CN105330728A - 一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白及其制备方法和用途，属于生物医药领域。一种DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：a)DHAV-MAg的DNA片段克隆及表达载体的构建；b)DHAV-MAg基因重组蛋白的表达；c)DHAV-MAg基因重组蛋白的纯化；本发明还以DHAV-MAg基因重组蛋白为抗原免疫动物成功获得了多克隆抗体。对DHAV-MAg基因重组蛋白及多克隆抗体在检测及免疫保护中的作用进行初步研究，为鸭病毒性肝炎的检测和防治提供一种新的途径。

Description

一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和用途。
背景技术
由鸭肝炎病毒(DHV)引起的鸭病毒性肝炎(DVH)是危害养鸭业最严重的传染病之一，该病的发病群体主要是4周龄以内的雏鸭。临床症状主要表现为抽搐、角弓反张及其他神经症状，俗称“背脖病”，剖检可见肝脏肿大，表面出血点大小不等。该病一旦爆发，死亡率极高，给全球的养鸭业带来严重的经济损失。引起DVH的病毒至少有3种，但目前爆发流行的是1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)，对应以往的血清I型鸭肝炎病毒(DHV-1)。
DHAV属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，直径20～40nm。该类病毒衣壳呈二十面体对称，包含32个壳粒，没有囊膜和突起，增殖速度快，繁殖能力强，复制一代约2h。DHAV-1是单链RNA病毒，基因组RNA长度7kb～8kb，分子量为8.6×106Da，其具有较强的感染性。DHAV-1生存能力极强，它能够抵御外界环境的影响。在不同的条件下，该病毒的生存能力不同。如自然环境下，DHAV-1能够长时间的存活并且繁殖，阴凉环境如湿粪中可以生存37d以上，0～4℃下可存活2年以上，而-20℃下可存活长达9年。DHAV-1能够耐受强酸，对氯仿、甲醇、乙醚等有机溶剂均不敏感，并且对常见的消毒剂如甲醛、福尔马林等也有明显的抵抗力，对热也有一定的耐受作用。DHAV-1不凝集任何动物的红细胞，也不吸附任何红细胞。由于DHAV-1的研究开始较晚，而小RNA病毒科的病毒成员具有相似的基因复制、功能机制，所以，了解其他小RNA病毒的结构、基因功能等分子生物学特性，可为DHAV-1分子结构和生物学方面的研究提供更好的思路和创新。
小RNA病毒是RNA病毒中最小的一类，分布极为广泛，可归为肠道病毒属(enterovirus)、口疮病毒属(Aphthovirus)、心病毒属(Cardiovirus)、嗜肝病毒属(Hepatovirus)、副肠孤病毒属(Parechovirus)、马鼻病毒属(Erbovirus)、嵴病毒属(Kobuvirus)、捷申病毒属(Teschovirus)、禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)等。小RNA病毒呈圆形，病毒粒子直径为20～40nm，无囊膜，为单股正链RNA病毒,基因组长度在7000～8500nt左右,不同属成员的基因组结构不尽相同。一般在基因组的5′非翻译区(5′UntranslationRegion,UTR)末端共价结合一短肽VPg,而3′非翻译区端含有polyA尾结构,病毒唯一的开放阅读款(OpenReadFrame,ORF)被镶嵌在这两个非翻译区之间。小RNA病毒的5′非翻译区较长(600～1200nt),其中含有丰富的复制和翻译控制元件,包括病毒的内部核糖体进入位点(IRES)可直接指导病毒蛋白的翻译过程和5′端与复制相关的的三叶草结构。当病毒ORF在宿主细胞中表达出单一的多聚蛋白后,随后被病毒自身编码的蛋白酶切割成为成熟的蛋白。在多聚蛋白N段1/3处都是编码病毒的结构蛋白(P1),组装成病毒的衣壳,剩下的2/3部分则是编码病毒的非结构蛋白(P2,P3)。P1片段大小约为90KD,翻译之后被病毒自身蛋白酶所切割为成熟的结构蛋白(VP1～VP4),进而组装成为病毒衣壳。衣壳蛋白的功能主要表现在：1、构成病毒形态的结构基础,保护病毒的核酸；2、其表面的茎环结构构成病毒的中和表位,与抗体相互作用；3、病毒粒子表面的凹槽形成的特定构象与细胞表面的受体相互作用,诱导病毒吸附细胞膜上,与病毒的感染范围相关。P2/P3主要参与对病毒复制所需的相关蛋白、宿主防御系统、宿主核糖体复合体等结构和功能进行调节,使病毒核酸和蛋白在宿主细胞内得到完满的复制和翻译。
虽然目前鸭肝炎病毒的全基因序列已经公布,生物信息学分析推测其基因组的结构和功能与其他小RNA病毒可能相似，但其衣壳蛋白是否完全裂解、是否有L蛋白、2A的数量等方面尚不能确认；虽然已有对部分蛋白进行表达的报道，但各基因和蛋白的信息是基于生物信息学分析推测而非实验证实，因此，如何有针对性地获得准确的靶基因和蛋白成为鸭肝炎病毒的研究中亟待解决的问题；而针对有良好免疫原性的基因进行体外表达，并对体外表达的蛋白在检测及免疫保护中的作用进行研究，成为本领域技术人员研究的热点。现有技术中存在针对DHAV-1的基因和蛋白进行体外表达并得到表达蛋白的技术，但由于各基因和蛋白的信息是基于生物信息学分析推测，因此表达蛋白可能存在检测鸭病毒性肝炎抗体精度不高，检测效率低等缺点，由此可见，确认具有良好免疫原性的基因区域并将其原核表达方法做进一步改进，使得到的重组蛋白具有在检测鸭病毒性肝炎抗体中精度高的优点，找到鸭病毒性肝炎的检测和防治的有效途径，成为本领域人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一是克服现有技术中的问题，提供一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白及其制备方法和用途。
为解决上述技术问题，采用的技术方案包括：
一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其DNA序列如SEQIDNO:2所示。
