CN105326821A - 取代脲类小分子亲环素a抑制剂新型抗癌用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种取代脲类小分子亲环素A(CypA)抑制剂的新用途，具体地说，涉及1-(芴-9-基)-3-(2,6-二羟基苯甲酰)脲在制备治疗癌症药物中应用、及其作为现有治疗癌症药物增效剂的应用。所述化合物可以通过抑制CypA，起到抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖的作用。此外，该化合物与多种化学治疗药物(如依托泊苷、拓扑替康或顺铂等)联用，具有显著的协同作用(可以增强其抗癌效果)。因此，本发明揭示了一种新的治疗非小细胞肺癌的策略。

Description

取代脲类小分子亲环素A抑制剂新型抗癌用途

技术领域

本发明涉及一种取代脲类小分子亲环素A抑制剂的新用途，具体地说，涉及1-(芴-9-基)-3-(2,6-二羟基苯甲酰)脲在制备治疗癌症药物中应用、及其作为现有治疗癌症药物增效剂的应用，属于药物化学和药物治疗学领域。

背景技术

肺癌是对人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织发表的报告，2014年全球预计将产生182万新生肺癌病例，占所有癌症的13.0％；预计全球将有159万人死于肺癌，占所有癌症死亡病例的19.4％。肺癌的早期诊断很困难，通常病人在没有任何症状时，肺癌细胞已经扩散到身体的其他组织。据美国国立癌症研究院(NationalCancerInstitute，NCI)的统计，约有57％的肺癌病人在诊断时已经出现了远端转移，22％的病人癌细胞已经转移的附近的淋巴组织，而仅有15％的病人癌细胞还处于原位。不同的癌症分期对于病人的存活也有较大的影响，出现远端转移的肺癌病人5年生存率仅为4.0％，转移到淋巴组织的肺癌病人5年存活率为26.5％，而肺癌未出现转移的病人有54％可以存活5年。总体来说，肺癌的生存率很低，病人5年的总生存率仅为16.8％。

肺癌主要可以分为非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)和小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)两类，其中前者是肺癌的主要形式，约占所有肺癌的80％。目前治疗肺癌的药物主要分为靶向药物(如激酶抑制剂)和细胞毒性药物(如顺铂)两大类。激酶抑制剂(例如吉非替尼和埃罗替尼)可以有效地治疗非小细胞肺癌。然而激酶抑制剂的使用通常会导致耐药性的产生，这使病人的生存率通常只能延长了几个月。而细胞毒性药物由于对癌细胞和正常细胞缺乏靶向特异性，通常会产生较严重的毒性反应和副作用。因此，开发新的抗肺癌药物及治疗策略显得极为迫切。

发明内容

中国专利文献(CN104844666A)公开了一种小分子的亲环素A(cyclophilinA，CypA)的抑制剂—取代苯甲酰脲类化合物，并揭示了该类取代苯甲酰脲类化合物的一种用途(即所述取代苯甲酰脲类化合物在制备治疗包括移植排斥反应、由移植引起的宿主疾病、自身免疫疾病或HIV-1入侵感染等由CypA介导的疾病药物中的应用)。

然，随着研究的深入，本发明的发明人发现：CN104844666A所公开的化合物(特别是1-(芴-9-基)-3-(2,6-二羟基苯甲酰)脲)不仅在单独给药时对非小细胞肺癌细胞A549具有良好的抑制作用，而且其与DNA拓扑异构酶类抗肿瘤药物或金属铂配合物类抗肿瘤药物联合使用，具有显著的协同作用(可以增强其抗癌效果)。

本发明一个目的在于，揭示取代苯甲酰脲类化合物一种新的用途，即其在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，

其中，所述的取代苯甲酰脲类化合物为1-(芴-9-基)-3-(2,6-二羟基苯甲酰)脲、或其药学上可接受的盐，所述1-(芴-9-基)-3-(2,6-二羟基苯甲酰)脲的结构如式I所示：

