CN105358676B

CN105358676B - 含穿心莲萃取物或穿心莲内酯或其盐的皮肤状态改善用合成物

Info

Publication number: CN105358676B
Application number: CN201480000256.0A
Authority: CN
Inventors: 李宰昊; 刘指宁; 郑恩善; 朴德勋; 李子丹; 刘光荣; 唐健
Original assignee: Infinitus China Co Ltd; Bio Spectrum Inc
Current assignee: Infinitus China Co Ltd; Bio Spectrum Inc
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2034-04-14
Also published as: KR20150116659A; KR101694958B1; CN105358676A; WO2015156439A1

Abstract

本发明涉及含穿心莲萃取物或穿心莲内酯或其盐的皮肤细胞增殖用合成物，及还所述合成物的皮肤状态改善用合成物。本发明所述合成物引发干细胞和皮肤细胞分泌生长因子(growth factor)，促进细胞增殖。本发明的所述合成物可以改善皮肤皱纹、抑制皮肤老化、改善皮肤弹力、提高皮肤再生能力、提高治愈伤口及伤疤等，有皮肤状态改善效果。

Description

含穿心莲萃取物或穿心莲内酯或其盐的皮肤状态改善用合成物

技术领域

本发明涉及含穿心莲(Andrographis paniculata)萃取物或穿心莲内酯(Andrographolide)或其盐的皮肤细胞增殖用合成物，及还所述合成物的皮肤状态改善用合成物。

背景技术

皮肤老化首先显现在皮肤。为了延迟或预防这种现象，已在化妆品领域做了很多相关研究。皮肤老化通常从25岁开始发生，40岁前后进入真正的皮肤老化期。皮肤老化的典型现象为皮脂分泌量减少、皮肤发干，细胞再生迟缓，老化角质积累、皮肤变得粗糙。另外，支撑表皮的胶原纤维(collagen)合成量减少，导致弹性蛋白(elastin：弹性纤维)变性，产生皱纹。同时皮肤颜色会发生变化，出现痣、斑纹等色素沉积症状，表皮变薄、皮肤保护功能下降。之外，随着皮肤的厚度变小，皮肤的屏障作用(Barrier Effect)下降，引发更多的皮肤问题。

皮肤老化相关研究主要涉及让皮肤免受皮肤老化主要成因紫外线与活性氧伤害的材料，皮肤皱纹改善材料，皮肤弹性增进材料，皮肤保湿强化材料，抑制生痣的材料。

皮肤发生老化后，真皮会发生显著的变化，70岁以后出现的真皮萎缩是典型的老化现象。真皮的变化是起因于纤维原细胞(fibroblast)的数字减少和它们的能力下降致使细胞外基质中的大分子量物质发生变化。其具体变化有胶原纤维束(collagen bundle)的分离，黏多醣(mucopolysaccharide)合成减少，胶原纤维与弹力纤维(elastin)数量及直径减少，胶原纤维与弹力纤维降解及血管的膨胀等。通常，皮肤的水分含量，胶原纤维含量及对外部环境的免疫作用能力等各种综合因素中，对皱纹的形成影响最大的指标是纤维母细胞活化时的纤维母细胞增殖及由纤维母细胞合成的胶原纤维弹性纤维等指标。目前为止，穿心莲萃取物与穿心莲内酯对纤维原细胞的影响，还从未有人揭示过。

皮肤上，干细胞所处位置大体上有三个部位。第一是存在于称为毛囊和毛囊之间的表皮(interfollicular epidermis：滤泡间上皮)的表皮基底细胞层(the basal celllayer of epidermis)。第二是毛囊(hair follicle)。存在于该部位的干细胞是产生细胞分化之前的细胞，在细胞表皮的再生方面，起最重要的作用。第三是存在于皮下脂肪层的脂肪干细胞(Adipose Derived Stem Cells)。存在于皮肤的干细胞与皮肤健康息息相关，起综合调节作用，可以说是与皮肤健康关系最密切的重要细胞群。干细胞在存活的过程中，进行不断的细胞分裂，生成各种细胞活化物质，活化周围细胞，让细胞免受有害环境的影响，抑制细胞的老化，可以再生或修复有问题的部位。但是干细胞同样是细胞群，随着年龄的增长其功能会逐渐丧失。即，皮肤的干细胞也随着老化，会逐渐丧失其活性，细胞分裂能力下降，逐渐处于非活化状态，会产生老化引起的皱纹，黑斑，伤口愈合缓慢，修复缓慢等各种问题。如果活化存在于皮肤的干细胞，则应该能够避免干细胞的老化，恢复其活性(Journalof Dermatological Science(2004)35,113-123)。

干细胞化妆品是利用来自人体或动物的细胞或其副产物制造的产品。但其安全性受到人们的质疑，目前干细胞材料开发方式转变成开发与干细胞培养液中有益皮肤成分相同的成分，或者探索活化干细胞的成分。

与此相关，韩国公开专利第10-2010-0042708号公开一种作为有效成分含阿曼托黄素(Amentoflavone)，通过提高α6整合素(α6integrin)的表达，促进皮肤表皮干细胞(keratinocyte stem cell,KSC)的增殖的皮肤再生促进用合成物，而韩国公开专利第10-2010-0018278号公开一种通过增加人体表皮角化细胞干细胞(Epidermal KeratinocyteStem Cells,KSC)数量，作为有效成分含紫花前胡素(Decursin)的药学合成物。