一种权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段克隆：分析确定鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因及酶切位点，根据Genbank登录号为JQ316452.1的DHAV-1X株全基因序列，设计扩增鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段的特异性引物，同时在上下游引物的5’端分别添加上BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，提取鸭肝炎病毒RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段；
步骤二：构建重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg：将鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆得到pMD18-T/DHAV-MAg，分别培养含重组质粒pMD18-T/DHAV-MAg和表达质粒pGEX-4T-1的菌株，提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切，分析、回收、纯化后，将得到带有粘性末端的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段与双酶切处理过表达载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物进行转化和鉴定；
步骤三：制备鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选，将筛选后的含重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg的菌株经培养诱导表达得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白粗品；将重组蛋白粗品鉴定、纯化后，得到纯化的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白。
进一步的，所述特异性引物为：
上游引物P1：5’GGATCCACAACTACACAGACAATACT3’，
下游引物P2：5’CTCGAGGCCTAACACAATGACACAGAT3’。
进一步的，所述步骤一中分析确定的方法为：对鸭肝炎病毒多聚蛋白进行生物信息学分析，选择抗原区域密集的多聚蛋白区域为DHAV-MAg基因。
进一步的，所述步骤二中鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆的方法为：将所述步骤一获得的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行纯化回收，纯化产物末端加A，与pMD18-T载体连接得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，将得到的pMD18-T/DHAV-MAg进行酶切鉴定。
进一步的，所述步骤二中的连接反应体系为，带有粘性末端的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段5.5μl，表达载体pGEX-4T-12μl，2×T4DNALigaseMix7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。
进一步的，所述鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的诱导表达条件为：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到宿主菌BL21中，0.4mmol/LIPTG、37℃诱导12h；所述步骤三中纯化方法为切胶纯化。
鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白应用于作为检测鸭病毒性肝炎抗体的检测试剂。
一种用于检测鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白，鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白作为抗原的包被浓度为1.67μg/ml，最佳包被条件为37℃2h，血清稀释度为1：80，HRP标记的羊抗鸭IgG的稀释度为1：400，封闭液为5％的明胶，封闭时间为2h，显色时间为5min。
鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白应用于作为鸭病毒性肝炎的基因工程亚单位疫苗。
本发明的有益效果为：
1.成功构建了重组质粒pGEX-4T-1/DHAV-MAg并能在大肠杆菌中表达DHAV-MAg基因重组蛋白；重组蛋白能与兔抗DHAV-1血清反应，具有良好的反应原性，可用于鸭肝炎病毒抗体的检测；重组蛋白可用切胶的方法获得纯度较高的重组蛋白，重组蛋白制备成本低；
2.成功制备了兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白高免血清，间接免疫荧光表明兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白高免血清能够识别DHAV-1，证明了兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白高免血清具有一定的中和活性，可用于鸭病毒性肝炎的防治和检测；
3.成功建立了基于DHAV-MAg基因重组蛋白的间接ELISA方法，该方法具有重复性好和特异性强的特点，对鸭病毒性肝炎抗体检测灵敏度高；
4.对DHAV-MAg基因重组蛋白进行免疫原性分析，结果表明，重组蛋白能够刺激机体产生抗体并引起细胞因子含量的变化，可用于鸭病毒性肝炎的防治。
附图说明
图1所示为本分发明DHAV-MAg基因的RT-PCR产物鉴定图。
图2所示为本发明pMD18-T/DHAV-MAg质粒的PCR鉴定图。
图3所示为本发明pMD18-T/DHAV-MAg质粒的酶切鉴定图。
图4所示为本发明pGEX-4T-1/DHAV-MAg质粒的PCR鉴定图。
图5所示为本发明pGEX-4T-1/DHAV-MAg质粒的酶切鉴定图。
图6所示为本发明鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白免疫印迹图。
