CN105326848A - 一种鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途。鼠李糖脂作为一种生物表面活性剂，可选择性杀死导致纤维化的肌成纤维细胞，从而抑制组织或器官的纤维化。采用鼠李糖脂制备的制剂作用于纤维化动物模型，能显著减缓纤维化进程，协助器官修复。此外，含鼠李糖脂的外敷药膏能抑制烧伤病人在皮肤愈合中出现的皮肤纤维化。该鼠李糖脂新用途奠定了其开发成为新型抗纤维化药物的基础。

Description

一种鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途

技术领域

本发明属于表面化学和医学的交叉领域，涉及一种鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途。

背景技术

鼠李糖脂是一种由假单胞菌属种(Pseudomonasspp)产生的糖脂类生物表面活性剂，由鼠李糖基与β-羟基脂肪酸以共价键的形式组成，其分子结构如图1所示。

鼠李糖脂具有诸多的应用。如在石油工业中，鼠李糖脂可用于原油回收，原油输送以及三次采油等。在环境修复领域，鼠李糖脂的应用研究包括螯合重金属离子和降解难溶有机物等。在化妆品工业中，鼠李糖脂被用作驱虫剂、抗酸剂、抗头皮屑洗涤剂、隐形眼镜溶液、除臭剂和牙膏等。在食品工业中，鼠李糖脂可作为食品添加剂。在农业领域，鼠李糖脂的应用包括作为农药助剂以及植物抗菌剂。

近年来，鼠李糖脂的生理和药理活性也被逐渐发现。在皮炎病的治疗中，有研究者以四种皮炎患者为实验对象，给予添加1％(w/v)鼠李糖脂的软膏剂治疗，外敷两周后其皮炎症状消失。在皮肤伤口愈合方面，鼠李糖脂也显示出了良好的效果。在临床实验中，静脉曲张性溃疡、慢性褥疮等病人，在给予1％(w/v)或者0.1％(w/v)的鼠李糖脂软膏剂治疗后，都能在一个月左右修复皮肤表面溃疡。GoranPiljac等将鼠李糖脂在慢性皮肤病方面的应用申请了专利。对于烫伤、放射烧伤的大鼠或人，鼠李糖脂可以加速伤口愈合(一个月左右)，而不加鼠李糖脂组则需要一个半月的更长时间。这些有关鼠李糖脂在治疗真菌感染或促伤口愈合的有益效果主要体现于其强的抑制细菌、真菌的生长，即俗称抗炎作用。对于鼠李糖脂的安全性，美国环境保护局(USEPA)已免除对鼠李糖脂的系列毒性测试，认为无环境毒性，且其报告表明在5g/kg的高口服给药剂量下，鼠李糖脂无大鼠毒性。

组织或器官纤维化是一种阶段性病理状态的总称，可导致产生系统性硬化、特发性肺纤维化、肝硬化、进展性肾病、心血管纤维化等。其病因复杂，且几乎涉及到全身的各个部位。然而，至今纤维化的治疗手段非常有限，器官移植是治疗纤维化晚期的唯一有效方法，该方法受器官供体严重不足的限制，另外高昂的治疗费用以及并发症也成为该治疗手段的桎梏。至今，已进入临床的抗纤维化药物主要体现在预防纤维化(阻断或减弱肌成纤维细胞)，而不能对已发生的纤维化组织或器官进行逆转。目前，广为接受的是，纤维化形成过程归因于肌成纤维细胞(myofibroblast)在组织与器官修复中大量地持续性存在。肌成纤维细胞一方面大量合成胶原等胞外基质，另一方面合成和分泌细胞因子，促实质细胞凋亡而加速自身分化、增殖，加剧纤维化程度。研究表明，肌成纤维细胞兼具成纤维细胞和平滑肌细胞的结构和功能特征，能特征性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，具有很强的合成分泌胶原蛋白能力和收缩特性。肌成纤维细胞主要由四种细胞(成纤维细胞、骨髓间质干细胞、内皮细胞和上皮细胞)在TGF-β1等细胞因子的存在下诱导转化而成。

至今为止，尚未见鼠李糖脂特异性抑制肌成纤维细胞的报道，相应地未见鼠李糖脂曾用作抗纤维化药物。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途。

本发明是通过以下技术方案来实现的：一种鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途。

进一步地，所述抗纤维化药物制剂通过以下方法制备得到：将鼠李糖脂与助剂混合均匀后，制备得到抗纤维化药物制剂，鼠李糖脂在抗纤维化药物制剂中的浓度为10-2000mg/kg，所述助剂由无菌水、凡士林、淀粉中的一种或多种按照任意配比混合组成。