但，目前为止，穿心莲萃取物及穿心莲内酯的有关干细胞增殖及皮肤再生的功效还未曾得到揭示。

本发明的发明人以天然材料为对象，探查干细胞活化及皮肤细胞活化功效的结果，发现穿心莲萃取物及从其分离的穿心莲内酯具有最优秀的活性功效，完成了本发明。

发明内容

发明目的

因此，本发明的目的在于提供一种作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯或其盐的皮肤干细胞性能增进用合成物或皮肤细胞增殖用合成物。

本发明的另一目的在于提供一种含所述合成物的皮肤状态改善用合成物。

本发明的另一目的在于提供一种所述皮肤状态改善用合成物的在药剂、化妆材料、及/或食品方面的用途。

本发明的另一目的在于提供一种向个体投入所述干细胞性能增进用合成物或皮肤细胞增殖用合成物，提高个体干细胞或皮肤细胞中的某一种以上细胞活性的方法及其用途。

本发明的另一目的在于提供一种向个体投入所述干细胞性能增进用合成物或皮肤细胞增殖用合成物，改善个体皮肤状态的方法及其用途。

本发明的另一目的在于提供一种向个体投入所述皮肤状态改善用合成物，改善个体皮肤状态的方法及其用途。

技术方案

本发明提供一种作为有效成分含选自穿心莲萃取物或穿心莲内酯或穿心莲盐的中的某一种以上物质的脂肪干细胞或表皮干细胞的干细胞性能增进用合成物。

本发明中，穿心莲(Andrographis paniculata)是爵床科(Acanthaceae)的单年生草木，是在印度全域、特别是在南部的野外或树丛的阴凉、水分充足的地方生长的植物。植物高为0.3-1.0m，茎呈深绿色、粗2-6mm，叶长8cm、宽2.5cm，呈柳叶状，叶尖尖，花色呈白色或淡粉红色，有紫色斑纹。穿心莲植物的所有部位味道均极苦，叫做Maha-tita(摩诃泰坦)(King of bitters(比特王))，虽然远矮于印度楝(Neem)，但形状很像，而且同样很苦，又叫做bhui-neem。据知穿心莲有抗癌、消炎、抗菌、抗病毒的作用，作为民间药材用于免疫证、化痰、解热等。

本发明的穿心莲萃取物是对所述穿心莲的全草、叶子、根、茎、花等，以通常的方法进行萃取，或者从此分离的具有干细胞性能增进及皮肤细胞增殖活性，可改善皮肤状态的物质。另外，所述萃取物不仅包括以通常方法从传勤练萃取物萃取的萃取液，还包括利用其干燥粉末或利用此制剂化的所有形态的物质。

本发明的穿心莲萃取物可以通过水或有机溶剂萃取，所萃取的液体，可以以液体形式使用或，通过浓缩及/或干燥使用。所述有机溶剂是甲醇(Methanol)、乙醇(Ethanol)、异丙醇(isopropanol)、丁醇(butanol)、乙烯(ethylene)、丙酮(acetone)、己烷(hexane)、醚(ether)、氯仿(chloroform)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、乙酸丁酯(Butyl acetate)、二氯甲烷(dichloromethane)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethyl Formamide：DMF)二甲基砜(dimethyl sulfoxide：DMSO)1,3-丁二醇(1,3-butylene glycol)、丙二醇(propyleneglycol)或这些物质的混合溶剂，在不破坏萃取物有效成分或最低限度降低所述破坏的条件下，以室温或通过加热萃取。按萃取的有机溶剂，萃取物有效成分的萃取程度和损失程度会有所差异，因此选择适当的有机溶剂进行萃取。萃取方法上没有特别限制，比如可以采用冷浸萃取、超声波萃取、环流萃取等方法。

过滤是从萃取液去除悬浮固体粒子的过程，利用棉、尼龙等过滤粒子或者可以采用超滤法(Ultrafiltration)、冷冻过滤法、离心分离法等，但不限于此。另外，可以外加包括通过多种层析法(chromatography：与大小、电荷、疏水性或亲和性相关的层析法)进行的分离过程。干燥滤液的步骤包括冻结干燥、真空干燥、热风干燥、喷雾干燥、减压干燥、泡沫干燥、高频干燥、紫外线干燥等，但不限于此。根据情况可以追加把最终干燥的萃取物进行粉碎的工序。

本发明的穿心莲内酯(andrographolide)是二萜内酯(diterpenoid lactone)类物质，具有如下化学式1的结构，其IUPAC名称为3-[2-[decahydro-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-2-methyle ne-1-napthalenyl]ethylidene]dihydro-4-hydroxy-2(3H)-furanone，分子量为350.45g/mol。

【化学式1】

所述穿心莲内酯的抗癌功效已经广为认知，之外，其消炎功效和抗过敏功效也被大家公知。但如本发明，其对皮肤干细胞的干细胞性能增进功效及皮肤增殖功效还未曾揭示。

本发明的穿心莲内酯比如可从爵床科(Acanthaceae)植物穿心莲(Andrographispaniculata)萃取或精制，或者通过采购市场商品容易获得。

获得穿心莲内酯的具体萃取方法如下。比如，可以粉碎干燥的穿心莲后，依次通过水、碳氢1-4的无水或含水低级醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等)、所述低级醇和水的混合溶剂、丙酮(acetone)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、氯仿(chloroform)、1,3-丁二醇(1,3-butylene glycol)等萃取溶剂进行萃取获得。