图7所示为本发明鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白纯化前后的电泳图。
图8所示为本发明IPTG浓度的优化图。
图9所示为本发明诱导表达温度的优化图。
图10所示为本发明诱导表达时间的优化图。
图11所示为本发明DHAV-MAg基因重组蛋白可溶性分析图。
图12所示为本发明兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白血清的琼扩效价图。
图13所示为本发明兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白血清的纯化图
图14为本发明兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白血清的间接免疫荧光检测(100×)，图14A感染DHAV-1的DEF细胞荧光检测(100×)图，图14B正常的DEF细胞荧光检测(100×)图。
图15所示为本发明DHAV-MAg基因重组蛋白ELISA检测免疫雏鸭的抗体水平图。
图16所示为本发明DHAV-MAg基因重组蛋白免疫雏鸭细胞因子的ELISA检测结果：图16A：DHAV-MAg基因重组蛋白免疫雏鸭CD4T淋巴细胞亚群的含量ELISA检测结果图；图16B：DHAV-MAg基因重组蛋白免疫雏鸭CD8T淋巴细胞亚群的含量ELISA检测结果图；图16C：DHAV-MAg基因重组蛋白免疫雏鸭IL-4的含量ELISA检测结果图；图16D：DHAV-MAg基因重组蛋白免疫雏鸭INF-γ的含量ELISA检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
Trizolplus，PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒，PrimeSTARPCRMix，DL2000Marker、DL15000Marker，ligationmix连接试剂盒，BamHI、XhoI限制性内切酶，IPTG等试剂购于宝生物工程(大连)有限公司；
TMB显色液、DAB显色试剂盒等购于天根生化科技(北京)有限公司；
质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等购自OMEGA；
Tris碱、甘氨酸、丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、R250、BSA、咪唑等购于上海生工生物工程技术有限公司；
低分子量蛋白质Marker、预染蛋白Marker、Agarose(琼脂糖)、PVDF膜、Ni2+-NTA琼脂糖凝胶、等购于Bio-rad；
HRP标记的羊抗鸭IgG购于KPL公司；
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购于Sigma；
IL-4、CD4+、CD8+、IFN-γ鸭血清检测试剂盒购于R&D公司。
实施例1：
一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其DNA序列如SEQIDNO:2所示。
一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段克隆：分析确定鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因及酶切位点，根据Genbank登录号为JQ316452.1的DHAV-1X株全基因序列，设计扩增鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段的特异性引物，同时在上下游引物的5’端分别添加上BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，提取鸭肝炎病毒RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段。
其中特异性引物为：
上游引物P1：5’GGATCCACAACTACACAGACAATACT3’(SEQIDNO:3)，
下游引物P2：5’CTCGAGGCCTAACACAATGACACAGAT3’(SEQIDNO:4)。
其中分析确定的方法为：对鸭肝炎病毒多聚蛋白进行生物信息学分析，选择抗原区域密集的多聚蛋白区域为DHAV-MAg基因。
其中所述RT-PCR扩增采用两步法，首先合成cDNA，然后进行PCR扩增：
1、反转录：
根据TaKaRa说明书进行模板、引物的处理，然后配制下列反应液：模板2μl，随机引物3μl，dNTPmix(2.5mM)4μl，加ddH2O至10μl。65℃5min，迅速在冰上急冷2min以上；瞬离使模板RNA/引物的变性溶液聚集于管底，在上述模板RNA/引物变性溶液中加入：5×PrimeScriptBuffer4μl，RNaseInhibitor0.5μl，PrimeScriptRTase1μl，加ddH2O至20μl。反应条件：30℃10min，42℃30min，95℃5min；70℃保温15min后，冰上冷却，-20℃保存。
2、PCR扩增：
按试剂说明书加入试剂进行PCR扩增，扩增体系：cDNA1μL，2×PCRmix10μL，引物(10pm)各1μl，加ddH2O至20μl。PCR扩增程序为：95℃5min，(94℃40s，55℃40s，72℃1min)×35cycles，72℃10min，16℃2h。结束后4℃保存。
3、RT-PCR产物的检测：
取10μLPCR产物与1μL上样缓冲液混合后，1％琼脂糖凝胶电泳30min，于紫外灯下观察所扩增片段。
检测结果：以提取的病毒基因组RNA为模板，RT-PCR得到符合预期片段大小的基因片段，鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因的长度为534bp，结果如图1所示，图1中M：DL2000Marker，1：DHAV-MAg基因的RT-PCR产物。