或，

式I所示化合物、或其药学上可接受的盐在制备非小细胞肺癌细胞A549抑制剂中的应用。

本发明另一个目的在于，揭示取代苯甲酰脲类化合物另一种新的用途，即作为DNA拓扑异构酶类抗肿瘤药物或金属铂配合物类抗肿瘤药物的增效剂，

或，

式I所示化合物(下文简记为“HL001”)、或其药学上可接受的盐在制备作为DNA拓扑异构酶类抗肿瘤药物或金属铂配合物类抗肿瘤药物的增效剂中的应用。

其中，所述DNA拓扑异构酶类抗肿瘤药物或金属铂配合物类抗肿瘤药物优选II型拓扑异构酶抑制剂(依托泊苷(Etoposide))、I型拓扑异构酶抑制剂(拓扑替康(Topotecan))或顺铂(Cisplatin)。

附图说明

图1HL001与依托泊苷联用协同抑制A549细胞增殖的药物联用指数；

图2HL001与拓扑替康联用协同抑制A549细胞增殖的药物联用指数；

图3HL001与顺铂联用协同抑制A549细胞增殖的药物联用指数；

图4HL001与依托泊苷或拓扑替康联用的克隆形成实验结果；

图5HL001与顺铂联用的克隆形成实验结果；

图6HL001单独抑制裸鼠体内A549皮下异种移植肿瘤的生长效果；

图7HL001给药期间老鼠体重变化曲线；

图8依托泊苷和拓扑替康分别单独抑制裸鼠体内A549皮下异种移植肿瘤生长的效果，其中，左：依托泊苷；右：拓扑替康；

图9依托泊苷和拓扑替康单独给药期间老鼠体重变化曲线，其中，左：依托泊苷；右：拓扑替康；

图10HL001与依托泊苷或拓扑替康联用协同抑制裸鼠体内A549皮下异种移植肿瘤生长的效果；

图11HL001与依托泊苷或拓扑替康联合给药期间老鼠体重变化曲线；

图12代表性的裸鼠肺部肿瘤生长的生物发光2D示意图；

图13代表性的裸鼠肺部肿瘤生长的生物发光3D示意图；

图14各组裸鼠肺部肿瘤示意图；

图15HL001与顺铂联合给药期间裸鼠体重变化曲线。

具体实施方式

在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明的保护范围。实施例中的统计分析，细胞实验至少重复三次，动物实验采取每组六只老鼠，数据以平均值±标准差的形式表示，各组数据间的显著性差异用Student’sTtest进行比较，显著程度为：P<0.05(*)，P<0.01(**)，P<0.001(***)。

实施例1

本发明化合物HL001与依托泊苷、拓扑替康及顺铂联用在体外抑制A549细胞增殖活性的测定

(1)细胞培养

细胞株A549培养在RPMI-1640培养基中，培养基中均添加10％的胎牛血清以及100unit/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞培养在37^○C，含5％CO₂的潮湿环境中。

(2)MTT法测试HL001、依托泊苷、拓扑替康以及顺铂抑制A549细胞增殖的IC₅₀值

将消化好的细胞进行细胞计数，以特定细胞数加至96孔板(8000个/孔)，每孔体积100μl。12小时后，分别加入含有HL001、依托泊苷、拓扑替康以及顺铂的培养基100μl，以加入等量DMSO培养基的孔作为对照，每个样品设置3个平行。药物孵育48小时后，向96孔板中加入20μlMTT溶液(5mg/ml，用PBS配置)，37^○C孵育4个小时。孵育结束后，吸出上清液，加入150μlDMSO后震荡。待结晶物溶解后，在酶标仪上读取570nm处的吸收值。经过测试，对于A549非小细胞肺癌细胞，依托泊苷的IC₅₀值为16.74μM，拓扑替康的IC₅₀值为1.72μM，顺铂的IC₅₀值为52.15μM，HL001对于A549细胞的IC₅₀值为7.22μM。

(3)MTT细胞增殖测试药物联用效果

药物联用测试采取固定比率法。根据上一步所测数据可以得出，HL001与依托泊苷、拓扑替康、顺铂的IC₅₀比值分别约为1:2，4:1，1:7。将HL001与三种化疗药物IC₅₀的不同比值，分别乘以固定化的标准药物比例(1:4、2:3、3:2、4:1)，确定一系列药物联用的配比，得到HL001-依托泊苷的药物配比为：1:8、1:3、3:4、2:1；HL001-拓扑替康的药物配比为：1:1、8:3、6:1、16:1而HL001-顺铂药物配比为：1:28、2:21、3:14、4:7。最终根据这些配比稀释不同浓度的联用化合物。