获得穿心莲内酯的具体精制方法如下。比如，可以利用在一定分子量上有阻隔(cut off)值的超滤膜(ultrafiltration membrane)进行分离，或者通过各种层析法(chromatography：与大小、电荷、疏水性或亲和性相关的层析法)进行的分离。

穿心莲内酯的市场商品具体有西格玛公司、阿德里奇公司、Calbiochem公司等供应的穿心莲内酯。

本发明使用的穿心莲内酯，可以使用所述萃取、精制品、合成品及市场商品中的任意一种，也可以使用含穿心莲内酯的植物萃取物。比如，据知，所述穿心莲在叶子及根中含穿心莲内酯(Jayakumar T et al.,Evidence-Based Complementary AlternativeMedicine,2013,2013:846-740)。

本发明的穿心莲内酯可以采用从药学、化妆品学及/或食品学方面允许的盐的形态或在体内转变成穿心莲内酯的形态(比如，前体药物(prodrug))。所述盐有药学、化妆品学及/或食品学方面允许的通过游离酸(free acid)形成的酸附加盐或通过碱基形成的金属盐。所述游离酸可以使用无机酸和有机酸。无机酸可举例的有盐酸、硫酸、溴酸、亚硫酸或磷酸等。有机酸可举例的有柠檬酸(citric acid)、草酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸(gluconate)、甲磺酸(MethaneSulfonic Acid)等。所述金属盐有碱性金属盐或碱性土金属盐(alkaline earth meter salts)，可以有利使用钠、钾或钙盐。

本发明的穿心莲萃取物、穿心莲内酯及其盐具有干细胞性能增进功效。

本发明中肝细胞性能(stemness)是指干细胞具有的自我再生能力和稳定性，干细胞有活性的状态。另外，肝细胞性能增进是指干细胞的活性增加，从而诱发细胞成长因子的分泌，促进细胞增殖。

作为具体例，用穿心莲萃取物及穿心莲内酯分别对脂肪干细胞或表皮干细胞，按一定浓度进行处理时，与未处理的情况相比，与浓度相关，增加干细胞的生存及增殖。

另一具体例，所述干细胞是存在于皮下脂肪层的脂肪干细胞(Adipose derivedstem cells；ADSCs)及存在于表皮基底层的表皮干细胞(Epidermal stem cells；EpSCs)。脂肪干细胞最好是人类的脂肪干细胞(human adipose derived stem cells；hADSCs)。表皮干细胞最好是人类表皮干细胞(human epidermal stem cells；hEpSCs)。

作为另一形态，本发明提供一种作为有效成分含选自穿心莲萃取物、穿心莲内酯及穿心莲内酯的盐的某一种以上物质的皮肤细胞增殖用合成物。

所述穿心莲萃取物、穿心莲内酯及其盐同上所述。

本发明中，皮肤细胞的增殖是指皮肤细胞的活性增加。皮肤细胞的活性增加会引发成长因子的分泌，促进细胞增殖等，促进形成细胞外基质(extracellular matrix；ECM)的胶原纤维、弹性纤维、玻尿酸(hyaluronate)等成分的合成。

作为具体例，用穿心莲萃取物及穿心莲内酯，以不同浓度分别对纤维原细胞进行处理时，与未处理的情况相比，与浓度相关，增加干细胞的生存及增殖。

本发明的所述干细胞性能增进合成物及/或皮肤细胞增殖合成物展现皮肤状态的改善用途。

本发明中，所述皮肤状态的改善是指缓和、抑制或提高由于皮肤细胞的功能下降或损失引发的皮肤外观及触感出现的现象。这里，作为一具体例，所述干细胞是存在于皮下脂肪层的脂肪干细胞(Adipose derived stem cells；ADSCs)及存在于表皮基底层的表皮干细胞(Epidermal stem cells；EpSCs)。

具体地，皮肤干细胞或皮肤细胞的功能下降或损失等引发产生皱纹、皮肤老化、皮肤弹力减少、皮肤表皮上留下由受伤引发的伤疤等。本发明的皮肤状态的改善包括皮肤皱纹的改善、皮肤老化的抑制、皮肤弹力的改善、皮肤再生及皮肤表皮出现的伤口或伤疤的改善等。

本发明的干细胞性能增进合成物及/或皮肤细胞增殖合成物表现出皮肤状态的改善用途。因此，本发明提供一种可改善皮肤状态的化妆材料、药剂及食品合成物。

作为具体例，本发明的皮肤状态改善用合成物可以以直接适用于皮肤的化妆材料合成物形式提供。

把本发明的合成物利用为化妆品合成物时，除了含所述皮肤状态改善用合成物外，还包括通常用于化妆材料合成物的各种成分。比如抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料及香料等常用辅助剂及载体。