步骤二：构建重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg：将鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆得到pMD18-T/DHAV-MAg，分别培养含重组质粒pMD18-T/DHAV-MAg和表达质粒pGEX-4T-1的菌株，提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切，分析、回收、纯化后，将得到带有粘性末端的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段与双酶切处理过表达载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物进行转化和鉴定。
其中将鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆得到pMD18-T/DHAV-MAg的方法为：
1、RT-PCR产物即得到的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段与pMD18-T载体的连接：
鉴定正确的目的片段按DNA胶回收试剂盒说明书纯化回收，纯化产物末端加A：普通2×Taq酶Mix2.5μL，胶回收产物7.5μL，混匀，72℃延伸30min即可；按顺序依次加入下列试剂建立10μL的连接体系：2×T4DNAligaseMix5μL，pMD18-T载体1μL，加A后的目的片段4μL。混匀后，轻微离心于管底。16℃水浴反应2～4h或者过夜。
2、重组DNA分子的转化：
(1)感受态细胞的制备：
无菌条件下，划线接种本实验室制备并保存于-70℃的大肠杆菌DH5a，37℃倒置培养过夜；次日挑菌，接种LB液体培养基中恒温振摇过夜；按照1:100扩大培养至OD600nm为0.4～0.5，冰浴1h；无菌条件下，菌液4℃、4000r/min离心10min，弃尽上清液；10mL预冷的0.1mol/L无菌CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴30min，4℃4000r/min离心10min，弃尽上清液；冰预冷0.1mol/L含15％甘油的无菌CaCl2溶液1mL重悬，混合后，以50μL/管分装，-70℃保存备用。
(2)连接产物的转化：
在DH5a感受态细胞中加入连接产物5μL，缓慢吹打混匀(一定要轻柔)，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min，加入445μLLB液体培养基，37℃200～250r/min振荡培养1h，4000r/min离心2min，混匀；将菌液均匀地涂布于含有抗生素的LB琼脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒温箱过夜培养到单个菌落出现；挑菌，37℃300r/min振荡培养过夜。
(3)菌液PCR筛选阳性克隆：
以变浑浊的菌液为模板，PCR扩增DHAV-MAg基因。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。
(4)重组质粒的酶切鉴定：
按照质粒抽提试剂盒(OMEGA)操作步骤进行质粒抽提，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切体系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重组质粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切产物用1％琼脂糖电泳鉴定。
鉴定结果：
DHAV-MAg基因连接至T-VectorpMD18-T后，经PCR及酶切鉴定后得到预期的条带，DHAV-MAg基因长度为534bp，如图2和图3所示。图2中M：DL2000Marker，1：pMD18-T/DHAV-MAg的PCR产物；图3中M：DL2000Marker，1：pMD18-T/DHAV-MAg的BamHⅠ/XhoⅠ酶切产物。
其中重组质粒pMD18-T/DHAV-MAg和表达质粒pGEX-4T-1的提取和双酶切的方法为：分别培养含重组质粒pMD18-T/DHAV-MAg和表达质粒pGEX-4T-1的菌株，提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切，方法同上，用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳分析酶切结果，切胶回收并纯化目的基因和线性化的质粒载体。
其中鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段与表达载体pGEX-4T-1的连接方法为：将获得的带有粘性末端的目的基因与双酶切处理过的表达载体进行连接，连接反应体系：目的基因片段5.5μl，表达载体2μl，2×T4DNALigaseMix7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。
所述该处连接产物的转化和鉴定方法与T克隆步骤中的转化和鉴定的方法相同，最后测序确认。
鉴定结果：将DHAV-MAg基因克隆至pGEX-4T-1载体，经PCR及酶切鉴定后均得到预期的条带，重组质粒pGEX-4T-1/DHAV-MAg中DHAV-MAg的长度为534bp，如图4和图5所示，图4中M：DL2000Marker，1：pGEX-4T-1/DHAV-MAg的PCR产物；图5中M1：DL15000Marker，M2：DL2000Marker，1和2：pGEX-4T-1/DHAV-MAg的BamHⅠ/XhoⅠ酶切产物。pGEX-4T-1/DHAV-MAg测序结果通过NCBI上Blastn同源性比对分析表明，载体中插入的基因片段大小为534bp，与预期一致，表明重组表达载体构建成功。
步骤三：制备鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选，将筛选后的含重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg的菌株经培养诱导表达得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白粗品；将重组蛋白粗品鉴定、纯化后，得到纯化的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白。