将所配的联用化合物与A549细胞孵育48小时后，用前述MTT的方法分析细胞的生存率。根据不同组别化合物配比的不同，分别算出其IC₅₀值并计算在此配比下的药物联用指数(combinationindex，CI)，计算公式如下：

$CI=\frac{d1}{D1}+\frac{d2}{D2}$

其中D1和D2分别代表化合物1和化合物2单独作用于细胞，抑制50％细胞增殖的药物浓度(IC₅₀)，而d1和d2则分别代表在药物联用时化合物1和化合物2抑制50％细胞增殖的药物浓度。药物联用指数CI值小于1表明两种药物具有协同效果，等于1表明叠加效果，而大于1表明拮抗效果。

(4)HL001与三种化学治疗药物连用的测试结果

通过对结果的分析和处理，可以得出HL001与三种化学治疗药物联合使用均可以协同抑制A549细胞的增殖，其中HL001-依托泊苷的联用指数为0.318(图1)，HL001-拓扑替康的联用指数为0.324(图2)，HL001-顺铂的联用指数为0.385(图3)。三种联用方式都具有很强的协同效果。

实施例2

克隆形成实验测定本发明化合物HL001与依托泊苷、拓扑替康及顺铂联用在体外抑制A549细胞增殖的活性

用胰酶将A549细胞消化后，制备细胞悬液并进行细胞计数。以每孔3000个细胞的密度加至六孔板中，并补加2ml的含10％FBS的1640培养基。12小时以后，弃掉培养基并更换含有药物的培养基，分别包括对照组(等量)、HL001(0.5μM)、依托泊苷(0.5μM)、拓扑替康(0.1μM)、顺铂(4μM)、HL001-依托泊苷(0.5μMHL001+0.5μM依托泊苷)、HL001-拓扑替康(0.5μMHL001+0.1μM拓扑替康)以及HL001-顺铂(0.5μMHL001+4μM顺铂)后，置于培养箱连续培养7天，每隔2天更换一次培养基。7天后，弃掉上清，用PBS漂洗三次，然后用4％的多聚甲醛在室温固定30分钟。固定结束后，用PBS漂洗三次，然后加入终浓度为0.1％的结晶紫溶液，室温染色30分钟。然后弃掉染色液，用PBS漂洗干净后置于烘箱烘干，利用扫描仪进行图像获取。

由图4～5可以看出，该克隆形成实验的结果与MTT实验的结果一致，也表明HL001与这三种化学治疗药物的联用均可以协同抑制A549细胞的细胞增殖。

实施例3

本发明化合物HL001与依托泊苷、拓扑替康联用抑制裸鼠皮下成瘤增殖活性的测定

将人非小细胞肺癌A549细胞用胰酶消化后，用PBS重悬细胞，进行细胞计数，然后注射至5周龄BALB/c裸鼠右后肢背部皮下，每只老鼠注射体积为200μl，注射细胞数为6×10⁶个。皮下瘤体积由游标卡尺测定，平均每三天测试一次。计算公式为：

V＝1/2(L×W²)

其中，V代表肿瘤体积，单位mm³；L代表肿瘤长度，单位为mm；W代表肿瘤宽度，单位为mm。

当肿瘤体积到达150-200mm³时，将裸鼠随机分组并进行给药处理，药物使用溶为0.5％CMC-Na，采取灌胃口服的方式，持续给药40天。测试单独化合物效果时，裸鼠分组分别为对照组(每天给等体积溶剂CMC-Na)、HL001(每天给药，浓度为20mg/kg、60mg/kg、120mg/kg)、依托泊苷(每天给药，浓度为5mg/kg、15mg/kg、45mg/kg)、拓扑替康(每三天给一次药，浓度为0.5mg/kg、1.5mg/kg、4.5mg/kg)。测试化合物联用效果时，裸鼠分组为对照组(每天给等体积溶剂CMC-Na)、HL001(每天给药，浓度为20mg/kg)、依托泊苷(每天给药，浓度为10mg/kg)、拓扑替康(每三天给一次药，浓度为0.5mg/kg)、HL001+依托泊苷(每天给药，浓度为HL00120mg/kg+依托泊苷10mg/kg)和HL001+拓扑替康(HL001每天给药，浓度为20mg/kg；拓扑替康每三天给一次药，浓度为0.5mg/kg)。每组6只老鼠，每三天对肿瘤体积进行测量，每7天记录一次老鼠的体重值。