本发明的化妆品合成物可以制造成本行业通常制造的任意剂型形式，比如可以制造成溶液、悬浊液、乳状液、膏(paste)、凝胶(gel)、奶油(cream)、露(Lotion)、粉(powder)、香皂、含表面活性剂清洗剂(cleansing)、油(oil)、粉末粉底(foundation)、乳状液粉底、蜡粉底及喷雾剂(spray)等剂型，但不受限于此。更详细地，可以制造成柔和化妆水、营养化妆水、营养膏、按摩奶剂(cream)、精髓液(essence)、眼霜(eyecream)、清洗(cleansing)奶剂、清洗泡剂、清洗水、面膜、喷雾剂或粉等剂型。

本发明的剂型如果是膏、奶剂或凝胶，则作为载体可以利用动物油、植物油、蜡(wax)、石蜡(paraffin)、淀粉、黄芪胶(tragacanth)、纤维素衍生物、聚乙二醇(polyethylene glycol)、硅胶、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。

本发明的剂型如果是粉或喷雾剂，则作为载体可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝(aluminium hydroxide)、硅酸钙(calcium silicate)、聚酰胺(Polyamide)粉，特别是喷雾剂时，可以外加包括含氯氟烃(chlorofluorocarbon)、丙烷/丁烷或二甲基醚(dimethyl ether)等喷雾体。

本发明的剂型如果是溶液或乳状液，则作为载体可以利用溶剂、溶解剂或油化剂，比如可以使用水、乙醇(Ethanol)、异丙醇(isopropanol)、碳酸乙酯(ethyl carbonate)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、苄醇(Benzyl alcohol)、苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)、丙二醇(propylene glycol)、1,3-丁二醇油(1,3-butylene glycol oil)、甘油脂肪族酯(Glycerol fatty esters)、聚甘油(polyethylene glycerol)或山梨糖醇酐(Sorbitan)的脂肪酸酯(aliphatic ester)等。

本发明的剂型如果是悬浊液，则载体成分可以利用水、乙醇或丙烯甘油(propylene glycerol)等液态稀释剂，羟乙基(ethoxyl)化异硬脂醇(IsostearylAlcohol)、聚氧乙烯山梨糖醇酯(polyoxyethylene sorbitol ester)、聚氧乙烯山梨酸酯(polyoxyethylene sorbitan ester)等悬浊剂，微小结晶型纤维素(cellulose)、偏氢氧化铝(aluminum meta-hydroxide)、膨润土(bentonite)、琼脂(Agar)或黄芪胶(tragacanth)等。

本发明的剂型如果是含表面活性剂的清洗剂，则作为载体可以利用脂肪醇硫酸酯(fatty alcohol sulfate)、脂肪醚硫酸酯(fatty ether sulfate)，磺基丁二酸单酯(Sulfosuccinic acid monoester)、羟乙磺酸盐(isethionate)、咪唑啉(imidazolinium)衍生物、甲基牛磺酸盐(Methyl Taurate)、肌氨酸盐(sarcosinate)、脂肪酸醚硫酸盐(fatty acid amid ether sulfate)、烷基酰胺甜菜碱(alkyl Amido Betaine)、脂肪醇、脂肪酸甘油酯(fatty glyceride)、脂肪酸二乙醇酰胺(fatty diethanolamide)、植物油、羊毛脂(lanolin)衍生物或羟乙基(ethoxyl)化甘油脂肪酸酯(glycerol fatty ester)等。

本发明的化妆品合成物所含成分除了有有效成分和载体之外，还包括常用于化妆品合成物的各种成分，比如可以含抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料及小廖等常用辅助剂。

本发明的皮肤状态改善用合成物可以以直接用于皮肤的制药学上的合成物形式提供。

如果以制药学上的合成物利用本发明的合成物，则除了包含所述皮肤状态改善用合成物之外，还可以含制药学上允许使用的载体、赋形剂及稀释剂。本发明的制药学合成物所含制药学所允许使用的载体是制造制剂时通常使用的载体，包括乳糖、葡萄糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、洋槐橡胶(Acacia rubber)、磷酸钙、藻朊酸盐(Alginate)、明胶、硅酸钙、微细结晶型纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、纤维素、水、糖浆(syrup)、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxy benzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acidmagnesium)及矿物油，但不限于此。本发明的制药学合成物除了上述各成分之外，还可以包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浊剂、保存剂等。适合的制药学上允许使用的载体及制剂详见Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)。

所述制药学上的合成物以医药学上有效的量投入。本发明中医药学上有效的量是指以医学治疗或预防为目的，可适用的合理的受惠/危险比例，意味着可充分治疗或预防的量，有效用量水平可以根据疾病种类及症状程度，药物活性，患者年龄、体重健康及性别，患者对药物的过敏性、适用的特定萃取物的投入时间、投入路径及排出比例、治疗时间、与特定萃取物配合或同时使用的其他药物因素及其他医学领域公知的因素决定。通常，成年人1日摄取0.1至1000mg/kg，最好是10至100mg/kg，投入次数可以是一日一次或一日数次。