其中目的蛋白表达菌的筛选方法为：将表达质粒pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，转化菌经37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养约2.5h，菌液OD600nm达0.6时加入IPTG至浓度为0.4mmol/L37℃诱导4h，将表达菌分别以12000r/min离心10min，沉淀用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)按1:10菌液悬浮，冰浴超声破碎后12000r/min离心10min，上清取80ul加入20ul5×SDSloadingbuffer，沉淀用1ml8M尿素溶解，8000r/min离心10min，取80ul此溶解液同样加入20ul5×SDSloadingbuffer。样品煮沸10min，10000r/min离心10min，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况。
对目的蛋白的表达条件优化，具体优化步骤见实施例2，其中鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的最佳诱导表达条件为：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到宿主菌BL21中，0.4mmol/LIPTG、37℃诱导12h。重组蛋白的大小约45KD。可溶性分析表明DHAV-MAg基因重组蛋白是以包涵体的形式存在。
其中所述鉴定方法为Western-blot鉴定法：按照Bio-rad公司的蛋白免疫印迹手册进行检测：SDS-PAGE电泳；按照从正极→负极的顺序安装电转三明治：海绵、3张滤纸、PVDF膜、PAGE胶、3张滤纸、海绵，放入盛有转膜缓冲液的电泳槽中，将电泳槽放入冰水中；60～80V转膜1～2h，取出PVDF膜，PBST漂洗3次，5min/次；用封闭液稀释的兔抗DHAV-1血清孵育PVDF膜，室温下作用1h，用PBST洗膜3次，每次10min～15min；用封闭液1:1000稀释HRP标记的羊抗兔IgG孵育1h；PBST液再洗涤3次，每次10min～15min；加入DAB底物显色液，轻摇显色15min，待目的条带清晰可见，超纯水终止显色，吸水纸吸干水分，避光保存。
鉴定结果：蛋白的免疫印迹结果显示如图6所示，图6中M：预染蛋白Marker，1：DHAV-MAg基因重组蛋白。表达的重组蛋白能与DHAV-1抗体特异性结合，表明表达的重组蛋白可被DHAV-1血清识别，具有良好的反应原性。
其中重组蛋白的纯化方法包括：
1、目的蛋白的大量表达
在最适IPTG浓度、最适温度和最佳诱导时间条件下，将表达宿主菌培养于LB/Amp液体培养基中，样品处理，溶解的包涵体-20℃保存备用。
2、目的蛋白的亲和层析纯化
将大量表达的产物按照镍柱亲和层析说明书纯化方法纯化重组蛋白，将纯化的蛋白进行透析浓缩后，取适量检测纯化蛋白的浓度并SDS-PAGE电泳检测纯化的效果，剩余置于-20℃保存备用。
3、目的蛋白洗涤包涵体纯化
将大量表达菌按照制样的方法处理后，收集的包涵体用不同浓度的尿素洗涤，洗涤后离心取上清制样，SDS-PAGE电泳检测纯化的效果。
4、表达蛋白切胶纯化
将大量表达菌按照制样方法制样后，采用Bio-rad公司购买的电泳槽进行切胶回收，浓缩后制样，SDS-PAGE电泳检测纯化的效果。
经过三种纯化方法的尝试，发现切胶回收的效果最佳。经过切胶回收，得到了纯度、浓度均较高的蛋白，如图7所示，图7中M：蛋白Marker，1：鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白纯化前包涵体样品，2：鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白纯化后。
实施例2DHAV-MAg基因重组蛋白的表达条件优化
实验方法：
1、IPTG浓度的优化
将表达菌按照1：100接种4支LB/Amp培养基试管中，37℃培养至OD600nm到0.6时，分别加入IPTG至终浓度为：0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L和1.2mmol/L诱导培养4h左右，样品处理，SDS-PAGE电泳。
2、诱导时间的优化
将表达菌按照1：100接种6支LB/Amp培养基试管中，待培养至OD600nm达到0.6后，加入最佳IPTG浓度，分别诱导4h、6h、8h、10h、12h和不诱导，处理同上。
3、诱导温度的优化
将表达菌按照1：100接种3支LB/Amp培养基试管中，待培养至OD600nm达到0.6后，加入最佳IPTG浓度，分别在20℃、30℃和37℃条件下诱导培养4h左右，处理同上。
实验结果：
重组质粒pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到宿主菌BL21中，优化其最佳表达条件为0.4mmol/LIPTG、37℃诱导过夜，如图8～10所示，重组蛋白的大小约45KD，表达的DHAV-MAg基因重组蛋白以包涵体形式存在，其中图8中，M：蛋白Marker，1～4分别为：0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L和1.2mmol/L的IPTG浓度的表达产物；图9中，M：蛋白Marker，1～3分别为：30℃、37℃和20℃的表达产物；图10中，M：蛋白Marker，1～5分别为：4h、6h、8h、10h和12h的表达产物，未标注的为未诱导；图11中，M：蛋白Marker，1：上清表达产物，2：包涵体表达产物。
实施例3DHAV-MAg基因重组蛋白活性分析及其高免血清的制备、特性及应用
实验方法：
1、兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白高免血清的制备
免疫原制备：原核表达DHAV-MAg基因重组蛋白并采用切胶纯化获得纯度较高的DHAV-MAg基因重组蛋白，-20℃保存备用。
动物免疫方案：
选取体重合适的青年健康家兔，按表1进行免疫。
表1兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白高免血清制备的免疫程序
收集血清和兔抗血清效价的测定：末次免疫7天后，收集血液，37℃2h，凝固后4℃冰箱过夜。收集血清，琼脂扩散试验检测抗体效价，-20℃保存。
