见的黑色的油滴状物质团，一般呈环带分布在菌落中央和接种菌丝块的周围；观察发现，这些油滴状物质团是该死菌的分生孢子堆；实验还发现，类似炭疽病菌，该菌在机械损伤的菌落处可产生大量的分生孢子堆。

该菌较易产生无性孢子，其产孢量也大，其分生孢子堆垫状，分生孢子梗无色、帚状重复分枝；分生孢子顶生于梗上、单细胞、椭圆形至短杆形，分生孢子大小(5～9)μm×(1～2.5)μm，成团埋生于油滴状物质中。对田间采集的病样和人工培养菌落的大量观察，末发现其有性子实体。

2.5病原菌鉴定

根据对铁皮石斛漆斑病的病原菌分离物的形态学特征、培养性状和致病性测定的研究结果(具体实验数据略)，参阅文献(李宝聚等,2009)及吴文平(1991)对漆斑菌属4个种的研究；确定铁皮石斛漆斑病是由半知菌亚门(Deuteromycotina)、丛梗孢目(Moniliales)、瘤座菌科(Tuberculariaceae)、漆斑菌属(Myrothecium)、露湿漆斑菌(MyrotheciumroridumTodeexFr.)引起的。

2.6不同培养基对石斛漆斑病菌菌丝生长的影响(具体结构见表2)

在7种不同培养基上于25℃恒温下平皿培养实验显示：该菌在所有培养基上均能生长、繁殖，但以荷叶煎汁培养基、PSA、OMA、石斛煎汁、树皮煎汁培养基上较为适宜，不仅生长速度快，而且每皿产生的分生孢子数量大，其中以荷叶煎汁培养基培养基的产孢数量最大，可达5.17×10⁹个/ml(表2)。

表2不同培养基对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

培养基

r(t＝7d)

r(logit)

t(S＝50％)

每皿孢子数(10⁹)

厚度

色泽

PSA培养基

3.774

0.491

11.02

2.12bc

+++

白

OMA培养基

2.458

0.426

12.7

2.45bc

+++

白

Czpak培养基

3.494

0.479

11.29

1.65bc

++

白

树皮煎汁培养基

2.113

0.404

13.39

3.18b

++

白

石斛煎汁培养基

2.233

0.412

13.13

2.84bc

++

白

甘薯煎汁培养基

1.785

0.38

14.24

0.93bc

++

白

荷叶煎汁培养基

1.502

0.356

15.2

5.17a

++

白

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。

2.7pH值对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响(表3)

经测定石斛漆斑病菌在pH值5～12范围内均能生长，pH为6.0～10.0时较适其生长繁殖，当pH值处于5.0-6.0间时，该菌能生长但不能产生分生孢子；pH值为7.0、8.0为最适，期间菌落生长速度快，且产孢数达到最高值5.63×109、6.67×109(表3)。因此本试验说明该菌生长和繁殖pH值较为宽泛，最适pH值为7.0～8.0，在pH值为6.0～10.0范围内均能生长，属喜欢中性偏碱的真菌。

对于本发明的部分数据都进行了方差分析，各个处理之间的分析结果都标示在相应的处理上，其中，当各个上标的字母不相同的时候(单个字母)，表示他们之间存在显著差异，如果上标的字母为2个或两个以上，表示他们之间没有差异，但是单个字母的处理与2个字母的处理之间存在显著差异。本领域的一般人员看到这样的表示方法后容易明白他们的关系。

表3不同pH值对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

2.8温度对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响(表4)

经测定石斛漆斑病菌在pH值10℃～35℃范围内均能生长，15℃～35℃较适其生长繁殖，其中，以30℃、25℃为最适，其菌落面积日均增长率分别为4.993、3.54；但该菌对产孢的温度要求较高，20℃以上，35℃以下才能产生分生孢子盘，分泌足够多的孢子数量，30℃为最适的生长和产孢温度，每皿的分生孢子数可达为3.98×1010个/mL(表4)。

上述实验结果说明，该菌生长和繁殖温度较为宽泛，最适温度为25℃～30℃，较适温度范围为15℃～35℃，属喜欢中温偏高温的真菌。

表4不同温度对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。2.9糖源对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

经20种不同糖源对石斛漆斑病菌菌丝生长、分生孢子形成的测定表明：该菌均能利用本试验所提供的20种单糖、双糖、多糖作为糖源，其中以菊糖、鼠李糖、乳糖、山梨醇、蔗糖较适宜于该菌菌丝生长，5d的菌落直径分别达45.0、31.5、30.0、27.5和26.6mm，但鼠李糖和山梨醇对分生孢子的形成并不十分有利，而乳糖上气生菌丝生长少，菌落也较薄，不适于作为培养基；因此结合菌落的生长速度、产孢量及干重，认为蔗糖、葡萄糖、半乳糖、菊糖和甘露糖是该菌的最适糖源(表5)。

表5不同炭源对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。2.10氨基酸对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

经27种有机氮和无机氮对石斛漆斑病菌菌丝生长及分生孢子形成的测定表明：从表中可看出，极大多数氨基酸和无机氮有均利于该菌的菌丝生长，但该菌仅能利用部分氨基酸和无机氮形成分生孢子，完成繁殖。其中以L-丙氨酸、亚硝酸钠、L-苏氨酸、L-脯氨酸、谷氨酰氨较适宜菌丝生长(表6)。L-脯氨酸、谷氨酰氨、L-苏氨酸、L-丙氨酸、亚硝酸钠适于分生孢子的产生，其中以L-脯氨酸为氮源的菌落每皿的产生的孢子数最多，可达11.80×107个/mL。其菌落生长也表现为厚实。因此，L-脯氨酸、亚硝酸钠、L-丙氨酸是适宜该菌的氮源。

表6不同氮源对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

Claims

1.一种培养铁皮石斛漆斑病菌的方法，该方法包括：提供荷叶煎汁培养基，其中该荷叶煎汁培养基的组成为：荷叶200g，蔗糖20g，琼脂20g，添加水至1000ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，荷叶煎汁培养基经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g荷叶，煮沸5min，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，培养的PH值为7或8。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，培养的温度为25-30摄氏度。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的铁皮石斛漆斑病菌为露湿漆斑菌。

6.一种荷叶煎汁培养基在制作培养铁皮石斛漆斑病菌培养基中的用途，其中所述的荷叶煎汁培养基由下列组分组成：荷叶200g，蔗糖20g，琼脂20g。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，荷叶煎汁培养基经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g草莓茎叶，煮沸5min，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

8.根据权利要求6所述的用途，其中，养的PH值为7或8；培养的温度为25-30摄氏度。