至于所述制药学合成物，可以通过具有本发明所属技术领域一般知识的人员容易实施的方法，利用制药学允许使用的载体或赋形剂，加以制剂化，可以制造成单位容量形式或装在多容量容器内的形式。这里，可以根据治疗目的，按医药学领域的常用制剂形式，进行制剂化，比如，可以制造成片剂、胶囊、散剂、颗粒、悬浊剂、乳剂、糖浆、乳状液(emulsion),硬膏、软膏、喷雾剂、油剂、凝胶、酒剂、药酊(tincture)剂、沐浴剂、擦剂(liniment)、露剂、贴剂(Patch)、垫剂(pad)、奶油剂等。另外，以直接涂抹在患部的形式，采用皮肤外敷剂形式为宜。这时，采用软膏剂、露剂、喷雾剂、明胶等形式为宜。这些皮肤外用剂可以含于可直接与治疗部位接触的支撑材料(support base)或床垫(mattress)中，支撑材料包括纱布(gauze)或绷带。

本发明的皮肤状态改善用合成物可以以功能食品合成物形式提供。

如果以功能性食品合成物形式提供本发明的合成物，则除了可以含所述皮肤状态改善用合成物之外，可以含通常在食品制造时添加的成分，比如可以包括蛋白质、碳水化物、脂肪、营养素及调味剂。比如，制造成酒精饮料(drink)时，除了含有效成分穿心莲萃取物或穿心莲内酯或其盐之外，可外加包括天然碳水化合物。比如，所述天然碳水化合物可以使用单糖(monosaccharide)(比如葡萄糖，果糖(Fructose)等)；二糖(disaccharide)(比如麦芽糖(maltose)、蔗糖等)；低聚糖(oligosaccharide)；多聚糖(polysaccharide)(比如，白糊精(dextrin)、环糊精(cyclodextrin)等)；及糖醇(sugar alcohol)(比如，木糖醇(xylitol)、山梨醇、赤藓糖醇(erythritol)等)。香味剂有天然香味剂(比如，索马甜(thaumatin)、甜叶菊(Stevia)萃取物等)及合成香味剂(比如，糖精(saccharin)，阿司帕坦(aspartame)等)。考虑到食品的易于靠近的特性，本发明的功能性食品合成物，作为皮肤状态改善用途非常有用。

本发明的最佳实施例中，所述功能食品合成物具有选自溶液、悬浊液、乳状液、膏、凝胶、奶油、粉、棒、罐、冰淇淋、油、粉末乳状液喷雾剂的制剂形式。

本发明的穿心莲萃取物、穿心莲内酯及其盐来自天然物，几乎没有毒副作用，从很久以前开始食用，而且在皮肤累积刺激试验中也得到安全性验证，即便长期使用，也能放心使用。因此所述制药学合成物、化妆材料合成物或食品合成物使用上非常安全。

本发明提供一种把选自穿心莲萃取物、穿心莲内酯及穿心莲内酯的盐的某一种以上投入到个体，提高存在于个体皮肤的干细胞或皮肤细胞中的某一种以上细胞活性的方法及其用途。

本发明提供一种把选自穿心莲萃取物、穿心莲内酯及穿心莲内酯的盐的某一种以上投入到个体，提高存在于个体皮肤的脂肪干细胞、皮肤干细胞或皮肤细胞中的某一种以上细胞活性的方法及其用途。

本发明提供一种把含选自穿心莲萃取物、穿心莲内酯及穿心莲内酯的盐的某一种以上的皮肤状态改善用合成物投入到个体，提高存在于个体皮肤的干细胞或皮肤细胞中的某一种以上细胞活性，改善或抑制个体皮肤状态的方法及其用途。

本发明提供一种把含选自穿心莲萃取物、穿心莲内酯及穿心莲内酯的盐的某一种以上的皮肤状态改善用投入到个体，提高存在于个体皮肤的脂肪干细胞、皮肤干细胞或皮肤细胞中的某一种以上细胞活性，改善或抑制个体皮肤状态的方法及其用途。

所述干细胞是指存在于皮肤的干细胞，尤其是皮肤干细胞及脂肪干细胞。

本发明中，个体是指皮肤状态不良，比如有皱纹、皮肤老化、皮肤弹力低、有伤口、伤疤等问题或想要预防这些问题的人类以及哺乳动物比如狗、猪、马、牛等。

本发明中，“投入”是指通过某种适当方法，让个体摄取一定物质，本发明的合成物投入路径可以采用任何常用路径，比如口服或非口服，只要能够让本发明合成物到达目的组织即可。本发明的合成物可以通过能让活性物质到达目标对象，比如细胞的任意装置投入。

存在皮肤皱纹、老化、皮肤弹力低、伤口、伤疤等皮肤状态或以此产生的疾病或异常状态，可以通过投入本发明的皮肤状态改善用合成物，得意改善、好转、预防或治疗。这通过上述内容以及后述实施例可以更加明确。只要是具有本行业基本知识的人员来讲，这应该非常容易理解。

发明效果

本发明的以有效成分包括穿心莲萃取物、穿心莲内酯或穿心莲内酯的盐的合成物具有干细胞和皮肤细胞的增殖促进功能及活化功能，可以改善皮肤皱纹、抑制皮肤老化、改善皮肤弹力、提高皮肤再生能力、提高治愈伤口及伤疤等，有皮肤状态改善效果。

附图说明

图1是本发明的含穿心莲萃取物或穿心莲内酯或穿心莲内酯的无血清培养基中，检测人类脂肪干细胞(ADSCs)的细胞增殖效果检测结果。这里，CM为阴性对比群，EGF(Epidermal Growth Factor)10为阳性对比群。