粗提纯兔抗血清：将上述获得的血清按照常规的饱和硫酸铵法粗提IgG，SDS-PAGE检测。
2、重组蛋白抗血清中和效价的检测
病毒鸡胚半数致死量的测定(ELD50)：
(1)购买40只9日龄鸡胚，随机分为8个组，每组5只，其中一组作为对照组；
(2)将DHAV-1鸡胚适应株病毒液按10-1-10-7做倍比稀释；
(3)一组一个稀释度，鸡胚尿囊腔接种，0.2ml/只，对照组注射等量的生理盐水；
(4)逐日观察鸡胚死亡情况，并作记录；
(5)按Reed和Muench氏法计算ELD50。
固定病毒稀释血清法检测重组蛋白抗血清中和活性：
(1)计算ELD50，用灭菌生理盐水将病毒稀释成每0.1ml含有100个ELD50；
(2)一定条件下灭活待检血清，按照1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128和1：256的2倍倍比稀释，稀释后与稀释的病毒液等体积混合，37℃作用1h；
(3)鸡胚随机分组，每组5只；
(4)一组一个稀释度，鸡胚尿囊腔接种，0.2ml/每只，同时设置病毒对照组(100个ELD50)；
(5)逐日观察每组鸡胚的死亡数，并作记录；
(6)按Reed和Muench氏法计算中和指数。
3、重组蛋白高免血清的应用
采用间接免疫荧光技术，检测重组蛋白抗血清是否可用于鉴定、识别DHAV-1。
按常规方法制备DEF飞片，37℃培养。长成单层细胞后接种DHAV-1X株病毒液，接毒后2d收获细胞飞片。用灭菌的预冷PBS洗涤3次，4％多聚甲醛室温固定30min，洗涤；用0.2％TritonX-100室温透化30min，洗涤同上；用5％BSA37℃湿盒封闭1h，吸干液体，用1％BSA按1:100稀释兔抗重组蛋白血清37℃湿盒孵育1h，PBS洗涤同上；适当稀释(1:100)的FITC-羊抗兔IgG37℃湿盒孵育1h，PBS洗涤同上；DAPI染色液复染细胞核(1:1000)室温避光感作5～10min，PBS洗涤同上；飞片放滤纸上风干，将1滴甘油加于载玻片上，倒扣盖玻片，荧光显微镜下观察并保存照片。
实验结果：
1、兔抗DHAV-MAg基因重组蛋血清的效价的检测及抗体纯化
琼脂扩散试验检测血清的效价结果见图12，血清的效价达到1:16，1:32也有微弱的条带；饱和硫酸铵纯化兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白高免血清结果见图13，粗提后的抗体可见IgG的重链和轻链。图13中，M:蛋白Marker，1：:纯化抗体。
2、鸡胚中和试验检测血清中和活性：
DHAV-1鸡胚适应株病毒ELD50的测定：
ELD50测定结果见表2，按Reed和Muench氏法计算ELD50为10-4.5/0.2ml。
表2DHAV-1鸡胚适应株病毒鸡胚半数致死量的测定
中和效价的测定：
血清中和试验结果见表3，按Reed和Muench氏法计算该血清的中和效价为1:146。
表明重组蛋白抗血清可以中和DHAV-1，可以作为鸭病毒性肝炎被动免疫的制剂用于鸭病毒性肝炎的防治。
表3兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白血清的中和效价
3、间接免疫荧光技术检测DHAV-MAg基因重组蛋白抗血清是否识别DHAV-1
用兔抗DHAV-MAg基因重组蛋白抗血清进行间接免疫荧光检测的结果见图14，DHAV-MAg基因重组蛋白的兔抗血清能够识别DHAV-1，表明其具有良好的反应原性，可以作为检测鸭肝炎病毒或抗原的检测试剂。
实施例4基于重组蛋白的ELISA方法的建立
试验方法：
1、基于重组蛋白的ELISA方法反应条件的优化
对ELISA反应条件按照常规方法进行操作，ELISA方法反应条件的优化具体如下：
(1)抗原包被浓度：DHAV-MAg基因重组蛋白(2mg/ml)做1:100、1:200、1:300、1:400、1:600、1:800、1:1200、1:1600和1:2400九个稀释度；
(2)血清的最佳稀释度：DHAV-1阳性/阴性血清分别做1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640七个稀释度；
(3)酶标抗体的最佳稀释度：设置1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200五个稀释度；
(4)蛋白的包被条件：37℃1h转4℃过夜、37℃4h转4℃过夜、直接4℃过夜和37℃2h四个条件；
(5)封闭液的选择：设置1％BSA、5％BSA、1％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、1％明胶和5％明胶六种封闭液；
(6)封闭时间：设置0.5h、1h、1.5h和2h四个梯度；
(7)显色时间：设置5min、10min、15min、20min、25min和30min六个梯度。
2、阳性阈值的确定：
以ELISA方法优化的最佳条件检测56份阴性血清OD450nm/OD630nm值，计算cut-off值＝均值+3×标准差(Vcut-off＝X+3×SD)。
3、ELISA方法的特异性检测
(1)特异性交叉实验
用建立的ELISA方法检测鸭沙门氏菌、鸭大肠杆菌、鸭肿头败血症病毒、禽流感病毒(H5)、鸭瘟病毒和鸭里默氏杆菌的阳性血清，设置DHAV-1阳性血清、阴性血清对照。
(2)特异性阻断实验
用体积比为抗原10:1阳性血清，于37℃中和1h后稀释至最佳血清稀释度，用建立的ELISA方法检测，计算阻断率。
4、变异系数
取同一批纯化的重组蛋白抗原包被的酶标板(条)，按照建立的ELISA方法的最佳条件操作检测6份已知阳性血清，每份血清设置6个重复，计算批内变异系数；取不同批次纯化的重组蛋白抗原包被的酶标板(条)，检测6份相同的阳性血清，每份血清设置6个重复，计算批间变异系数，变异系数CV＝标准差/平均值(SD/M×100％)。
5、基于重组蛋白的ELISA方法的应用及与DHAV-1包被的ELISA方法符合率的比较
随机选取60份鸭血清，采用基于重组蛋白的ELISA方法和DHAV-1包被的ELISA方法同时检测，比较基于重组蛋白的ELISA方法与DHAV-1-ELISA方法的符合率。
试验结果：
1、基于重组蛋白的ELISA方法反应条件的优化：
(1)抗原的最佳包被浓度和血清的最佳稀释度
每个抗原稀释度设置2个重复，取平均值，选择P/N值最大者为最佳条件。由表4可知，DHAV-MAg基因重组蛋白抗原的最佳包被浓度为1.67μg/ml，血清稀释度为1：80。