进一步地，所述鼠李糖脂的作用浓度为10-2000mg/kg，作用次数为1-100次，作用时间间隔为2小时-24小时。

本发明的有益效果是：本申请发明人通过大量研究发现，鼠李糖脂还具有本选择性杀死肌成纤维细胞的独特性质。基于这一性质，本发明将其开发用于抗细胞、组织或器官纤维化的药物制剂，该制剂具有抗纤维化的作用，可缓解晚期纤维化，阻断纤维化进程，从而帮助器官自主修复。

附图说明

图1为双鼠李糖脂(A,B)和单鼠李糖脂(C,D)的化学结构式示意图；

图2为双鼠李糖脂对A549及其诱导肌成纤维细胞的不同细胞毒性示意图；

图3为双鼠李糖脂选择性杀死肌成纤维细胞，图中R0、R20、R30分别代表双鼠李糖脂浓度为0mg/L、20mg/L、30mg/L。

具体实施方式

本发明公开鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途。抗纤维化药物制剂的制备方法为：将鼠李糖脂与助剂混合均匀后成为抗纤维化药物制剂，其中，鼠李糖脂的浓度为10-2000mg/kg，所述助剂由无菌水、凡士林、淀粉中的一种或多种按照任意配比组成。制剂形式为喷雾剂、外敷药膏、静脉注射剂或口服胶囊；该制剂可作用于纤维化器官，包括皮肤、肝脏、肺脏、心脏、肾脏和角膜等；根据需要，鼠李糖脂的作用浓度可以为10-2000mg/kg，即每千克人体或动物体需要10-2000mg的鼠李糖脂，作用次数为1-100次，作用时间间隔为2小时-24小时。

下面结合实施例对本发明所述的应用做进一步说明。

实施例1：双鼠李糖脂对肺上皮细胞经TGF-β1诱导产生的肌成纤维细胞具有特异性的细胞毒性。

在肺上皮细胞A549的无血清悬浮培养(所用培养基为DMEM低糖培养基，含L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL)中，采用TGF-β1诱导生成肌成纤维细胞，该细胞经荧光免疫染色以及蛋白印迹法证明表达特征的α-SMA蛋白。将所得到的肌成纤维细胞与肺上皮成纤维细胞加入含10mg/Kg双鼠李糖脂的培养基中，采用显微镜观察这两种细胞在24h内的形态变化，如图2所示，肺上皮A549细胞在此期间未表面出任何形态变异，而肌成纤维细胞在10h就出现膜泡，说明其细胞质膜已完全脱离富含肌动蛋白的皮层细胞骨架。而在18h，肌成纤维细胞因细胞膜破裂、胞质发生外泄而死亡。这说明双鼠李糖脂具有选择性杀死肌成纤维细胞作用。

实施例2：单鼠李糖脂对人成纤维细胞及其诱导的肌成纤维细胞具有特异性的细胞毒性

从包皮人成纤维细胞以及其转化成功的肌成纤维细胞以5×10⁴cells/mL的密度接种于24孔板中，待细胞贴壁后将培养基更换为0.1％FBS含不同浓度单鼠李糖脂的培养基进行处理24h后采用乳酸脱氢酶酶活(LDH)代表细胞活性。收集鼠李糖脂处理过的培养基测定胞外LDH值，并用PBS洗涤培养板，然后采用曲拉通X-100破胞后收集胞内溶液测定胞内LDH值。采用试剂盒分别测定胞外和胞内的LDH值，LDH泄漏率通过计算培养基中的LDH占胞内胞外总LDH的百分比获得。再根据LDH泄漏率随鼠李糖脂的变化曲线，计算细胞出现10％死亡率的单鼠李糖脂浓度(即IC10)，结果如表1所示。

表1

细胞类型	呈10％致死率的浓度(IC10，mg/L)
		成纤维细胞	25.0
肌成纤维细胞	8.5

另外，肌成纤维细胞拥有较强的胶原分泌能力从而使胞外基质积累，所以又考察30mg/L双鼠李糖脂对细胞分泌胶原能力的影响。培养基中胶原分泌量采用常规试剂盒检测。未经鼠李糖脂处理，转化后得到的肌成纤维细胞分泌胶原的能力明显强于成纤维细胞，前者是后者的三倍左右。而经过30mg/L的双鼠李糖脂处理，肌成纤维细胞的胶原分泌量下降了60％。