图2是本发明的含穿心莲萃取物或穿心莲内酯或穿心莲内酯的无血清培养基中，检测人类表皮干细胞(EpSCs)的细胞增殖效果检测结果。这里，CM为阴性对比群，EGF(Epidermal Growth Factor)10为阳性对比群。

图3为穿心莲萃取物或穿心莲内酯的3D dermal lattice(真皮晶格)的收缩促进效果示意图。这里，TGF-β(Tumor growth factor beta)为阳性对比群。

图4为由穿心莲萃取物或穿心莲内酯引发的纤维原细胞(NHF)分泌的细胞因子VEGF增加状况分析结果。这里，CM为阴性对比群，EGF(Epidermal Growth Factor)10为阳性对比群。

图5为由穿心莲萃取物或穿心莲内酯引发的角质形成细胞(HEKn)分泌的细胞因子VEGF增加状况分析结果。这里，CM为阴性对比群，EGF(Epidermal Growth Factor)10为阳性对比群。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：穿心莲萃取物及穿心莲内酯的制造

清洗干净穿心莲全草后，阴凉处晾干后磨碎。取干燥试料1kg和辅助溶剂乙醇(99.5％)500至700ml，放入超临界流体(supercritical fluid)萃取反应机(Natex,Austria)中，以温度40℃、压力10MPa、S/F比(Supercritical fluid kg/Feed kg)35的条件，使用40kg二氧化碳进行萃取。接下来，让二氧化碳、乙醇及原料混合物通过分离装置，通过变化混合物的压力和温度，从二氧化碳分离出萃取物。为了从所得到的萃取物中去除乙醇，进行减压浓缩，制造了穿心莲萃取物121.4g。

另外，为了从穿心莲分离获得穿心莲内酯，通过所述穿心莲萃取物溶剂分取，去除己烷及氯仿的分取物，从获得的分取物以丁醇进行3次分取，获得了丁醇分取物24g。之后，把所述丁醇分取物以柱层析(column chromatography)和高速液体层析(HPLC)进行精制后，利用再结晶方法，获得了穿心莲内酯280mg。对以此获得的穿心莲内酯，以通常方法——质量分析和NMR及HPLC，验证了其成分结构和含量(99.8％以上)。

实施例2：穿心莲萃取物或穿心莲内酯对干细胞的细胞增殖能力检测

2-1.细胞、培养基及培养方法

本发明的各发明人为了找出可活化皮肤干细胞的材料，在未加血清的无血清培养基中培养干细胞的同时，向培养基添加植物性物质，筛选出让干细胞良好成长的各种物质。作为干细胞使用了人类脂肪干细胞(Human adipose-derived stem cells,ADSCs)和表皮干细胞(Epidermal Stem cells,EpSCs)。

人类脂肪干细胞从英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)采购，在MesenProRS培养基上，加2％MesenPro RS Growth supplement(10ml),1％GlutaMAX(5ml)，在37℃、5％CO2条件下进行培养。从新生儿包皮(Neonatal foreskin)分离的人类表皮干细胞(Epidermal Stem cells,EpSCs)参考了Kim等人(Cell Mol Life Sci,2004,61:2774-2781)的试验方法，通过涂抹有Type4胶原纤维的培养容器，在培养初期分离了粘贴在培养容器上的细胞。所述初期粘贴的细胞是富含与干细胞性能(stemness)相关的6integrin(CD49f)和1integrin(CD29)的细胞，在EpiLife培养液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，以37℃、5％CO2条件进行培养。

对所述人类脂肪干细胞及人类表皮干细胞，以1、10、30ppm浓度分别处理试验物质，培养3日后，检测了细胞生存能力。

2-2.细胞增殖能力(cell proliferation)检测

细胞增殖能力通过MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)分析进行检测。MTT分析是含四唑环(tetrazolium ring)的基质(substrate)在线粒体(mitochondria)脱氢酶作用下，变成蓝色甲瓒(formazan)的原理进行的分析方法。通过分光学原理对蓝色甲瓒的水平进行检测后，把此作为细胞密度的间接指标应用。简单说明的话，把细胞在37℃下向MTT(1mg/ml)暴露3小时后，去除培养基，以DMSO(dimethyl sulfoxide)溶解细胞。完全溶解后，对蓝色甲瓒的检测，通过波长570nm上检测吸光度的方法，以光学原理进行。

使用MTT分析法评价了穿心莲萃取物或穿心莲内酯对干细胞增殖产生的影响。其结果，穿心莲萃取物或穿心莲内酯与浓度密切相关，提高了脂肪干细胞(ADSCs)和表皮干细胞的增殖(参考图1及图2)。

实施例3：穿心莲萃取物或穿心莲内酯对纤维原细胞的细胞增殖能力效果检验

人类纤维原细胞(normal human primary dermalfibroblast,NHF from Ajouuniversity)使用了韩国亚洲大学皮肤科培养的细胞。NHF细胞在DMEM培养基中，添加10％FBS(50ml)、1％penicillin、streptomycin(5ml)，在37℃、5％CO2条件下培养。以1、10、30ppm浓度，分别处理试验物质，培养3日后，检测了细胞增殖能力。如下表1所示，纤维原细胞的细胞增殖能力检测结果，按处理浓度，与对比群相比，纤维原细胞的细胞增殖明显增加。