(2)酶标抗体的最佳稀释度
由表5可知，HRP标记的羊抗鸭IgG的最佳稀释度为1：400。
(3)重组蛋白的包被条件
由表6可知，DHAV-MAg基因重组蛋白的最佳包被条件是37℃2h。
表4DHAV-MAg基因重组蛋白抗原包被浓度和一抗血清最佳稀释度
表5酶标二抗的最佳工作浓度
酶标二抗稀释度 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200
阳性 1.094 0.708 0.415 0.239 0.145
阴性 0.285 0.164 0.105 0.078 0.068
P/N 3.836 4.316 3.949 3.051 2.125
表6DHAV-MAg基因重组蛋白包被条件的优化
包被条件 37℃1h转4℃过夜 37℃4h转4℃过夜 4℃过夜 37℃2h
阳性 1.150 1.160 1.209 1.175
阴性 0.276 0.270 0.279 0.256
P/N 4.203 4.436 4.258 4.579
(.4)最佳封闭液的选择
由表7可知，最佳封闭液是5％的明胶。
表7最佳封闭液的选择
封闭液 1％BSA 5％BSA 1％明胶 5％明胶 1％脱脂奶粉 5％脱脂奶粉
阳性 1.124 1.135 0.977 1.094 0.992 0.977
阴性 0.322 0.311 0.229 0.256 0.244 0.229
P/N 3.494 3.653 3.860 4.269 4.066 4.280
(5)最佳封闭时间
由表8可知，最佳封闭时间是2h。
表8封闭时间的优化
封闭时间 0.5h 1h 1.5h 2h
阳性 1.314 1.282 1.290 1.277
阴性 0.346 0.344 0.332 0.306
P/N 3.802 3.727 3.883 4.183
(6)显色时间的选择
由表9可知，最佳显色时间是5min。
表9最佳显色时间的优化
显色时间 5min 10min 15min 20min 25min 30min
阳性 1.021 1.182 1.280 1.236 1.261 1.243
阴性 0.186 0.260 0.302 0.320 0.341 0.328
P/N 5.522 4.548 4.233 3.860 3.703 3.794
2、阳性阈值的确定
由表10可知，取平均值+3×标准差作为阳性阈值，则阳性阈值为0.097+3×0.074＝0.317。
表1056份阴性血清的OD450nm/OD630nm值
0.137 0.105 0.067 0.075 0.080 0.063 0.087 0.137
0.064 0.053 0.049 0.247 0.074 0.095 0.041 0.064
0.103 0.157 0.039 0.090 0.058 0.027 0.085 0.103
0.076 0.118 0.114 0.068 0.082 0.326 0.090 0.076
0.065 0.059 0.066 0.155 0.074 0.057 0.044 0.065
0.074 0.233 0.086 0.208 0.047 0.035 0.044 0.074
0.078 0.064 0.068 0.039 0.035 0.038 0.026 0.078
3、特异性实验
(1)特异性交叉实验
由表11得知，基于DHAV-MAg基因重组蛋白间接ELISA方法检测DHAV-1阳性血清呈强阳性反应，与禽类其他病原的阳性血清呈现阴性反应，即OD值均低于阳性阈值，说明该方法均具有良好的特异性。
表11DHAV-MAg基因重组蛋白ELISA方法特异性检测
(2)特异性阻断实验
由表12得知，该间接ELISA方法检测得到DHAV-MAg基因重组蛋白对DHAV-1阳性血清的阻断率为73.6％。表明重组蛋白能够与DHAV-1阳性血清较好的特异性结合。
表12DHAV-MAg基因重组蛋白阻断实验
阻断前 1.068
阻断后 0.282
阻断率 73.6％
4、变异系数
结果见表13，批内变异系数在0.01％-0.16％，批间变异系数在0.02％-0.20％，均小于10％。
表13批内及批间变异系数
5、基于DHAV-MAg基因重组蛋白的间接ELISA方法的应用及与基于DHAV-1的间接ELISA方法符合率的检测
由表14可知，基于DHAV-MAg基因重组蛋白的ELISA方法可用于鸭血清中DHAV-1抗体的检测，与基于DHAV-1的ELISA方法的符合率为87.8％。
表14基于DHAV-MAg基因重组蛋白的ELISA方法与基于DHAV-1的ELISA方法符合率的
检测
实施例5DHAV-MAg基因重组蛋白对雏鸭的免疫原性的检测实验
实验方法：
1、实验动物分组及免疫
按照表15进行分组为DHAV-MAg基因重组蛋白组和空白对照组，按照表中的免疫剂量和途径进行免疫。
表15动物分组及免疫
2、试验鸭血样采集
2组雏鸭分别于免疫前及免疫后3d、7d、15d和21d颈静脉采血，1ml/只，一半血液用肝素钠抗凝管抗凝用于T淋巴细胞亚群的检测，一半血液无需抗凝，用于体液免疫水平和细胞因子的检测。
3、免疫细胞因子的检测
按照细胞因子ELISA试剂盒说明书测定CD4、CD8、IL-4和INF-γ4种免疫细胞因子的水平。
4、雏鸭抗体效价检测
按照实施例4建立的基于DHAV-MAg的ELISA方法来检测血清样品的抗体效价。
实验结果：
1、抗体水平的检测
基于DHAV-MAg基因重组蛋白ELISA方法检测不同时间点免疫鸭血清抗体的结果见图15，与对照组相比，DHAV-MAg基因重组蛋白免疫组抗体水平在免疫15d达到高峰且与对照组差异极显著；免疫后21d下降但仍维持一定水平，而对照组21d时未检测到抗体。
2、免疫细胞因子的水平检测
细胞因子检测结果见图16，DHAV-MAg基因重组蛋白免疫前，T淋巴细胞亚群和细胞因子的含量均较高，免疫后3d大幅度下降，7d又有不同程度的升高。
根据生物信息学分析，本发明的DHAV-MAg基因具有较好的抗原性，对DHAV-MAg基因的原核表达以对后续功能的研究显得非常有意义。DHAV-MAg基因，是根据生物信息学分析预测的抗原表位比较丰富的区域来进行截取的，这样可能使病毒的抗原决定簇暴露，更容易刺激动物机体产生较强的特异性免疫。