通过每三天记录肿瘤变化，由图6可以表明HL001可以有效抑制裸鼠体内A549皮下异种移植肿瘤的生长。同时通过每七天记录老鼠的体重，由图7可以表明在给药期间各组老鼠的体重并没有明显差异，说明HL001在此剂量范围内是安全的。

通过每三天记录肿瘤变化，由图8可以表明依托泊苷和拓扑替康均可有效抑制裸鼠体内A549皮下异种移植肿瘤的生长。同时通过每七天记录老鼠的体重，由图9可以表明在依托泊苷给药期间各组老鼠的体重并没有明显差异，说明依托泊苷在此剂量范围内是安全的。在拓扑替康给药期间，4.5mg/kg给药组老鼠体重略有下降，说明拓扑替康在此剂量下存在一定的毒性，而0.5mg/kg给药组和1.5mg/kg给药组老鼠体重变化没有明显差异，说明拓扑替康在每三天0.5mg/kg和1.5mg/kg剂量下是安全的。

通过每三天跟踪记录肿瘤大小变化，由图10可以表明HL001与依托泊苷或拓扑替康联用可以协同抑制裸鼠体内A549皮下异种移植肿瘤的生长。同时通过每七天记录老鼠的体重，由图11可以表明在联合给药期间各组老鼠的体重并没有明显差异，说明HL001与依托泊苷或拓扑替康联用在此剂量范围内是安全的。

实施例4

HL001与顺铂联用抑制裸鼠原位成瘤增殖活性的测定

(1)慢病毒包装和转染

肿瘤在裸鼠肺部生长时，从外表无法观察，因此需要对A549细胞进行标记。标记采取慢病毒感染法，慢病毒包装主要在HEK-293T细胞中进行。HEK-293T细胞培养于DMEM培养基中，添加10％的胎牛血清以及100unit/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞培养在37^○C，含5％CO₂的潮湿环境中。将293T细胞传代值60mm培养皿中，使其密度达到90％即可进行转染。首先取500μl不含血清和抗生素的DMEM培养基，加入质粒(psPAX22μg，pMD2.G1μg，病毒质粒GFP-luc2μg，总计5μg)混匀，然后加入转染试剂lipofectamine20008μl，混匀。室温放置20min后，加至细胞中。36个小时后，开始收集细胞培养液作为病毒液，并添加新鲜的DMEM培养基。后续病毒液可分别在转染后60小时、84小时和108个小时进行收集，共可以收集四次。

将A549细胞传代至60mm培养皿，加入一次收集的病毒液和polybrene(终浓度8μg/ml)，37℃继续培养。24小时后，弃掉培养基，补加新鲜培养基并加入嘌呤霉素至终浓度2μg/ml进行筛选，筛选得到的即是包含目标质粒的细胞，筛选过程约持续1周。

(2)裸鼠原位成瘤实验

裸鼠原位成瘤实验需要使用麻醉剂，我们应用的麻醉剂为阿佛丁，其配置方法为：称取2,2,2-三溴乙醇0.625g并量取2-甲基-2-丁醇1.2ml，加入50ml双蒸水中，45℃避光摇动过夜。混匀后的阿佛丁溶液避光保存于4℃。阿佛丁的使用剂量为老鼠体重每5g注射100μl。实验开始前，需要配置好麻醉剂，将手术器械灭菌，将基质胶放于4℃化冻。