【表1】

种类	细胞增殖程度(％)
		无处理群(阴性对照群)	100
穿心莲萃取物(10ppm)	115
		穿心莲萃取物(30ppm)	114
穿心莲内酯(10ppml)	117
		穿心莲内酯(30ppml)	120

实施例4：穿心莲萃取物或穿心莲内酯的3D dermal lattice收缩效果验证

在纤维原细胞中含胶原纤维、弹性纤维、玻尿酸(hyaluronate)的ECM(Extracellular matrix)生物合成促进，对于皮肤来说是防止和缓和皱纹生成的主要指标。据知，皱纹通常发生于胶原纤维和弹性纤维等真皮内结构成分的生物合成减少而引发的。从而，存在于真皮层的纤维原细胞的真皮结构成分(ECM)的合成得到促进的话不仅可以抑制皱纹，还可以改善已发生的皱纹状况。

培养纤维原细胞的3D dermal lattice是验证纤维原细胞活性和伤口治疗能力时主要使用的试验方法(Tse R,Howard J,Wu Y,Gan BS.Enhanced Dupuytren's diseasefibroblast populated collagen lattice contraction is independent ofendogenous active TGF-beta2.BMC Musculoskelet Disord.2004Nov12；5(1):41.)，胶原纤维胶质(gel)内的细胞外基质成分(ECM)增加时，胶质会发生收缩。为了制作含人类正常纤维原细胞(Human normal fibroblast)的胶原纤维胶质，混合胶原纤维溶液和4倍于所述胶原纤维溶液的DMEM培养基，10％FBS(Fetal Bovine Serum)，以及细胞悬浮液30μl后，在24-well培养皿中培养4小时，凝胶化(gelatinization)后，把穿心莲萃取物或穿心莲内酯，以1、10、30ppm的浓度喷洒在所述胶原纤维的凝胶上。之后，以6日时间，以37℃、5％CO₂条件下培养后，静置，暴露在胶原纤维的凝胶上后，对穿心莲萃取物及穿心莲内酯对含纤维原细胞的胶原纤维凝胶的收缩程度产生的影响，进行观察。其结果如图3所示。

如图3所示，穿心莲萃取物及穿心莲内酯相比于对比群，从30ppm约减小26％和10％左右，表明穿心莲萃取物及穿心莲内酯提高胶原纤维的凝胶收缩。另外，阳性对比群TGF-β1(Transforming Growth Factor beta-1)同样增加了纤维原细胞的胶原纤维凝胶的收缩。

实施例5：由穿心莲萃取物或穿心莲内酯引发的细胞因子VEGF分泌增加分析

皮肤细胞活化时，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对皮肤细胞的增殖、生长、分划产生多种影响，让老化细胞转变成新细胞，维持皮肤的年轻状态。因此，对穿心莲萃取物及穿心莲内酯对皮肤内皮生长因子分泌程度的影响做了调查。

具体地，在DMEM培养基上，把培养于含10％FBS、1％青霉素(penicillin)、及链霉素(streptomycin)的纤维原细胞培养液和从添加有Growth supplement的Epilife培养基培养的表皮干细胞培养液，分别向下方垫有膜过滤器(membrane filter)的96well板分株后，向各分株的培养基上分株珠子(bead)混合物25μl和结合有生物素(biotin)的混合物(Biotin-Conjugate Mixture,eBioscience)50μl。之后，在上方粘贴胶带后，盖上银箔，遮光后，在常温(18-25℃)下，放在振动器(shaker)上，以500rpm反应2个小时。之后，放入分析缓冲液(1X)100后，进行真空洗涤，再反复一次后，用手纸擦拭底面，去除剩余的水分。之后，分别分株分析缓冲液(1X)各100μl后，把事先制造的链霉亲和素(streptavidin)-PE溶液，分株各50μl，进行混合后，上方粘贴胶带后，在上方粘贴胶带后，盖上银箔，放在振动器(shaker)上，以500rpm反应1个小时。去除胶带后，把分析缓冲液(1X)各分株200μl后，通过移液管(tube)混合，各200μl，移到1.5ml管，进行稀释后，向管(tube)加入分析缓冲液各100μl后，用手指轻拍，混合后，进行了FACS分析。结果如图4及5所示。如图4及5所示，与皮肤细胞活性剂增殖相关的VEGF，按穿心莲萃取物及穿心莲内酯的处理浓度，相伴升高。

实施例6：穿心莲萃取物及穿心莲内酯对人体皮肤的安全性检验试验

6-1.含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的皮肤外用剂的制造

为了确认穿心莲萃取物或穿心莲内酯对人体皮肤是否安全，以如下表2的成分及含量制造含有穿心莲萃取物或穿心莲内酯0.1重量％的皮肤外用剂后，进行如下皮肤安全性验证试验。首先，向鲨烯(squalene)混合纯净水、甘醇、丁二醇，在70℃温度下溶解后(水状组)，把所述三种成分和除去三羟乙基胺(triethanolamine)的其他成分，在约70温度下溶解(油状组)。之后，把油状组添加到水状组中，通过高速搅拌机(homomixer)(TokushuKika公司，日本)进行搅拌，进行1次油化后，最终添加三羟乙基胺。