根据兔抗DHAV-MAg蛋白血清具有中和活性，本发明的DHAV-MAg基因重组蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生中和抗体。本发明的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白应用于作为检测鸭病毒性肝炎抗体的检测试剂，DHAV-MAg基因重组蛋白可作为鸭病毒性肝炎的基因工程亚单位疫苗。DHAV-MAg基因重组蛋白还可在用于检测鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒中使用，所述试剂盒还包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白作为抗原的包被浓度为1.67μg/ml，最佳包被条件为37℃2h，血清稀释度为1：80，HRP标记的羊抗鸭IgG的释度为1：400，封闭液为5％的明胶，封闭时间为2h，显色时间为5min。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (10)

1.一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其DNA序列如SEQIDNO:2所示。
2.一种权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段克隆：分析确定鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因及酶切位点，根据Genbank登录号为JQ316452.1的DHAV-1X株全基因组序列，设计扩增鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段的特异性引物，同时在上下游引物的5’端分别添加上BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，提取鸭肝炎病毒RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段；
步骤二：构建重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg：将鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆得到pMD18-T/DHAV-MAg，分别培养含重组质粒pMD18-T/DHAV-MAg和表达质粒pGEX-4T-1的菌株，提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切，分析、回收、纯化后，将得到带有粘性末端的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段与双酶切处理过表达载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物进行转化和鉴定；
步骤三：制备鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选，将筛选后的含重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg的菌株经培养诱导表达得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白粗品；将重组蛋白粗品鉴定、纯化后，得到纯化的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述特异性引物为：
上游引物P1：5’GGATCCACAACTACACAGACAATACT3’，
下游引物P2：5’CTCGAGGCCTAACACAATGACACAGAT3’。
4.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤一中分析确定的方法为：对鸭肝炎病毒多聚蛋白进行生物信息学分析，选择抗原区域密集的多聚蛋白区域为DHAV-MAg基因。
5.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆的方法为：将所述步骤一获得的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行纯化回收，纯化产物末端加A，与pMD18-T载体连接得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，将得到的pMD18-T/DHAV-MAg进行酶切鉴定。
6.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的连接反应体系为，带有粘性末端的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段5.5μl，表达载体pGEX-4T-12μl，2×T4DNALigaseMix7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。
7.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的诱导表达条件为：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到宿主菌BL21中，0.4mmol/LIPTG、37℃诱导12h；所述步骤三中纯化方法为切胶纯化。
8.权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白应用于作为检测鸭病毒性肝炎抗体的检测试剂。
9.一种用于检测鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白，鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白作为抗原的包被浓度为1.67μg/ml，最佳包被条件为37℃2h，血清稀释度为1：80，HRP标记的羊抗鸭IgG的稀释度为1：400，封闭液为5％的明胶，封闭时间为2h，显色时间为5min。
10.权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白，其特征在于，应用于作为鸭病毒性肝炎的基因工程亚单位疫苗。
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