实施例3：双鼠李糖脂抑制肌成纤维细胞对胶原凝胶的收缩功能

同实施2，成纤维细胞经诱导转化成肌成纤维细胞。两种细胞分别采用胶原凝胶(1mg/mL)进行包埋培养，考察含双鼠李糖脂0、10、30mg/kg的培养基进行培养，并观察2天培养后胶原的收缩能力。结果发现，未经鼠李糖脂作用，肌成纤维细胞收缩能力明显高于成纤维细胞，胶原凝胶块收缩率从17％上升到35％左右。而在10和30mg/kg鼠李糖脂作用后，成纤维细胞的胶原收缩能力不受影响，但肌成纤维细胞的胶原收缩比率从35％下降至22％，接近成纤维细胞凝胶块收缩比率。

实施例4：双鼠李糖脂选择性杀死肌成纤维细胞

在单层贴壁的成纤维细胞培养中，采用TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞生成肌成纤维细胞。将肌成纤维细胞与成纤维细胞混合培养，采用20mg/L和30mg/L的双鼠李糖脂处理混合细胞24h，结果发现，20mg/L的双鼠李糖脂仅杀死肌成纤维细胞，并不影响成纤维细胞活率。30mg/L的双鼠李糖脂杀死了50％以上的肌成纤维细胞，且对成纤维细胞的毒性不足10％。说明双鼠李糖脂具有选择性杀死肌成纤维细胞作用。

实施例5：鼠李糖脂喷雾逆转肺纤维化

采用博莱霉素制备肺纤维化小鼠模型。对小鼠进行鼠李糖脂的喷雾剂(鼠李糖脂浓度1-2000mg/kg，其余为无菌水)处理，鼠李糖脂的作用剂量为0、1、5、10、100、1000、2000mg/kg，每8h给药1次，连续给药7天。以生理盐水组为对照。对小鼠肺部切片染色发现，10-2000mg/kg浓度范围的鼠李糖脂作用组肺泡形态均正常，胶原含量与正常小鼠接近，说明其有效抑制了肺纤维化。而1、5mg/kg浓度范围的鼠李糖脂作用以及生理盐水(不含鼠李糖脂)对照组发生了严重的肺纤维化，肺泡失去结构，大量胶原积累。

实施例6：鼠李糖脂胶囊对肝纤维化的有效作用

采用四氯化碳制备肝纤维化大鼠模型。对大鼠进行鼠李糖脂胶囊(鼠李糖脂浓度1-2000mg/kg，其余为生理盐水)的口服给药，剂量为50、100、1000、2000mg/kg，每8h给药1次，连续给药7天。以生理盐水组为对照。对大鼠肝脏切片染色发现，鼠李糖脂作用组肝小叶组织结构正常，胆管和血管清晰，胶原含量较低，与正常肝脏接近，说明其有效抑制了大鼠肝纤维化。

实施例7：双鼠李糖脂药膏在抗皮肤纤维化的有益作用

48岁手臂局部烫伤病人，烫伤面积10cm²，深度为深II°。选择两块同等面积大小的烫伤伤口，观察双鼠李糖脂在预防纤维化组织形成方面的实际作用效果。给予鼠李糖脂药膏(鼠李糖脂浓度500mg/kg，其余为凡士林)外敷，使得鼠李糖脂药膏覆盖烫伤部位；每12h涂敷1次，连续涂敷14天。烫伤部位愈合，且未留下明显疤痕。而采用只含凡士林辅料(不含任何鼠李糖脂)的对照。

对因烫伤或切割造成的伤口皮肤，其修复过程中经常会产生纤维化硬组织。这种皮肤纤维化的表现是因为在皮肤修复中所产生的肌成纤维细胞进行大量持续性存在和胶原分泌所造成。因此，鼠李糖脂对肌成纤维细胞的选择性毒性可以有助于改善皮肤的无疤痕修复。

实施例8：单鼠李糖脂药膏在抗皮肤纤维化的有益作用

78岁小腿局部烧伤病人，烧伤面积约20cm²，深度为深II°。同实施例6，烫伤病人给予单鼠李糖脂药膏(鼠李糖脂浓度500mg/kg，其余为凡士林)外敷，使得鼠李糖脂药膏覆盖烫伤部位。每12h涂敷1次，连续涂敷21天。烧伤部位愈合，只留下浅疤痕。这也说明单鼠李糖脂也具有抑制肌成纤维细胞的活性作用。

Claims (3)

1.一种鼠李糖脂在制备抗纤维化药物制剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗纤维化药物制剂通过以下方法制备得到：将鼠李糖脂与助剂混合均匀后，制备得到抗纤维化药物制剂，鼠李糖脂在抗纤维化药物制剂中的浓度为10-2000mg/kg，所述助剂由无菌水、凡士林、淀粉中的一种或多种按照任意配比混合组成。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述鼠李糖脂的作用浓度为10-2000mg/kg，作用次数为1-100次，作用时间间隔为2小时-24小时。