【表2】

6-2皮肤累积刺激试验

通过以所述6-1方法制造的皮肤外用剂，以健康成年人30人为对象，在左上臂部位，隔日总共涂抹9次，累积24小时，检测了穿心莲萃取物或穿心莲内酯是否对皮肤产生刺激。作为对比群使用了角鲨烷加穿心莲萃取物及不含穿心莲内酯的皮肤外用剂。

皮肤过敏试验(patch test)利用了芬恩室(Finn chamber,Epitest Ltd,芬兰)，在各室使用所述各皮肤外用剂15后，进行试验。对每次产生的反应程度，利用如下试验式1加以分数化，结果如下表3所示。

【试验式1】

平均反应度＝

[[反应指数×反应度/总受检人数×最高分数(4分)]×100]/检查次数

这里，反应度中±为1分，+为2分+++为4分，平均反应度不到3时判定为安全合成物。

【表3】

如上表3所示，对比群、试验群1及2的对应于±、+及++的人数分别为0人、0人、0人，都未出现皮肤反应。根据所述试验式1计算的结果，反应度分别为0.00、0.00、0.00，都是3以下的反应度，被判定为安全合成物。

下面，对本发明合成物的制剂例进行说明。

制造例1：化妆材料的制造

1-1.柔软化妆水的制造

如下表4，把作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的柔软化妆水，以通常方法制造。

【表4】

成分	含量(重量％)
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	0.01
甘油	3.0
		丁二醇	2.0
丙二醇	2.0
		羧基乙烯聚合物	0.1
乙醇	10.0
		三乙醇胺	0.1
防腐剂、微量色素、微量香料、微量纯净水	余量
		总计	100.0

1-2营养化妆水的制造

以下表5所示的配比，通过常用方法，制造了作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的营养化妆水。

【表5】

成分	含量(重量％)
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	0.01
蜂蜡	4.0
		聚山梨醇酯60	1.5
倍半油酸山梨坦(Sorbitan Sesquioleate)	0.5
		液状石蜡(liquid paraffin)	5.0
角鲨烷(Squalane)	5.0
		羊脂酸/羊脂酸三酸甘油酯	5.0
甘油	3.0
		丁二醇	3.0
丙二醇	3.0
		羧基乙烯聚合物	0.1
三乙醇胺	0.2
		防腐剂、微量色素、微量香料、微量纯净水	余量
总计	100.0

1-3营养奶液的制造

以下表6所示的配比，通过常用方法，制造了作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的营养奶液。

【表6】

成分	含量(重量％)
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	0.01
蜂蜡	10.0
		聚山梨醇酯60	1.5
倍半油酸山梨坦	0.5
		液状石蜡(liquid paraffin)	10.0
角鲨烷(Squalane)	5.0
		羊脂酸/羊脂酸三酸甘油酯	5.0
甘油	5.0
		丁二醇	3.0
丙二醇	3.0
		三乙醇胺	0.2
防腐剂、微量色素、微量香料、微量纯净水	余量
		总计	100.0

1-4按摩奶液的制造

以下表7所示的配比，通过常用方法，制造了作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的按摩奶液。

【表7】

成分	含量(重量％)
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	0.01
蜂蜡	10.0
		聚山梨醇酯60	1.5
倍半油酸山梨坦	0.8
		液状石蜡(liquid paraffin)	40.0
角鲨烷(Squalane)	5.0
		羊脂酸/羊脂酸三酸甘油酯	4.0
甘油	5.0
		丁二醇	3.0
丙二醇	3.0
		三乙醇胺	0.2
防腐剂、微量色素、微量香料、微量纯净水	余量
		总计	100.0

1-5面膜的制造

以下表8所示的配比，通过常用方法，制造了作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的面膜。

【表8】

成分	含量(重量％)
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	0.01
聚乙烯醇	13.0
		羧甲基纤维素钠	0.2
尿囊素	0.1
		乙醇	5.0
壬基酚聚氧乙烯醚	0.3
		防腐剂、微量色素、微量香料、微量纯净水	余量
总计	100.0

制造例2：医药学制剂的制造

2-1散剂的制造

为了制造作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的散剂，混合如下表9的成分后，填充到如下气密袋内，制造了散剂。

【表9】

成分	含量(g)
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	2
乳糖	1

2-2片剂的制造

为了制造作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的片剂，混合如下表10的成分后，以一般的片剂制造方法，通过打片制造了片剂。

【表10】

成分	含量(mg)
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	100
玉米淀粉	100
		乳糖	100
硬脂酸镁	2

2-3胶囊剂的制造

为了制造作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的胶囊剂，混合如下表11的成分后，以通常的胶囊剂制造方法，向凝胶胶囊填充，制造了胶囊剂。

【表11】

制造例3：功能食品的制造

3-1健康饮料的制造

为了制造作为有效成分含穿心莲萃取物或穿心莲内酯的健康饮料，混合如下表12的成分后，通过通常的健康饮料制造方法，在85条件下搅拌加热约1小时后，过滤所制作的溶液，用灭菌容器收取，密封杀菌后，冷藏保管，制造了如下健康饮料。

【表12】

成分	含量
		穿心莲萃取物或穿心莲内酯	4g
柠檬酸	1000mg
		低聚糖	100g
梅子浓缩液	2g
		牛磺酸	1g
加纯净水全部	900

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.浓度为10-100ppm的穿心莲萃取物、穿心莲内酯及穿心莲内酯的盐在制备脂肪干细胞形成增进药物中的用途。