将慢病毒转染过GFP-luc的A549细胞用胰酶消化后，用无血清培养基重悬细胞，进行细胞计数，并按1:1的比例将细胞悬液与基质胶混合。细胞注射量为每只老鼠1×10⁶个细胞。实验中先注射350μl阿佛丁麻醉裸鼠，麻醉起效时间约为5-10分钟，麻醉时间约为20分钟。将麻醉后的裸鼠固定，用剪刀在其右侧腋下偏后的位置剪出长约8mm的缺口，注意只将表皮和肌肉层剪开即可，不要剪到内脏。然后从第四和第五根肋骨处进针，针头进入约10mm后注射100μl细胞基质胶悬液，然后停留约30秒待基质胶凝固后拔出针头，并将裸鼠的伤口缝合，缝合视伤口长度缝1-2针。缝合结束后，用75％乙醇对裸鼠的伤口进行消毒，然后置于干净的笼子中，笼子用白炽灯照射以维持裸鼠的体温。待裸鼠苏醒后将其正常饲养。

大约一周后，利用活体成像观察老鼠肺部的癌细胞是否存活。由于注射的癌细胞带有荧光素酶的标记，可以向裸鼠注射荧光素酶底物D-luciferin(每只2mg)来观察老鼠肺部是否有亮光产生来判断癌细胞是否存活。选取肺部癌细胞存活的裸鼠进行随机分组，并进行下一步的给药实验。口服给药溶剂为CMC-Na，腹腔注射给药溶解为生理盐水。为测试化合物联用效果，裸鼠分组为对照组(每天口服给等体积溶剂CMC-Na)、HL001(每天口服给药浓度为20mg/kg)、顺铂(每七天腹腔注射给一次药，浓度为1mg/kg)和HL001+顺铂(HL001每天口服给药，浓度为20mg/kg；顺铂每七天腹腔注射给一次药，浓度为1mg/kg)。每组6只老鼠，每10天利用活体成像对裸鼠肺部肿瘤进行观测，每7天记录一次老鼠的体重值。

从图12和图13中可以观察到与对照组相比，单药HL001(20mg/kg)和顺铂(1mg/kg)在此剂量下抑制肿瘤细胞生长的作用很有限，肿瘤细胞已经出现扩散现象；而二者联用后可以很好地协同抑制肿瘤细胞生长，且没有观察到扩散现象的产生。

裸鼠处死后，将各组裸鼠的肺取出以确认HL001与顺铂联用的作用效果。在图14中，黑色箭头标识出的白色半透明组织即为肿瘤。从图中可以看到，对照组裸鼠肺部肿瘤生长很快，肿瘤组织成片出现；单药HL001(20mg/kg)和顺铂(1mg/kg)在此剂量下抑制肿瘤细胞生长的作用很有限，肿瘤细胞出现了一定程度的增殖；而二者联用后可以产生很好的协同效果，肿瘤生长在很大程度被抑制(图14)。在联合给药期间各组裸鼠的体重并没有明显差异(图15)，说明HL001和顺铂联用在此剂量范围内是安全的。

本发明的取代脲类化合物HL001分子结构简单，抗肿瘤机制明确，不但在MTT实验中对非小细胞肺癌A549细胞显示出较强的抑制活性，而且与依托泊苷、拓扑替康和顺铂等多种化学治疗药物联用均显示出了良好的协同作用和安全性。因此，本发明不仅有望开发出新型的单一用药方式的抗非小细胞肺癌药物，而且还可以开发成与现有抗病毒药物组合给药方式的抗非小细胞肺癌的治疗策略。

Claims (6)

1.一种取代苯甲酰脲类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用，

其中，所述的取代苯甲酰脲类化合物为如式I所示化合物、或其药学上可接受的盐。

2.一种取代苯甲酰脲类化合物在制备非小细胞肺癌细胞A549抑制剂中的应用，

其中，所述的取代苯甲酰脲类化合物为如式I所示化合物、或其药学上可接受的盐。

3.一种取代苯甲酰脲类化合物在制备作为DNA拓扑异构酶类抗肿瘤药物或金属铂配合物类抗肿瘤药物的增效剂中的应用，

其中，所述的取代苯甲酰脲类化合物为如式I所示化合物、或其药学上可接受的盐。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其中所述金属铂配合物类抗肿瘤药物为顺铂(Cisplatin)。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其中所述DNA拓扑异构酶类抗肿瘤药物为I型或II型拓扑异构酶抑制剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，其中所述DNA拓扑异构酶类抗肿瘤药物为拓扑替康(Topotecan)或依托泊苷(Etoposide)。